III. METODE PENELITIAN A.

Transkripsi

1 13 III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Oktober 2015 sampai bulan Februari 2016 yang bertempat di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. B. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat Alat yang digunakan antara lain: autoklaf, Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), oven, lampu bunsen, korek api, hand sprayer, botol kultur, tutup botol, gelas ukur, timbangan analitik, hot plate stirrer, pinset, pisau scapel, ph meter, pipet, gunting, Cutter, karet gelang, petridish, nampan, tissue, plastik wrap, kertas label, alat tulis dan kamera. 2. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu tunas pucuk tanaman sawo lokal Manyaran, zat pengatur tumbuh (NAA (Naftalen Asam Asetat) dan BAP (Benzil Amino Purin)), alkohol, aquades, gula pasir, agar, clorox, spirtus, bakterisida, fungisida, vitamin c, media MS (Murashige dan Skoog) dan WPM (Woody Plant Medium). 13

2 14 C. Perancangan Penelitian Penelitian dilaksanakan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan dua faktor perlakuan. Faktor pertama adalah media yang digunakan dan faktor kedua adalah konsentrasi NAA. A. Macam Media : M1 : Media MS M2 : Media WPM B. Konsentrasi NAA N0 : NAA 0 ppm N1 : NAA 0,5 ppm N2 : NAA 1 ppm N3 : NAA 1,5 ppm Sehingga diperoleh 8 kombinasi perlakuan dan diulang sebanyak 3 kali. Semua kombinasi perlakuan ditambahkan BAP dengan konsentrasi 2 ppm. D. Pelaksanaan Penelitian 1. Pembuatan Larutan Stok Pembuatan larutas stok dengan cara menimbang bahan-bahan kimia sesuai komposisi media masing-masing yaitu MS dan WPM, kemudian mengencerkannya dengan aquades. Larutan tersebut diaduk hingga homogen menggunakan megnetic stirrer, lalu dimasukkan kedalam botol, diberi label dan disimpan di dalam refrigerator. 2. Sterilisasi Alat Alat-alat yang harus disterilkan yaitu botol kultur, tutup botol, petridish, pinset, dan pisau. Alat-alat tersebut dicuci sampai bersih menggunakan sabun cuci kemudian dikeringkan. Setelah kering alat-alat disterilisasi menggunakan autoklaf pada tekanan 1,5 psi (kg/cm 2 ) dan suhu 120 C selama 45 menit. Setelah itu alat seperti pinset, pisau, dan petridish dimasukkan ke dalam oven. Proses sterilisasi alat ini bertujuan agar alat yang digunakan bersih dan steril dari kontaminasi bakteri, jamur atau kontaminasi lain.

3 15 3. Pembuatan Media Media yang digunakan yaitu media MS dan WPM. Pembuatan 1 liter media digunakan untuk 40 botol kultur. Pembuatan media dilakukan dengan cara mencampurkan larutan stok yang terdiri dari larutan hara makro, larutan hara mikro, vitamin dan larutan FeEDTA dengan gula pasir sebanyak 30 g dan ditambahkan ZPT (BAP dan NAA). Bahan-bahan tersebut kemudian dilarutkan dengan aquades hingga 1 liter. Larutan dikondisikan pada ph 5,8-6,3 dengan menambahkan NaOH untuk menaikkan ph dan HCl untuk menurunkan ph. Setelah ph selesai diukur, larutan ditambahkan agar sebanyak 8 g, kemudian diaduk dengan magnetic stirrer dan dipanaskan hingga mendidih. Setelah mendidih, larutan dituangkan ke dalam botol kultur ± 25 ml/botol, kemudian ditutup. Botol yang sudah terisi larutan media kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilisasi pada tekanan 1,5 psi (kg/cm 2 ), dan suhu 120 C selama 45 menit. Hal serupa juga dilakukan untuk pembuatan media WPM. Botol-botol kultur berisi media yang telah disterilisasi selanjutnya disimpan pada rak-rak kultur. 4. Sterilisasi Eksplan Eksplan yang digunakan berasal dari bagian tunas pucuk tanaman sawo (Achras zapota). Sterilisasi eksplan perlu dilakukan agar eksplan bersih dari kontaminasi jamur, bakteri ataupun kontaminasi lainnya. Sterilisasi eksplan dilakukan dengan mencuci tunas (eksplan) menggunakan sabun, kemudian membilasnya menggunakan air hingga bersih. Setelah bersih, eksplan direndam ke dalam botol berisi bakterisida 1 g dan fungisida 2 g yang telah dilarutkan dengan aquades sebanyak 100 ml selama + 30 menit, kemudian membilasnya menggunakan aquades hingga bersih dan ditiriskan. Proses sterilisasi selanjutnya dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan merendam eksplan ke dalam alkohol 70% selama 1 menit, kemudian membilasnya dengan aquadest steril. Selanjutnya hal yang sama juga dilakukan untuk perendaman ke dalam chlorox dan vit c.

4 16 5. Penanaman Eksplan Penanaman eksplan dilakukan di dalam LAFC (Laminar Air Flow Cabinet) yang telah berisi alat-alat dan bahan-bahan yag dibutuhkan. LAFC dan alat-alat sebelumnya telah disterilisai menggunakan alkohol 70% dan disinari UV selama 1 jam. Penanaman dilakukan dengan memotong eksplan menggunakan pisau hingga menjadi ukuran yang lebih kecil mm. Eksplan selanjutnya dilewatkan di atas api bunsen dan ditanam kedalam botol kultur dengan hati-hati menggunakan pinset steril, kemudian botol ditutup dengan tutup plastik dan dilapisi plastik wrap serta diberi label sesuai dengan perlakuan dan tanggal penanaman. Setelah itu, botol-botol ditata di rak-rak kultur. 6. Pemeliharaan dan Pengamatan Pemeliharaan dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 70% ke botol-botol kultur setiap 2 hari sekali. Hal ini dilakukan untuk mengurangi resiko kontaminasi eksplan. Pengamatan dilakukan dengan mencatat hasil pertumbuhan eksplan hingga berumur 60 hari setelah tanam (HST). E. Peubah Pengamatan 1. Saat Muncul Kalus Pengamatan dilakukan setiap hari untuk mengetahui kapan saat muncul kalus. Waktu muncul kalus ditentukan dalam HST (Hari Setelah Tanam). 2. Warna Kalus Pengamatan dilakukan dengan mengamati secara visual warna kalus di akhir pengamatan (60 HST). 3. Tekstur Kalus Pengamatan dilakukan dengan mengamati tekstur kalus secara visual di akhir pengamatan 60 (HST). Kriteria pengamatan yang digunakan yaitu kompak, intermediet (sebagian kompak dan remah), friable/remah

5 17 4. Ukuran Kalus Pengamatan dilakukan dengan mengamati ukuran kalus secara visual di akhir pengamatan 60 (HST). Kriteria pengamatan yang digunakan yaitu sangat kecil, kecil, sedang, besar, sangat besar. 5. Saat Muncul Tunas Pengamatan dilakukan setiap hari untuk mengetahui kapan saat muncul tunas. Waktu muncul tunas ditentukan dalam HST (Hari Setelah Tanam). 6. Jumlah Tunas Pengamatan jumlah tunas dilakukan dengan menghitung jumlah tunas yang terbentuk pada eksplan di akhir pengamatan (60 HST). 7. Panjang Tunas Pengamatan panjang tunas dilakukan dengan mengukur tunas terpanjang (mm) pada akhir pengamatan (60 HST). 8. Jumlah Daun Pengamatan jumlah daun dilakukan dengan menghitung jumlah daun yang muncul pada eksplan di akhir pengamatan (60 HST). 9. Panjang Daun Pengamatan panjang daun dilakukan dengan mengukur daun terpanjang (mm) di akhir pengamatan (60 HST). F. Analisis Data Data hasil pengamatan yang diperoleh kemudian dianalisis secara deskriptif.