Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate

Transkripsi

1 Kekerabatan Filogenetik Buah Makassar (Brucea javanica) Berdasarkan Gen Ribulosa-1,5-bifosfaT Karboksilase/Oksigenase Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene Tri Widayat, Dyah Subositi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Badan Litbangkes, Departemen Kesehatan Jl. Lawu, Tawangmangu, Karanganyar, Jawa tengah ABSTRAK Buah makassar (Brucea javanica) adalah salah satu tanaman obat yang dikoleksi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT), Tawangmangu. Salah satu aspek dari tanaman obat tersebut yang datanya belum terkoleksi di B2P2TO-OT adalah kekerabatan. Oleh karena itu, tujuan dari studi kekerabatan B. javanica adalah untuk mengetahui hubungan kekerabatan buah B.javanica berdasarkan penanda molekuler gen ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/oksigenase (rbcl). Hubungan kekerabatan tersebut dapat dilihat dari pohon filogeni yang dkonstruksi berdasarkan sequence nukleotida pada rbcl. Sequence rbcl diperoleh dari National Center for Biotechnology Information (NCBI) dan aligment sequence untuk konstruksi pohon filogenetik menggunakan program ClustalW yang diakses dari DNA Data Bank of Japan (DDBJ) secara online. Pohon filogenetik menunjukkan bahwa B. javanica berkerabat dengan beberapa spesies tanaman anggota familia Anacardiaceae. Kata kunci: Brucea javanica, filogenetik, rbcl ABSTRACT Buah makassar (Brucea javanica) is one of medicinal plant collections in Medicinal plant and Traditional Medicine Research Center (B2P2TO-OT) Tawangmangu. Phyllogenetic relationship data of B. javanica is important information as a database for further research. The objective of this study was to provide phylogenetic relationship of B. javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene(rbcl). The rbcl sequence in this research was taken from National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the sequence was aligned by using ClustalW program to construct phylogenetic tree. The result showed that B. javanica has a closed relationship with some species of Anacardiaceae. Key words: Brucea javanica, phylogenetic relationship, rbcl 124 Volume 2, No. 2, Desember 2009

2 KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR (BRUCEA JAVANICA) BERDASARKAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASE/OKSIGENASE Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene PENDAHULUAN Buah Makassar (Brucea javanica) merupakan salah satu jenis tanaman obat yang ditanam di kebun koleksi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT), Tawangmangu. Tanaman yang termasuk dalam familia Simarubaceae tersebut secara empiris digunakan untuk mengobati disentri, malaria, kudis dan penawar racun lipan. Ekstrak biji B. javanica efektif sebagai amubisida. Senyawa bruseantin dan brusein C yang diisolasi dari ekstrak biji diketahui aktif menghambat pertumbuhan Entamoeba hystolitica. (Anonim, 2009). Kegunaan buah makassar untuk pengobatan menjadikannya salah satu tanaman obat yang menarik untuk diteliti. Salah satu studi yang belum banyak dilakukan terhadap buah makassar adalah dari bidang sistematika. Similaritas buah makassar dengan tanaman lain dapat diketahui melalui studi taksonomi numerik dengan memanfaatkan data fenetik sebagai karakter. Sedangkan kekerabatannya dapat diketahui melalui konstruksi pohon filogenetik dengan memanfaatkan data molekuler. Saat ini data molekuler organisme dari semua divisi yang berupa sequence DNA dapat diakses dengan relatif mudah dari bank data yang menyimpannya. Salah satu data molekuler yang dapat digunakan adalah sequence DNA untuk gen ribulosa-1,5-bifosfat karbosilase/ oksigenase (rbcl). Gen tersebut dapat dipergunakan sebagai penanda molekuler dalam penyusunan klasifikasi filogenetik karena gen tersebut terdapat pada organisme kemoautotrof, misalnya beberapa jenis bakteri, dan organisme fototrof, misalnya tumbuhan. Ekspresi dari rbcl adalah protein fungsional ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/ oksigenase atau RubisCO yang berfungsi mengkatalisis fiksasi dan reduksi CO 2 dari udara menjadi karbon organik (Tabita et al., 2008). Dalam klasifikasi filogenetik ini data sequence rbcl pada protoplast tanaman B. javaniva yang disimpan di National Center for Biotechnology Information (NCBI) akan digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang menggambarkan kekerabatan evolusioner tanaman B. javanica. Pohon filogenetik adalah ilustrasi evolusi yang terjadi pada sekelompok organisme yang berasal dari nenek moyang yang sama, yang disusun berdasarkan kesamaan dalam beberapa hal, misalnya gen, protein dan organ (Ochieng et al., 2007). METODE PENELITIAN Bahan Sekuens rbcl yang diunduh dari bank data internasional National Center for Biotechnology Information (NCBI) melalui situs http//:www. ncbi.nlm.niv.gov. Cara kerja Klasifikasi filogenetik tanaman B. javanica ini dibuat dengan memanfaatkan data sequence DNA yang disimpan di bank data internasional NCBI dan program untuk konstruksi pohon filogenetik secara online yang disediakan oleh DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Data sequence DNA pengkode enzim Rubisco untuk tanaman buah Makassar (Brucea javanica) diunduh dari situs http//: Sequence DNA tersebut kemudian disalin ke program Volume 2, No. 2, Desember

3 Tri Widayat, Dyah Subositi Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) yang dibuka di http// untuk mengukur similiritas antara data sequence yang dimasukkan dengan data yang ditemukan dalam database. Selanjutnya, dilakukan alignment menggunakan program Clustal W versi 1.83 pada situs yang sama. Hasil alignment digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang visualisasinya dilakukan menggunakan program TREEVIEW. Selain itu, data sequence DNA dari NCBI juga digunakan untuk memprediksi struktur tiga dimensi protein yang dikode oleh gen rbcl melalui query yang dikirim ke DDBJ. HASIL DAN PEMBAHASAN Data karakter molekular yang diunduh dari NCBI adalah sequence gen lengkap subunit besar ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/ oksigenase yang terdapat di dalam kloroplast tanaman B. javanica. Gen tersebut dapat digunakan sebagai penanda universal dalam sistematika molekular khususnya sistematika tumbuhan karena dimiliki oleh semua organisme yang berfotosintesis. Ekspresi dari rbcl adalah enzim ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/ oksigenase (RubisCO) yang berfungsi dalam katalisis fiksasi karbon di dalam siklus Calvin. Selain mengkatalisis pengikatan karbon dioksida pada substrat ribulosa-1,5-bifosfat, RubisCO juga mempercepat oksigenasi substrat tersebut sehingga RubisCO disebut enzim ribulosa-1,5- bifosfat karboksilase/ oksegenase (Tabita et al., 2008). Pada data sequence gen RubisCO yang disimpan oleh NCBI terdapat data translasi gen tersebut. Data translasi gen yang merupakan deretan asam amino kemudian dikirimkan DDBJ untuk mengetahui bentuk tiga dimensi protein hasil translasi. Struktur tiga dimensi subunit besar protein fungsional RubisCO yang ditunjukkan oleh DDBJ ditampilkan dalam Gambar 1. Enzim RubisCO pada tanaman biasanya terdiri atas dua subunit protein yaitu rantai panjang ( Da) dan rantai pendek ( Da) (Yoon et al., 2001). Substrat yang berupa ribulosa-1,5-bifosfat terikat pada sisi pengikatan subunit besar. Keseluruhan enzim ini tersusun atas delapan dimer rantai panjang dan delapan rantai pendek yang membentuk sebuah kompleks yang lebih besar yaitu protein berukuran Da (Stryer et al., 2002). Gambar 1. Subunit besar enzim ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/oksigenase Program yang digunakan untuk menentukan similaritas antar sequence yang adalah BLAST dan ClustalW. Di dalam kedua program tersebut terdapat algoritme yang berfungsi mengukur similaritas antar sequence yang diperbandingkan. Perbedaan keduanya adalah bahwa ClustalW mengukur similaritas di antara beberapa input sequence, sedangkan BLAST membandingkan satu input sequence dengan semua sequence yang ditemukan dalam 126 Volume 2, No. 2, Desember 2009

4 KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR (BRUCEA JAVANICA) BERDASARKAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASE/OKSIGENASE Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene database. Pengukuran similaritas menggunakan ClustalW dapat digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang menggambarkan hubungan evolusioner, sedangkan BLAST mengukur semua similaritas tanpa memandang asal-usul evolusioner. Pohon filogenetik yang dikonstruksi berdasarkan rbcl pada tanaman B. javanica ditunjukkan oleh Gambar 2. Berdasarkan gambar tersebut diketahui bahwa pohon filogeni tersusun dari banyak klaster kecil yang berupa percabangan. Pohon filogenetik selain menunjukkan kekerabatan antar spesies yang diperbandingkan, juga menggambarkan perubahan yang terjadi pada gen penanda untuk masing-masing spesies. Semakin panjang suatu cabang artinya semakin banyak perubahan yang terjadi pada gen penanda selama proses evolusi, akibatnya spesies yang berada pada cabang tersebut dapat dikatakan lebih maju. Menurut Ochieng et al., (2007) pohon filogenetik tersusun atas nodus-nodus dan percabangan. Masingmasing nodus menggambarkan proses spesiasi selama terjadinya evolusi. Nodus-nodus ujung mewakili data yang dibandingkan (operational taxonomic units), sedangkan nodus internal melambangkan unit nenek moyang (hypothetical taxonomic unit). Panjang masing-masing cabang mewakili jumlah perubahan yang terjadi pada karakter yang digunakan sebelum terjadinya separasi berikutnya. Oleh karenanya, karakter yang sangat mirip akan berdekatan di dalam percabangan. Volume 2, No. 2, Desember

5 Tri Widayat, Dyah Subositi Gambar 2. Pohon filogenetik yang menggambarkan hubungan kekerabatan B. javanica. 128 Volume 2, No. 2, Desember 2009

6 KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR (BRUCEA JAVANICA) BERDASARKAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASE/OKSIGENASE Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene Salah satu tahap penting dalam mengkonstruksi pohon filogenetik adalah alignment, yaitu membandingkan sisi yang homolog-homolog dan variable-variabel antar sequence sehingga diperoleh nilai similaritas. Berdasarkan alignment menggunakan program ClustalW yang dilakukan pada sequence rbcl B. javanica diketahui bahwa nilai similaritasnya terhadap sequence rbcl spesies-spesies yang lain berkisar antara 95-99% (Tabel 1). Dari 31 spesies tanaman yang dibandingkan dengan B. javanica dalam konstruksi pohon filogenetik diketahui bahwa terdapat lima familia yaitu Anacardiaceae, Sapindaceae, Burseraceae, Meliaceae dan Simarubaceae, yang posisinya di dalam pohon filogenetik terlokalisir dalam klaster-klaster yang berdekatan untuk setiap anggota familia yang sama. Nama familia untuk masing-masing spesies disajikan dalam Tabel 1. Berdasarkan pohon filogenetik diketahui bahwa klaster-klaster kecil di bagian bawah pohon filogenetik ditempati oleh anggota familia Anacardiaceae dengan nilai similaritas sebesar 98-99%. Spesies tanaman anggota Meliaceae mempunyai nilai similaritas sebesar 96% dan berada pada klaster bagian tengah. Klaster di bagian atas ditempati oleh Burseraceae dengan kisaran similaritas 96-97%. Pengelompokan dalam satu klaster untuk tanaman familia yang sama menggambarkan kedekatan kekerabatannya. Semakin banyak sequence DNA yang sama semakin tinggi similaritasnya sehingga posisinya di dalam percabangan pohon filogeni berdekatan. Kejanggalan posisi beberapa spesies terdapat pada letaknya yang berjauhan, tidak menjadi satu klaster, meskipun spesies-spesies tersebut menjadi anggota familia yang sama ditunjukkan oleh Blepharocarya depauperata dan Buchanania latifolia (Anacardiaceae), Dobinea delavayi dan Diploglottis campbelli (Sapindaceae). Spesies-spesies tersebut berada terpisah satau sama lain dan juga terpisah dari klaster besar anggota familianya. Anggota Simarubaceae yang lain, B. tenuifolia, bahkan hanya memiliki nilai similaritas 95% terhadap B. javanica. Posisi dalam klaster yang saling berjauhan untuk keenam spesies tersebut kemungkinan terjadi karena urutan nukleotida pada gen RubisCO yang mereka miliki perbedaannya cukup besar meskipun spesies tersebut adalah anggota familia yang sama. Pengaruh habitat dapat menyebabkan terjadinya variasi dalam RubisCO. Berdasarkan data dari NCBI diketahui bahwa sumber gen untuk B. javanica dengan kode aksesi AY adalah tanaman dari Korea, sedangkan sumber gen B. tenuifolia dengan kode aksesi EU adalah tanaman dari Amerika Serikat. Menurut Kellog dan Juliano (1997) variasi pada RubisCO kemungkinan karena protein protein fungsional ini bersifat adaptif dan keberadaannya merupakan hasil evolusi sebagai respon terhadap kondisi lingkungan. Oleh karena rbcl adalah gen pengkode proten fungsional, maka jumlah sisi variabelnya kecil, kurang dari 1428 bp dan laju perubahan sisi variabel sangat berbeda-beda. Hal itu merupakan kelemahan penggunaan rbcl dalam sistematika. Volume 2, No. 2, Desember

7 Tri Widayat, Dyah Subositi Tabel 1. Nilai similaritas spesies dalam pohon filogenetik. No Spesies Familia Similaritas (%) 1 Blepharocarya depauperata Anacardiaceae 98 2 Dobinea delavayi Sapindaceae 97 3 Buchanania latifolia Anacardiaceae 97 4 Beiselia mexicana Burseraceae 97 5 Canarium ovatum Burseraceae 97 6 Canarium indicum Burseraceae 96 7 Proteum madagascariense Burseraceae 97 8 Bursera inaguensis Burseraceae 97 9 Commiphora habessinica Burseraceae Diploglottis campbelli Sapindaceae Brucea tenuifolia Simarubaceae Cedrella odorata Meliaceae Khaya anthotheca Meliaceae Swietenia macrophylla Meliaceae Trichilia emetica Meliaceae Nymania capensis Meliaceae Cipadessa baccifera Meliaceae Spondias cytherea Anacardiaceae Tapirira mexicana Anacardiaceae Cyrtocarpa procera Anacardiaceae Mangifera indica Anacardiaceae Anacardium occidentale Anacardiaceae Heeria argentea Anacardiaceae Brucea javanica Simarubaceae Brucea javanica Simarubaceae Laurophyllus capensis Anacardiaceae Pistacea vera Anacardiaceae Cotinus coggygria Anacardiaceae Schinus molle Anacardiaceae Amphypterygium adstringens Anacardiaceae Rhus ambigua Anacardiaceae Toxicodendron succedaneum Anacardiaceae 99 KESIMPULAN Berdasarkan pohon filogenetik yang dihasilkan dapat disimpulkan sequence rbcl dapat digunakan sebagai karakter molekuler untuk menyusun pohon filogenetik. Penggunaan sequence rbcl untuk kosntruksi pohon filogenetik memperlihatkan bahwa tanaman buah Makassar (B. javanica) berkerabat dekat dengan beberapa tanaman dari familia Anacardiaceae. Pohon filogenetik yang dikonstruksi berdasarkan gen pengkode protein fungsional dimungkinkan dapat digunakan untuk menduga kemiripan kandungan metabolit antar tanaman yang berkerabat dekat. Studi kekerabatan dengan menggunakan metabolit sebagai karakter diperlukan untuk membuktikan dugaan tersebut. DAFTAR PUSTAKA Anonim Kwalot. Diakses dari http// www:iptek.net.id/ind/pd_tanobat/ view. php?mnu=2&id=233 pada tanggal Volume 2, No. 2, Desember 2009

8 KEKERABATAN FILOGENETIK BUAH MAKASSAR (BRUCEA JAVANICA) BERDASARKAN GEN RIBULOSA-1,5-BIFOSFAT KARBOKSILASE/OKSIGENASE Phylogenetic relationship of Brucea javanica based on molecular marker ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxyigenase gene Oktober Kellog EA., and Juliano ND The structure and function of rubisco and theirimplication for systematic studies. American Journal of Botany 84(3): Ochieng JW., Muigai AWT., and Ude GN Review: Phylogenetics in plant biotechnology: principles, obstacles and opportunities for resource poor. African Journal of Biotechnology, Vol. 6 (6): Stryer L., Berg JM., and Tymoczko JL Chapter 20: The Calvin Cycle and the Pentose Phosphate Pathway. Biochemistry (5th ed.). WH Freeman, San Francisco. Tabita FR., Hanson TE., Satagopan S., Witte BH., and Kreel NE Review: Phylogenetic and evolutionary relationships of RubisCO and the RubisCO-like proteins and the functional lessons provided by diverse molecular forms. Phil. Trans. R. Soc. B., 363: Yoon M., Putterill JJ., Ross GS., and Laing WA Determination of the relative expression levels of rubisco small subunit genes in Arabidopsis by rapid amplification of cdna ends. Anal. Biochem., 291(2): Volume 2, No. 2, Desember