Lampiran 1. Perhitungan Pembuatan Pereaksi 1. 500 ml Natrium Fosfat 28 mm M massa 1 x Mr V(liter) 0,028 massa 1 x 164 0, 5 massa 2,296 gram 2. 500 ml Amonium Molibdat 4 mm M massa 1 x Mr V(liter) massa 1 0,004 x 1235,86 0, 5 Massa 2,472 gram 3. 500 ml H 2 SO 4 98% H 2 SO 4 98% 98 % b/b (98 gram dalam 100 gram larutan) BJ H 2 SO 4 1,84 massa Volume massa jenis 100 1,84 54,35 ml N gram BE x 98 1000 x 49 54,35 36,8 N 1000 volume (ml) Dari H 2 SO 4 36,8 N diencerkan menjadi 500 ml H 2 SO 4 0,6 M 36
Normalitas Molaritas x valensi 0,6 x 2 1,2 N V1.N1 V2.N2 V1. 36,8 1,2.500 V1 16,3 ml 37
Lampiran 2. Data Hasil Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Keterangan : Pengukuran kompleks Mo (V)/fosfat diukur pada rentang panjang gelombang 400-800 nm dilakukan pada panjang gelombang 710 nm. 38
Lampiran 3. Data Hasil Penentuan Waktu Kerja Menit Abs 1 0,449 2 0,448 3 0,447 4 0,449 5 0,449 6 0,450 7 0,448 8 0,449 9 0,448 10 0,448 11 0,447 12 0,447 13 0,447 14 0,447 15 0,447 16 0,447 17 0,447 18 0,447 19 0,447 20 0,447 21 0,447 22 0,448 23 0,448 24 0,448 25 0,446 26 0,445 27 0,445 28 0,446 29 0,446 30 0,447 Keterangan : Kestabilan warna diperoleh pada menit ke-11 sampai menit ke- 21, sehingga stabil selama 10 menit. 39
Lampiran 4. Perhitungan kurva kalibrasi Vitamin C LIB I 50 mg 50 ml 50000 µg 50 ml 1000 µg/ml. Untuk membuat kurva kalibrasi: 1. Dari LIB I dipipet 0,6 ml >V1.NI V2.N2 0,6.1000 10.N2 N2 60 µg/ml Dari 60 µg/ml dipipet 0,5 ml dan ditambah 5 ml larutan pereaksi V1.NI V2.N2 0,5.80 5,5.N2 N2 5,4545 µg/ ml 2. Dari LIB I dipipet 0,8 ml >V1.NI V2.N2 0,8.1000 10.N2 N2 80 µg/ml Dari 80 µg/ml dipipet 0,5 ml dan ditambah 5 ml larutan pereaksi V1.NI V2.N2 0,5.80 5,5.N2 N2 7,2727 µg/ml 3. Dari LIB I dipipet 1,0 ml >V1.NI V2.N2 1.1000 10.N2 N2 100 µg/ml 40
Dari 100 µg/ml dipipet 0,5 ml dan ditambah 5 ml larutan pereaksi V1.NI V2.N2 0,5.100 5,5.N2 N2 9,0909 µg/ml 4. Dari LIB I dipipet 1,2 ml >V1.NI V2.N2 1,2.1000 10.N2 N2 100 µg/ml Dari 120 µg/ml dipipet 0,5 ml dan ditambah 5 ml larutan pereaksi V1.NI V2.N2 0,5.120 5,5.N2 N2 10,909 µg/ml 5. Dari LIB I dipipet 1,4 ml >V1.NI V2.N2 1,4.1000 10.N2 N2 140 µg/ml Dari 140 µg/ml dipipet 0,5 ml dan ditambah 5 ml larutan pereaksi V1.NI V2.N2 0,5.140 5,5.N2 N2 12,7272 µg/ml 6. Dari LIB I dipipet 1,6 ml >V1.NI V2.N2 1,6.1000 10.N2 N2 160 µg/ml 41
Dari 160 µg/ml dipipet 0,5 ml dan ditambah 5 ml larutan pereaksi V1.NI V2.N2 0,5.160 5,5.N2 N2 14,5454 µg/ml 42
Lampiran 5. Data kurva kalibrasi Vitamin C pada panjang gelombang 710 nm Absorbansi 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 Kurva Kalibrasi y 0.0415x + 0.0029 R² 0.9998 0,000 0,0000 5,0000 10,0000 15,0000 20,0000 Konsentrasi No Konsentrasi (µg/ml) Absorbansi X Y 1 0,0000 0,000 2 54,545 0,230 3 72,727 0,311 4 90,909 0,380 5 109,090 0,453 6 127,272 0,527 7 145,454 0,609 43
Lampiran 6. Perhitungan Persamaan Regresi No Konsentrasi (µg/ml) Absorbansi X Y XY a X 27,4779 657,8449 0.0415 X Y / n 2 2 ( X ) / n ( 59,9997) 2 ( 59,9997) / 7 (2,510) / 7 XY X 2 Y 2 1. 0,0000 0,000 0 0 0 2. 5,4545 0,230 1,2545 29,7516 0,0529 3. 7,2727 0,311 2,2618 52,8922 0,0967 4. 9,0909 0,380 3,4545 82,6445 0,1444 5. 10,9090 0,453 4,9418 119,0063 0,2052 6. 12,7272 0,527 6,7072 161,9816 0,2777 7. 14,5454 0,609 8,8581 211,5687 0,3709 X 59,9997 Y2,510 XY27,4779 X 2 657,8449 Y 2 1,1478 X 8,5714 Y 0,3586 b Y a X 0,3586 (0,0415)(8,5714) 0,0029 Maka persamaan garis regresinya adalah: Y 0,0415 X + 0,0029 r ( XY X Y/n 2 X ( ) 2 2 2 X) /n)( Y ( Y) /n 27,4779 (59,9997)(2,510) / 7 (657,8449 (59,9997) 0.9998 2 / 7)(1,1478 (2,510) 2 / 7) 44
Lampiran 7. Hasil dan Data Pengukuran Kapasitas Antioksidan dari Larutan Sampel Serbuk Simplisia Rimpang Temulawak 909,0909 µg/ml No. Absorbansi Konsentrasi (µg/ml) Kapasitas antioksidan (mg vitamin C/g sampel) 1 0,478 11,4482 12,5930 2 0,482 11,5446 12,6737 3 0,473 11,3277 12,4730 4 0,473 11,3277 12,4605 5 0,482 11,5446 12,6611 6 0,479 11,4723 12,6195 45
Lampiran 8. Contoh Perhitungan Kapasitas Antioksidan dalam Sampel Serbuk Simplisia Rimpang Temulawak 909,0909 µg/ml Berat sampel yang ditimbang 100,0 mg Absorbansi (Y) 0,478 Persamaan regresi: y 0,0415x + 0,0029 (absorbansi - b) Konsentrasi (x) a y - 0,0029 0,0415 0,478-0,0029 0,0415 11,4482 µg/ ml Kapasitas Antioksidan ( mg vit c/g sampel) x sampel (µg/ml) x Fp Kapasitas Antioksidan ( mg vit c/g sampel) kesetaraan jumlah antioksidan sampel dalam berat vitamin C Kapasitas Antioksidan x sampel (µg/ml) x Fp 11,4482 µg/ml x 5,5 ml 0,5 ml x 10 ml 100 mg 1mg x 1000 µg x 1000 mg 1g 12,5930 mg/gram* *Artinya dalam 1 gram sampel mempunyai kekuatan antioksidan yang setara dengan 12.5930 mg vitamin C Kapasitas antioksidan pada sampel yang lain dapat dihitung dengan cara yang sama seperti contoh di atas. 46
Lampiran 9. Hasil dan Data Pengukuran Kapasitas Antioksidan dari Larutan Sampel Serbuk Simplisia Temulawak 1818,1818 µg/ml dengan maserasi No. Absorbansi Konsentrasi (µg/ml) Kapasitas antioksidan (mg vitamin C/g sampel ) 1 0,446 10,6771 5,8724 2 0,445 10,6530 5,8592 3 0,441 10,5566 5,8061 4 0,441 10,5566 5,8061 5 0,446 10,6771 5,8724 6 0,447 10,7012 5,8857 47
Lampiran 10. Contoh Perhitungan Kapasitas Antioksidan dalam sampel Larutan Sampel Serbuk Simplisia Temulawak 1818,1818 µg/ml dengan maserasi Berat sampel yang ditimbang 200 g Absorbansi (Y) 0,446 Persamaan regresi : y 0,0415x + 0,0029 Konsentrasi (x) (absorbansi - b) a y - 0,0029 0,0415 0,446-0,0029 0,0415 10,6771 µg/ml Kapasitas Antioksidan ( mg vit c/g sampel) x sampel (µg/ml) x Fp Kapasitas Antioksidan ( mg vit c/g sampel) kesetaraan jumlah antioksidan sampel dalam berat vitamin c Kapasitas Antioksidan x sampel (µg/ml) x Fp 10,6771 µg/ml x 5,5 ml 0,5 ml x 10 ml 2 ml x 2000 ml 200 g 1mg x 1000 µg 5,8724 mg /gram* *Artinya dalam 1 gram sampel mempunyai kekuatan antioksidan yang setara dengan 5,8724 mg vitamin C Kapasitas antioksidan pada sampel yang lain dapat dihitung dengan cara yang sama seperti contoh di atas. 48
Lampiran 11. Hasil dan Data Pengukuran Kapasitas Antioksidan dari Larutan Sampel Sediaan Jadi Temulawak 181,8181 µg/ml di Pasaran No. Absorbansi Konsentrasi (µg/ml) Kapasitas antioksidan (mg vitamin C/g sampel) 1 0,512 12,2675 67,4711 2 0,518 12,4120 68,1981 3 0,510 12,2193 67,2733 4 0,513 12,2916 67,6036 5 0,508 12,1711 67,0080 6 0,514 12,3157 67,6685 49
Lampiran 12. Contoh Perhitungan Kapasitas Antioksidan dalam sampel Larutan Sampel Sediaan Jadi Temulawak 181,8181 µg/ml di Pasaran Berat sampel yang ditimbang 100,0 mg Absorbansi (Y) 0,512 Persamaan regresi : y 0,0415x + 0,0029 (absorbansi - b) Konsentrasi (x) a y - 0,0029 0,0415 0,512-0,0029 0,0415 12,2675 µg/ml Kapasitas Antioksidan ( mg vit c/g sampel) x sampel (µg/ml) x Fp Kapasitas Antioksidan ( mg vit c/g sampel) kesetaraan jumlah antioksidan sampel dalam berat vitamin C Kapasitas Antioksidan 12,2675 µg/ml x x sampel (µg/ml) 5,5 ml x 0,5 ml 67,4711 mg /gram* x Fp 10 ml 10 ml 1mg x x 2 ml 100 mg 1000 µg 1000 mg x 1g *Artinya dalam 1 gram sampel mempunyai kekuatan antioksidan yang setara dengan 67,4711 mg vitamin C Kapasitas antioksidan pada sampel yang lain dapat dihitung dengan cara yang sama seperti contoh di atas. 50
Lampiran 13. Perhitungan Statistik Kapasitas Antioksidan 1.Perhitungan Statistik Kapasitas Antioksidan dalam Serbuk Simplisia Rimpang Temulawak No. Xi Kadar (mg/g) (Xi- X ) (Xi- X ) 2 1. 12,5930 0,0129 0,000165551 2. 12,6737 0,0936 0,008754721 3. 12,4730-0,1071 0,011477551 4. 12,4605-0,1196 0,014312134 5. 12,6611 0,0810 0,006555601 6. 12,6195 0,0394 0,001549734 75,4808 X 12,5801 0,042815293 Dari data yang diperoleh, data ke 2 adalah yang paling menyimpang sehingga diuji dengan uji Q. Nilai yang dicurigai - Nilai yang terdekat Q Nilai tertinggi - Nilai terendah 12,4605-12,4730 Q 12,6737-12,4605 Q 0,0586 Nilai Q yang diperoleh tidak melebihi nilai Q 0,95 yaitu 0,6210 sehingga semua data diterima. 2 ( Xi - X) SD n -1 0,042815293 6 1 0,0925 SD RSD x100% X 0,0925 RSD x100% 12,5801 RSD 0,74 % 51
Pada tingkat kepercayaan 95% dengan nilai α 0,05 dan dk 5, diperoleh t tabel 2,5706. Data diterima jika t hitung < t tabel Xi - X t hitung SD n t hitung data 1 0,0569 t hitung data 2 0,4131 t hitung data 3 0,4727 t hitung data 4 0,5278 t hitung data 5 0,3575 t hitung data 3 0,1739 Semua data diterima, maka Kadar sebenarnya; µ X ± (t (α/2, dk) x α SD n ) 12,5801 ± (2,5706 x 0,0925 / 6 ) Setara dengan (12,5801± 0,0971) mg Vitamin C/gram sampel 52
2. Perhitungan Statistik Kapasitas Antioksidan dalam Serbuk Simplisia Rimpang Temulawak dengan maserasi No. Xi Kadar (mg/g) (Xi- X ) (Xi- X ) 2 1. 5,8724 0,0221 0,0004876736 2. 5,8592 0,0089 0,0000789136 3. 5,8061-0,0442 0,0019551136 4. 5,8061-0,0442 0,0019551136 5. 5,8724 0,0221 0,0004876736 6. 5,8857 0,0354 0,0012519803 35,1019 X 5,8503 0,0062164683 Dari data yang diperoleh, data ke 2 adalah yang paling menyimpang sehingga diuji dengan uji Q. Nilai yang dicurigai - Nilai yang terdekat Q Nilai tertinggi - Nilai terendah Q 5,8061-5,8592 5,8857-5,8061 Q 0,6671 Nilai Q yang diperoleh tidak melebihi nilai Q 0,95 yaitu 0,6210 sehingga semua data diterima. 2 ( Xi - X) SD n -1 0,0062164683 6 1 0,0353 SD RSD x100% X 0,0353 RSD x100% 5,8503 RSD 0,60 % 53
Pada tingkat kepercayaan 95% dengan nilai α 0,05 dan dk 5, diperoleh t tabel 2,5706. Data diterima jika t hitung < t tabel Xi - X t hitung SD n t hitung data 1 0,2556 t hitung data 2 0,1029 t hitung data 3 0,5112 t hitung data 4 0,5112 t hitung data 5 0,2556 t hitung data 3 0,4094 Semua data diterima, maka Kadar sebenarnya; µ X ± (t (α/2, dk) x α SD n ) 5,8503 ± (2,5706 x 0,0353 / 6 ) Setara dengan (5,8503 ± 0,0370) mg Vitamin C/gram sampel 54
3. Perhitungan Statistik Kapasitas Antioksidan dalam Sediaan Jadi Temulawak di Pasaran No. Xi Kadar (mg/g) (Xi- X ) (Xi- X ) 2 1. 67,4711-0,0660 0,004356 2. 68,1981 0,6610 0,436921 3. 67,2733-0,2638 0,06959044 4. 67,6036 0,0665 0,00442225 5. 67,0080-0,5291 0,27994681 6. 67,6685 0,1314 0,01726596 405,2226 X 67,5371 0,81250246 Dari data yang diperoleh, data ke 2 adalah yang paling menyimpang sehingga diuji dengan uji Q. Nilai yang dicurigai - Nilai yang terdekat Q Nilai tertinggi - Nilai terendah Q 68,1981-67,6685 68,1981-67,0080 Q 0,4455 Nilai Q yang diperoleh tidak melebihi nilai Q 0,95 yaitu 0,6210 sehingga semua data diterima. 2 ( Xi - X) SD n -1 0,81250246 6 1 0,4031 SD RSD x100% X 0,4031 RSD x100% 67,5371 RSD 0,60 % 55
Pada tingkat kepercayaan 95% dengan nilai α 0,05 dan dk 5, diperoleh t tabel 2,5706. Data diterima jika t hitung < t tabel Xi - X t hitung SD n t hitung data 1 0,0668 t hitung data 2 0,6694 t hitung data 3 0,2672 t hitung data 4 0,0673 t hitung data 5 0,5359 t hitung data 3 0,1331 Semua data diterima, maka Kadar sebenarnya; μ X ± (t (α/2, dk) x α SD n ) 67,5371 ± (2,5706 x 0,4031 / 6 ) Setara dengan (67,5371 ± 0,4230) mg Vitamin C/gram sampel 56
Lampiran 14. Perhitungan Hasil Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi X Y Yi Y-Yi (Y-Yi) 2 0,0000 0,000 0,0029-0,0029 0,00000841 5,4545 0,230 0,2293 0,0007 0,00000049 7,2727 0,311 0,3047 0,0063 0,00003969 9,0909 0,380 0,3802-0,0002 0,00000004 10,9090 0,453 0,4556-0,0026 0,00000676 12,7272 0,527 0,5311-0,0041 0,00001681 14,5454 0,609 0,6065 0,0025 0,00000625 (Y-Yi) 2 0,00007845 Simpangan Baku (Y Yi) n 2 2 0,00007845 5 0,00396 3 x SB LOD slope 3 x 0,00396 0,0415 0,2863 µg/ ml LOQ 10x SB slope 10 x 0,00396 0,0415 0,9542 µg/ ml 57
Lampiran 15. Data dan Contoh Perhitungan Uji Akurasi dengan Persen Perolehan Kembali (%Recovery) untuk Sampel 1. Data untuk Uji Akurasi dengan Persen Perolehan Kembali (%Recovery) untuk Sampel Serbuk Simplisia Rimpang Temulawak. No. Abs CF CF (µg/ml) Abs CA CA (µg/ml) C*A (µg/ml) % recovery (%) 1 0,596 14,2916 0,478 11,4482 2,7272 104,26 2 0,592 14,1952 0,482 11,5446 2,7272 97,19 3 0,590 14,1470 0,473 11,3277 2,7272 103,38 4 0,596 14,2916 0,473 11,3277 2,7272 108,68 5 0,589 14,1229 0,482 11,5446 2,7272 94,54 6 0,585 14,0265 0,479 11,4723 2,7272 93,66 Rata-rata 100,28 % Contoh Perhitungan % Recovery Keterangan : CF CA C * A x 100% C F konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan larutan baku C A konsentrasi sampel awal C* A konsentrasi larutan baku yang ditambahkan Untuk mencari C F, dimasukkan Abs C F ke dalam persamaan regresi: Y 0,0415X + 0,0029 0,596 0,0415X + 0,0029 X 14,2916 µg/ml Untuk mencari C A, dimasukkan Abs C A ke dalam persamaan regresi: Y 0,0415X + 0,0029 0,478 0,0415X + 0,0029 X 11,4482 µg/ml 58
Konsentrasi larutan baku yang ditambahkan LIB I 50 mg 50 ml 50000 µg 50 ml 1000 µg/ml. Dari LIB I dipipet 0,3 ml >V1.NI V2.N2 0,3.1000 10.N2 N2 30 µg/ ml Dari labu larutan ini dipipet 0,5 ml dan ditambah 5 ml larutan pereaksi V1.NI V2.N2 0,5.30 5,5.N2 N2 2,7272 µg/ ml* Keterangan : * maka konsentrasi larutan baku yang ditambahkan adalah sebesar 2,7272 µg/ ml. % Recovery 14,2916 µg/ml - 11,4482 µg/ml 2,7272 µg/ml x 100% 104,26 % Perhitungan perolehan kembali (%) kadar antioksidan pada sampel lain dapat dihitung dengan cara yang sama seperti contoh diatas. 59
2. Data untuk Uji Akurasi dengan Persen Perolehan Kembali (%Recovery) untuk Sampel Serbuk Simplisia Rimpang Temulawak dengan maserasi. No. Abs CF CF (µg/ml) Abs CA CA (µg/ml) C*A (µg/ml) % recovery (%) 1 0,563 13,4964 0,446 10,6771 2,7272 103,38 2 0,561 13,4482 0,445 10,6530 2,7272 102,49 3 0,551 13,2072 0,441 10,5566 2,7272 97,19 4 0,553 13,2554 0,441 10,5566 2,7272 98,96 5 0,550 13,1831 0,446 10,6771 2,7272 91,89 6 0,558 13,3759 0,447 10,7012 2,7272 98,07 Rata-rata 98,66 % Contoh Perhitungan % Recovery Keterangan : CF CA C * A x 100% C F konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan larutan baku C A konsentrasi sampel awal C* A konsentrasi larutan baku yang ditambahkan Untuk mencari C F, dimasukkan Abs C F ke dalam persamaan regresi: Y 0,0415X + 0,0029 0,563 0,0415X + 0,0029 X 13,4964 µg/ml Untuk mencari C A, dimasukkan Abs C A ke dalam persamaan regresi: Y 0,0415X + 0,0029 0,446 0,0415X + 0,0029 X 10,6771 µg/ml Konsentrasi larutan baku yang ditambahkan LIB I 50 mg 50 ml 50000 µg 50 ml 1000 µg/ml. 60
Dari LIB I dipipet 0,3 ml >V1.NI V2.N2 0,3.1000 10.N2 N2 30 µg/ ml Dari labu larutan ini dipipet 0,5 ml dan ditambah 5 ml larutan pereaksi V1.NI V2.N2 0,5.30 5,5.N2 N2 2,7272 µg/ ml* Keterangan : * maka konsentrasi larutan baku yang ditambahkan adalah sebesar 2,7272 µg/ ml. % Recovery 13,4964 µg/ml - 10,6771µg/ml 2,7272 µg/ml x 100% 103,38 % Perhitungan perolehan kembali (%) kadar antioksidan pada sampel lain dapat dihitung dengan cara yang sama seperti contoh diatas. 61
3. Data untuk Uji Akurasi dengan Persen Perolehan Kembali (%Recovery) untuk Sampel Sediaan Jadi Temulawak di Pasaran. No. Abs CF CF (µg/ml) Abs CA CA (µg/ml) C*A (µg/ml) % recovery (%) 1 0,589 14,1229 0,512 12,2675 1,8181 102,05 2 0,582 13,9542 0,518 12,4120 1,8181 84,82 3 0,581 13,9301 0,510 12,2193 1,8181 94,10 4 0,586 14,0506 0,513 12,2916 1,8181 96,75 5 0,579 13,8819 0,508 12,1711 1,8181 94,10 6 0,584 14,0024 0,514 12,3157 1,8181 92,78 Rata-rata 94,10 % Contoh Perhitungan % Recovery Keterangan : CF CA C * A x 100% C F konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan larutan baku C A konsentrasi sampel awal C* A konsentrasi larutan baku yang ditambahkan Untuk mencari C F, dimasukkan Abs C F ke dalam persamaan regresi: Y 0,0415X + 0,0029 0,589 0,0415X + 0,0029 X 14,1229 µg/ml Untuk mencari C A, dimasukkan Abs C A ke dalam persamaan regresi: Y 0,0415X + 0,0029 0,589 0,0415X + 0,0029 X 12,2675 µg/ml Konsentrasi larutan baku yang ditambahkan LIB I 50 mg 50 ml 50000 µg 50 ml 1000 µg/ml. 62
Dari LIB I dipipet 0,2 ml >V1.NI V2.N2 0,2.1000 10.N2 N2 20 µg/ ml Dari larutan ini dipipet 0,5 ml dan ditambah 5 ml larutan pereaksi V1.NI V2.N2 0,5.20 5,5.N2 N2 1,8181 µg/ ml* Keterangan : * maka konsentrasi larutan baku yang ditambahkan adalah sebesar 1,8181 µg/ ml. % Recovery 14,1229 µg/ml -12,2675 µg/ml 1,8181µg/ml 102,05 % x 100% Perhitungan perolehan kembali (%) kadar antioksidan pada sampel lain dapat dihitung dengan cara yang sama seperti contoh diatas. 63
Lampiran 16. Tabel Distribusi t 64
Lampiran 17. Hasil Identifikasi Sampel Temulawak 65
Lampiran 18. Gambar sampel Gambar 1. Gambar Kotak Sediaan Jadi Temulawak di Pasaran Gambar 2. Gambar Etiket Sediaan Jadi Temulawak di Pasaran Gambar 3. Gambar Simplisia Temulawak 66