BAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu. Bahan Tanaman dan Media

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari 2010 sampai dengan November Bahan Tanaman dan Media Penelitian ini menggunakan tiga jenis eksplan yaitu: pucuk, pucuk dengan kotiledon, dan kotiledon dari kecambah kenaf (Hibiscus cannabinus L.) varietas KR 14 (Karang Ploso 14). Benih kenaf diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Tembakau dan Serat (Balittas) Malang. Eksplan berasal dari benih kenaf umur hari dan dikecambahkan secara in vitro pada tanggal 6 Juli 2010 dengan menggunakan media preconditioning MS ½ kemudian diinokulasi ke media perlakuan pada tanggal 12 Juli Gambar 2 menunjukkan sumber eksplan yang digunakan dalam kultur kenaf diperoleh dari kecambah umur 7 hari media MS setengah konsentrasi tanpa zat pengatur tumbuh. Bagian kecambah yang digunakan adalah pucuk pucuk ukuran 0.5 cm, pucuk dengan kotiledon dengan panjang cm, dan kotiledon kenaf yang terlebih dahulu dipotong agar memberikan respon lebih cepat. Eksplan kotiledon ditanam secara horizontal sehingga kontak dengan media kultur lebih luas. Gambar 2. Planlet Kenaf yang Berumur 7 Hari pada Media Preconditioning MS ½ Sebagai Sumber Eksplan

2 13 Media dasar yang digunakan adalah MS (Murashige dan Skoog), dengan tambahan zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah 2.4-D (auksin) dan BAP (sitokinin). Bahan pemadat media menggunakan agar-agar, dan gula pasir sebagai sumber karbohidrat. Pengaturan ph menggunakan KOH 1 N dan HCL 1 N pada waktu semua komponen media telah dicampur. Bahan sterilan untuk benih kenaf menggunakan chlorox, Agrept, Dithane, Benlate, Amoxycyline (antibiotik) dan aquades steril dan tisu steril. Bahan sterilan ruang kultur dan alat menggunakan alkohol 70 %. Bahan pengemasan untuk penyimpanan kultur terdiri dari plastik tahan panas dan karet gelang. Bahan lainnya yang diperlukan yaitu: deterjen, korek api, dan spritus. Alat-Alat Alat yang digunakan untuk sterilisasi alat maupun media meliputi autoclave dan oven. Alat untuk membuat media kultur terdiri dari labu takar, gelas piala, gelas ukur, pipet volumetrik, magnetic styrer, pengaduk kaca, botol kultur ukuran kecil, corong, timbangan digital, dan ph meter. Tempat inokulasi kultur dilakukan didalam laminar air flow cabinet (LAFC). Alat-alat diseksi (pinset, gunting, dan scapel), bunsen, cawan petri, dan hand sprayer. Alat untuk penyimpanan terdiri dari botol kultur dan rak yang dilengkapi dengan lampu fluorescent dengan intensitas cahaya 1000 lux. Metodologi Penelitian Penelitian ini terdiri dari 3 percobaan terpisah berdasarkan jenis eksplan yaitu: percobaan I: eksplan pucuk, percobaan II: eksplan pucuk dengan kotiledon, dan percobaan III: eksplan kotiledon. Masing-masing percobaan ini disusun menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan dua faktor. Faktor I adalah zat pengatur tumbuh 2.4-D dengan taraf 0.0, 0.5 dan 1.0 mg/l dan faktor II adalah BAP dengan taraf 0.0, 2.0, 4.0, 8.0, dan 10.0 mg/l. Terdapat 15 kombinasi perlakuan dan setiap kombinasi perlakuan terdiri dari tiga ulangan sehingga terdapat 45 satuan percobaan. Pada eksplan pucuk dan pucuk dengan kotiledon, setiap satuan percobaan terdiri dari empat eksplan sebagai satuan amatan, sehingga terdapat 180 satuan amatan. Pada eksplan kotiledon

3 terdiri dari delapan eksplan sehingga terdapat 360 satuan amatan. Eksplan merupakan unit terkecil percobaan yang diamati. Tabel 3. Kombinasi Perlakuan 2.4-D dan BAP pada Percobaan Proliferasi Tunas Adventif Kenaf BAP (mg/l) A0S0 A0S1 A0S2 A0S3 A0S4 0.5 A1S0 A1S1 A1S2 A1S3 A1S4 1.0 A2S0 A2S1 A2S2 A2S3 A2S4 2.4-D (mg/l) Keterangan : A = 2.4-D (A0 = 0.0 mg/l, A1 = 0.5 mg/l, A2 = 1.0 mg/l) S = BAP (S0 = 0.0 mg/l, S1 = 2.0 mg/l, S2 = 4.0 mg/l, S3 = 8.0 mg/l, S4 = 10.0 mg/l) Model rancangan yang digunakan adalah: Y ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + ijk Keterangan: Y ijk = Hasil pengamatan pada perlakuan 2.4-D konsentrasi ke i, BAP konsentrasi ke j dan ulangan ke k µ = Rataan umum hasil pengamatan untuk setiap satuan percobaan i = Pengaruh pada perlakuan 2.4-D konsentrasi ke i (i = 1, 2, 3) j = Pengaruh pada perlakuan BAP konsentrasi ke j (j = 1, 2, 3, 4, 5) ijk ijk = Pengaruh pada interaksi 2.4-D konsentrasi ke i, BAP konsentrasi ke j = Pengaruh galat pada perlakuan 2.4-D konsentrasi ke i, BAP konsentrasi ke j dan ulangan ke k Analisis statistik terhadap data yang diperoleh dilakukan dengan uji F menggunakan program SAS (Statistical Analysis System). Perlakuan yang berpengaruh nyata pada uji F kemudian diuji lanjut menggunakan metode DMRT (Duncan Multiple Range Test) pada taraf uji 5 %. Persiapan dan Sterilisasi Peralatan Pelaksanaan Penelitian Botol kultur, cawan petri, dan alat tanam dicuci dengan deterjen sampai bersih dan disterilisasi. Sterilisasi menggunakan autoclave pada temperatur 121 ºC, tekanan 17.5 psi (pounds per square inch) selama 60 menit. Pada saat 14

4 15 persiapan inokulasi eksplan, alat-alat diseksi dibuka di Laminar Air Flow Cabinet (LAFC). Pembuatan Larutan Stok Pembuatan larutan stok bertujuan untuk memudahkan pekerjaan menimbang bahan-bahan kimia yang berulang-ulang dalam pembuatan media dan zat pengatur tumbuh. Stok yang dibuat sesuai dengan komposisi media perlakuan MS yang disimpan dalam tabung Erlenmeyer. Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh 2.4-D dilarutkan menggunakan larutan KOH 1 N sedangkan BAP dilarutkan menggunakan HCL 1 N. Zat pengatur tumbuh dibuat sesuai dengan masingmasing taraf percobaan. Selanjutnya ditambahkan air steril sesuai volume yang diinginkan. Larutan stok ini disimpan di tempat yang bertemperatur rendah dan gelap. Komposisi media MS (Murashige dan Skoog) disajikan pada Lampiran 1. Pembuatan Media Kultur Pembuatan media kultur dibuat dengan memipet sejumlah volume tertentu larutan stok media ke dalam labu takar dengan penambahan 2.4-D dan BAP sesuai dengan masing-masing taraf percobaan. Gula dilarutkan sebanyak 30 g/l dengan air steril, kemudian ditambahkan air steril ke dalam larutan sampai tanda tera. Tingkat kemasaman media (ph) dipertahankan pada ph 5.9 sebelum di-autoclave dengan menambahkan HCL 1 N atau KOH 1 N. Agar-agar 7 g/l ditambahkan kedalam media kemudian dimasak sampai mendidih. Media tersebut kemudian dituangkan kedalam botol kultur yang telah disterilisasi sebanyak 25 ml per botol. Volume botol kultur yang digunakan adalah 200 ml. Setelah itu media disterilisasi dengan menggunakan autoclave pada temperatur 121 C dengan tekanan 17.5 psi selama 20 menit. Sterilisasi Biji Sebagai Sumber Eksplan Sterilisasi bahan tanam dimulai dengan pencucian benih kenaf menggunakan aquades. Selanjutnya benih direndam selama 60 menit dalam air panas yang sebelumnya telah ditambah deterjen. Kemudian benih dibilas dengan aquades.

5 16 Sterilisasi di dalam laminar air flow cabinet dimulai dengan membilas benih kenaf sebanyak dua kali dalam aquades steril selama 5 menit untuk tiap pembilasan. Benih kenaf disterilkan dengan menggunakan chlorox 30 % selama menit. Setelah itu benih kenaf dibilas satu kali dalam aquades steril. Prosedur ini diulang dengan menggunakan chlorox 10 % selama 5-10 menit, kemudian dibilas dalam aquades steril satu kali. Selanjutnya benih kenaf direndam dalam larutan 2 g/l Dithane + 2 g/l Agrept + 2 g/l Benlate + Amoxycyline dan diaduk dengan menggunakan shaker selama 60 menit Benih secara aseptik diletakkan di permukaan tisu steril dalam cawan petri. Kenaf yang telah steril ditanam di dalam media MS ½ konsentrasi. Setiap botol kultur ditanami dengan benih kenaf. Setelah semua prosedur tersebut dijalankan, bahan tanam disimpan di dalam ruang kultur untuk perkecambahan. Penanaman eksplan Laminar air flow cabinet yang akan digunakan sebelum penanaman eksplan terlebih dahulu dibersihkan dengan akohol 70 %. Eksplan yang digunakan adalah pucuk, pucuk dengan kotiledon, dan kotiledon. Kecambah yang telah berumur 7 hari dikeluarkan dari kultur dan diletakkan dalam cawan petri steril. Dengan scalpel, bagian pucuk, pucuk dengan kotiledon, dan kotiledon dipotong. Setelah semua media perlakuan dan semua peralatan tanam disiapkan, bahan tanam dapat segera ditanam dibotol kultur. Eksplan pucuk dan pucuk dengan kotiledon, pada setiap botol kultur ditanam 4 eksplan kenaf sedangkan eksplan kotiledon, setiap botol kultur ditanam 8 eksplan. Setelah penanaman, botol kultur diletakkan di ruang kultur. Inkubasi kultur Kultur kenaf untuk semua jenis eksplan tersebut ditumbuhkan di ruang kultur yang ada di laboratorium. Pada ruang kultur terdapat rak-rak kultur dengan sumber cahaya dari lampu flourescens 20 watt untuk menyinari kultur. Suhu ruang diatur 23 ± 2 C.

6 17 Pengamatan Pengamatan dilakukan terhadap beberapa peubah dengan frekuensi pengamatan sekali seminggu selama 16 minggu mulai dari 1 MST-16 MST : 1. Persentase kultur yang terkontaminasi dan penyebab kontaminasi jumlah eksplan kontam % kontaminasi = 100 % jumlah eksplan 2. Persentase kultur yang hidup. % eksplan hidup = jumlah eksplan hidup jumlah total eksplan 100 % 3. Persentase benih berkecambah. % daya berkecambah = jumlah benih berkecambah 100 % jumlah total benih 4. Persentase kultur mengalami proliferasi tunas adventif. 5. Persentase eksplan yang membentuk embrio somatik. 6. Persentase kultur yang membentuk kalus. 7. Waktu terbentuk kalus. 8. Bentuk kalus (friable dan compact).