IDENTIFIKASI MUTASI GEN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN RECEPTOR

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI MUTASI GEN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN RECEPTOR IB (BMPRIB) DAN GEN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 5 (BMP5) TERHADAP PROLIFIKASI PADA DOMBA GARUT GALUR SUBUR NUR AZIFAH CAKRA DEWI DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 009

2 ABSTRAK NUR AZIFAH CAKRA DEWI. Identifikasi Mutasi Gen Bone Morphogenetic Protein Receptor IB (BMPRIB) dan Gen Bone Morphogenetic Protein 5 (BMP5) terhadap Prolifikasi pada Domba Garut Galur Subur. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan CECE SUMANTRI. Domba garut merupakan domba yang memiliki sifat prolifik. Sekumpulan faktor pertumbuhan yang bekerja pada oosit dan selsel folikel ovarium dikelompokkan sebagai oocytedderived growth factor (ODGF) yang kemudian dikenal sebagai Tansforming Growth Factor β (TGFβ). Tiga faktor anggota TGFβ yang dianggap sebagai major gene bagi sifat prolifik adalah Bone Morphogenetic Protein Receptor IB (BMPRIB), Bone Morphogenetic Protein 5 (BMP5) dan Growth Differentiation Factor 9 (GDF9). Pada penelitian ini dilakukan identifikasi mutasi dari dua gen anggota TGFβ, yaitu mutasi titik pada ekson ke6 gen BMPRIB dan mutasi titik pada ekson ke gen BMP5. Komposisi genotipe untuk gen BMPRIB pada domba Garut galur subur adalah BB (%), (69%), dan (0%), dan frekuensi alel B (tipe mutan) sebesar 6% dan alel (tipe liar) sebesar 5%. Sedangkan komposisi genotipe gen BMP5 adalah 00% untuk. Dengan kata lain, pada populasi domba Garut tidak ditemukan mutasi titik tipe Galway pada gen BMP5. Deteksi mutasi lebih lanjut pada ekson ke gen BMP 5 dengan metode SSCP menemukan tipe mutasi, yang diberi kode A, B, C dan D. Semua genotipe yang berhasil dideteksi, baik sebagai gen tunggal maupun kedua gen dikombinasikan, tidak berkorelasi dengan jumlah anak per kelahiran.

3 ABSTRACT NUR AZIFAH CAKRA DEWI. Mutation Identification in Bone Morphogenetic Protein Receptor IB (BMPRIB) and Bone Morphogenetic Protein 5 (BMP5) Genes are Associated with Proliferation in Prolific Garut Sheep. Under the supervision of ACHMAD FARAJALLAH and CECE SUMANTRI. Garut sheep is prolific sheep breed. A group of growth factor that is especially expressed in oocyte and ovarian follicle is grouped as oocytedderived growth factor (ODGF), also known as the Tansforming Growth Factor β (TGFβ). Proliferation in sheep controlled by three main factor of TGFβ that are Bone Morphogenetic Protein Receptor IB (BMPRIB), Bone Morphogenetic Protein 5 (BMP5) and Growth Differentiation Factor 9 (GDF9). Mutation identification in the 6 th exon of BMPRIB gene and nd exon of BMP5 gene was done in this research. Genotype composition of BMPRIB gene in prolific Garut sheep consist of BB (%), (69%), and (0%). The frequency of B allele (mutant type) was 6% and allele (wild type) was 5%. Genotype composition of BMP5 gene was (00%). These implied that there was no Galway mutation in BMP5 gene. Further detection of mutation on the nd exon of BMP5 gene using SSCP method was found four type of mutation denoted by A, B, C, D. All genotype had successfully detected; either as single or combined gene; were suggested that there was no correlation between gene and litter size.

4 IDENTIFIKASI MUTASI GEN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN RECEPTOR IB (BMPRIB) DAN GEN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 5 (BMP5) TERHADAP PROLIFIKASI PADA DOMBA GARUT GALUR SUBUR NUR AZIFAH CAKRA DEWI Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 009

5 Judul skripsi Nama NIM : Identifikasi Mutasi Gen Bone Morphogenetic Protein Receptor IB (BMPRIB) dan Gen Bone Morphogenetic Protein 5 (BMP5) terhadap Prolifikasi pada Domba Garut Galur Subur. : Nur Azifah Cakra Dewi : G0558 Menyetujui: Pembimbing I Pembimbing II Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si. Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc NIP NIP Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Dr. drh. Hasim, DEA NIP Tanggal Lulus:

6 PRAKATA Alhamdulillahirobbil alamiin Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada ALLAH SWT atas segala rahmat dan karunianya sehingga penulis diberi kekuatan, kesabaran, dan kemampuan untuk menyelesaikan karya ilmiah ini. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada Bapak Achmad Farajallah dan Bapak Cece Sumantri selaku pembimbing yang telah memberikan saran, kritik, motivasi dan bantuan yang tak terhingga sehingga penelitian ini berjalan dengan lancar. Ucapan terima kasih juga diberikan kepada Ibu Sri Listyowati selaku penguji yang telah memberikan saran dan perbaikan dalam laporan ini dan kepada Ibu Dewi Apriastuti atas ketersediaan sampel darah domba Garut yang telah digunakan dalam penelitian ini. Selain itu, penghargaan penulis sampaikan kepada staf pengajar Zoologi, mba Tini, Pak Adi dan mba Ani selaku staff laboratorium Biosains Hewan atas bantuannya sehingga penelitian ini dapat berjalan dengan lancar. Penulis juga ingin mengucapkan terima kasih kepada Pak Khoirul, Ibu Bibah, kak Erick, kak Ogi, dan kak Wildan atas latihanlatihannya. Kepada temanteman: Hadi, Apria, Vina, Ika R., Ikka E., Sylvi, Jazy, Dina, Diaz, Indra, Ade, mba Kanthi, dan ka Uche atas persahabatan dan kebersamaannya selama penelitian ini. Juga untuk Tia, Dina, Reni, Ayu, dan Sina yang senantiasa memberikan doa dan dukungannya serta kepada temanteman Biologi yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penghargaan terbesar penulis haturkan untuk Ayah, Ibu dan adikku tercinta serta kepada yang tersayang Arief Syaichu Nur Alam atas segala dukungan, kasih sayang yang tercurah dan hantaran do a yang senantiasa diberikan. Penulis berharap semoga laporan masalah khusus ini dapat bermanfaat. Bogor, Agustus 009 Nur Azifah Cakra Dewi

7 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 0 November 987 dari ayah Muchlis Alaydrus dan ibu Nina Susilawati. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Tahun 999 penulis lulus dari MI Nurul Huda Jakarta, tahun 00 lulus dari SMP Negeri Jakarta, kemudian melanjutkan ke SMA Negeri 6 Jakarta. Tahun 005 penulis lulus dari SMA Negeri 6 Jakarta dan di tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa tingkat persiapan bersama Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Penulis kemudian terpilih masuk ke Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Perkembangan Hewan pada tahun ajaran 007/008 serta menjadi asisten praktikum Biologi Dasar, Struktur Hewan dan Pengantar Genetika Molekuler pada tahun ajaran 008/009. Penulis juga pernah mengikuti praktik lapang dengan judul Pengolahan Limbah Cair di PT Goodyear Indonesia, Tbk.

8 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR..... viii DAFTAR LAMPIRAN... viii PENDAHULUAN... Latar Belakang Tujuan BAHAN DAN METODE Bahan... Metode... Ekstraksi dan isolasi DNA... Amplifikasi Gen BMPRIB dan BMP Deteksi Mutasi Titik Kodon ke76 pada Gen BMPRIB... Deteksi Mutasi Titik Kodon ke78 pada Gen BMP5... Visualisasi Produk PCRRFLP dan Hasil Pemotongan dengan Enzim Restriksi... HASIL DAN PEMBAHASAN... Hasil... Amplifikasi Gen BMPRIB... Amplifikasi Gen BMP5... PCRRFLP Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip pada Domba Garut Galur Subur.... PCRSSCP... Pembahasan..... SIMPULAN DAN SARAN. 5 Simpulan Saran... 5 DAFTAR PUSTAKA... 5 LAMPIRAN

9 DAFTAR GAMBAR Halaman. Hasil Amplifikasi Gen BMPRIB dan BMPR Hasil Pemotongan Amplikon Gen BMPRIB oleh AvaII.... Hasil Pemotongan Amplikon Gen BMP5 oleh HinfI Hasil PCR SSCP Gen BMP DAFTAR LAMPIRAN Halaman. Jumlah litter size genotip BMPRIB dan BMP5 pada semua sampel domba Garut Jumlah litter size genotip BMPRIB dan BMP5 pada induk betina domba Garut Ratarata jumlah litter size induk domba Garut dengan gen BMPRIB Tipe normal atau tipe liar Tipe heterozigot... 0 Tipe homozigot... 0

10 PENDAHULUAN Latar Belakang Ovarium pada hewan betina merupakan tempat produksi oosit. Setiap ovarium mengandung oosit dalam jumlah yang sangat banyak, tetapi hanya sedikit sekali dari jumlah oosit tersebut yang dimatangkan dan diovulasikan selama masa reproduktif (Austin & Short 98). Perkembangan oosit pada ovarium dipengaruhi oleh beberapa aktivitas sel lain yang berada di sekitarnya, yaitu selsel folikel, sel granulosa dan zona pelusida (Byskov & Hoyer 988). Pada ovarium mamalia, setiap satu siklus reproduktif normal akan mematangkan satu oosit dominan dalam satu folikel yang mengakibatkan terjadi ovulasi tunggal (hanya dilepaskan satu oosit). Sifat prolifik terjadi jika dalam satu siklus ovarium terdapat lebih dari satu oosit matang kemudian diikuti oleh ovulasi yang juga lebih dari satu. Sifat prolifik pada domba ditunjukkan oleh superovulasi yang akan menghasilkan anak lebih dari seekor per kelahiran. Pertumbuhan dan perkembangan folikel pada ovarium diatur oleh follicle stimulating hormone (FSH) dan luteinizing hormone (LH) (Austin & Short 98). Aktivitas FSH dan LH diatur oleh beragam sinyal yang terintegrasi yang dikelompokkan sebagai oocytedderived growth factor (ODGF). Berdasarkan mekanisme kerjanya sebagai faktor pertumbuhan, beberapa ODGF kemudian dikelompokkan sebagai Tansforming Growth Factor β (TGFβ) (Hanrahan & Owen 00, Davis 005). Lebih lanjut Davis (005) menyebutkan bahwa sifat prolifik pada domba diatur oleh tiga faktor utama, yaitu Bone Morphogenetic Protein Receptor IB (BMPRIB), Bone Morphogenetic Protein 5 (BMP5) dan Growth Differentiation Factor 9 (GDF9). Gen BMPRIB dan gen BMP5 ditemukan terekspresi khusus pada oosit yang sedang berkembang di ovarium beberapa spesies mamalia, mulai dari marsupial (Eckery et al. 00), rodentia (Laitinen et al. 998), ruminansia (Galloway et al. 00) sampai primata (termasuk manusia) (Aaltonen et al. 999). Pematangan oosit dan perkembangan folikel pada domba dipengaruhi oleh keberadaan TGFβ, dalam hal ini TGFβ dapat memodulasi (memperkuat atau melemahkan) kerja dari FSH dan LH pada ovarium. Modulasi kerja FSH dan LH oleh TGFβ ini merupakan faktor penting yang menentukan prolifikasi. Faktor BMPRIB disandikan oleh gen BMPRIB yang terdapat pada kromosom ke6 dan dapat mempengaruhi laju ovulasi dan litter size pada domba. Davis et al. (00) melaporkan bahwa gen ini pertama kali ditemukan pada domba Boorola Merino di Australia dan merupakan gen yang mempengaruhi tingkat kesuburan pada domba tersebut. Gen BMPRIB dikenal juga dengan sebutan Fecundity gene B (FecB). Mutasi pada gen BMPRIB yang terekspresi di oosit dan sel granulosa akan berpengaruh terhadap laju ovulasi dan litter size domba (Wilson et al. 00). Davis (005) melaporkan bahwa individu heterozigot () pada gen BMPRIB akan mengalami kenaikan laju ovulasi sebesar.5 kali. Sedangkan individu homozigot Boorola (BB) pada gen Boorola ini akan mengalami kenaikan laju ovulasi sebesar.0 kali. Gen BMP5 terdapat pada kromosom X. Beberapa mutasi titik pada gen BMP5 dilaporkan mempengaruhi laju ovulasi dan sifat prolifik, antara lain FecX G (Galway) yaitu mutasi titik gen BMP5 daerah ekson ke pada basa ke78 (Hanrahan & Owen 00), FecX B (Belclare) yaitu mutasi titik gen BMP5 daerah ekson ke pada basa ke00 (Hanrahan & Owen 00), dan FecX I (Inverdale) yaitu mutasi titik gen BMP5 daerah ekson ke pada basa ke5 (Bodin et al. 007). Chu et al. (007) melaporkan bahwa pada domba Han, mutasi FecX G bertangggungjawab terhadap stimulasi mitosis sel granulosa dan proses folikulogenesis, sama seperti pada domba Belclare dan Cambridge. Mutasi heterozigot pada gen BMP5 menyebabkan kenaikan laju ovulasi pada domba, sedangkan mutasi homozigot akan menyebabkan kegagalan proses folikulogenesis karena mengalami kerusakan pada ovarium (Davis 005). Domba homozigot mutan akan bersifat steril sehingga peternak komersial harus menghindari terjadi persilangan antara induk betina dan induk jantan yang carrier (heterozigot). Domba Wanaraja adalah salah satu dari domba lokal asli Garut, yaitu dari daerah Cibuluh dan Cikeris di Kecamatan Cikajang dan dari Kecamatan Wanaraja. Domba ini adalah domba Garut galur subur hasil persilangan antara domba lokal Jawa ekor tipis, Merino dan Kaapstadt (Rusyad 977). Persilangan ini membentuk bangsa domba dengan tampilan fisik yang khas. Domba Merino yang digunakan untuk persilangan didatangkan dari Australia pada tahun 860an. Mulsant et al. (00) melaporkan bahwa domba Merino memiliki tingkat ovulasi dan litter size yang tinggi. Begitu pula dengan domba Jawa ekor tipis. Bradford et al. (986) menyatakan bahwa domba lokal Jawa ekor tipis memiliki sifat

11 prolifik. Jadi kemungkinan sifat prolifik yang dimiliki oleh domba Garut Wanaraja ini berasal dari hasil persilangan antara domba lokal Jawa ekor tipis dengan domba Merino. Pada domba Han, tipetipe gen BMP ini dilaporkan mempengaruhi sifat prolifik (Chu et al. 007). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi mutasi dari dua gen anggota TGFβ, yaitu gen BMPRIB dan BMP5 pada domba Garut galur subur. BAHAN DAN METODE Bahan Bahan yang digunakan ialah 56 sampel darah domba Garut Wanaraja yang diawetkan dalam alkohol 70% koleksi Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc (FAPET, IPB) dan sampel darah domba Garut yang ada di Bogor koleksi Dr. Dewi Apriastuti (FAPET IPB). Metode Ekstraksi dan isolasi DNA Ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (989) yang telah dimodifikasi oleh Farajallah et al. (998). Sebanyak ± 00 µl sampel darah dimasukkan ke dalam tabung,5 ml kemudian disentrifuse 500 rpm selama 5 menit. Endapan sel yang diperoleh dicuci dengan bufer TE (0 mm Tris, 0 mm EDTA, ph 8.00), kemudian diendapkan lagi. Endapan sel disuspensikan dalam bufer x STE (00 mm NaCl, 0 mm TrisCl, 0. mm EDTA, PH 8.00), kemudian dilisis dengan SDS % dan 0,5 mg/ml proteinasek. Proses pelisisan dilakukan dalam inkubator bersuhu 55 C selama jam sambil dikocok pelan menggunakan rotator. Tahap selanjutnya memisahkan DNA dari bahan organik lain dengan menambahkan 0 ul larutan NaCl 5M, 00 ul larutan phenol, dan 00 ul CIAA (kloroform : isoamilalkohol = : ) dan dikocok pelan pada suhu ruang selama jam. Selanjutnya, campuran disentrifuse 7000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke tabung baru dalam volume terukur. Molekulmolekul DNA diendapkan untuk dilakukan pemurnian DNA dengan metode pengendapan alkohol, yaitu menambahkan x volume alkohol absolut dan /0x volume NaCl 5M lalu dinkubasi dalam freezer minimal jam. Molekul DNA dipisahkan dari alkohol absolut dengan cara disentrifuse 7000 rpm selama 0 menit. Fase air yang di bagian supernatan dibuang dan endapan DNA dicuci dengan alkohol 70%. Endapan DNA yang telah murni kemudian disuspensikan dalam 80 ul bufer TE. Amplifikasi Gen BMPRIB dan BMP5 Amplifikasi dilakukan secara in vitro melalui teknik PCR (polymerase chain reaction) menggunakan pasangan primer AF8 (5 GTCGCTATGGGGAAGTTTGG ATG) dan AF85 (5 CAAGATGTTTTC ATCCTCATCAACACGGTC) untuk gen BMPRIB (Chu et al. 007). Pasangan primer AF8 dan AF85 didesain untuk mengamplifikasi ruas gen BMPRIB pada daerah ekson ke6 sepanjang 0 pb. Sedangkan untuk gen BMP5 menggunakan pasangan primer AF86 (5 CACTGTCTT CTTGTTACTGTATTTCAATGAGC) dan AF87 (5 GATGCAATACTGCCTGCTTG). Pasangan primer AF86 dan AF87 didesain untuk mengamplifikasi ruas gen BMP5 pada daerah ekson ke sepanjang pb. Pereaksi untuk amplifikasi PCR dalam volume 5 μl terdiri atas sampel DNA sekitar 50 ng, masingmasing nm primer, 0, nm dntps, 50 nm MgCl, dan 0.75 unit Taq polymerase beserta bufernya (RBC). Reaksi amplifikasi PCR dilakukan menggunakan mesin thermocycler TAKARA MP dengan kondisi untuk kedua jenis gen adalah predenaturasi 9 0 C selama 5 menit, diikuti 0 siklus yang terdiri dari denaturasi 9 0 C menit, penempelan primer 58 0 C menit, dan pemanjangan 7 0 C menit, dan diakhiri dengan pemanjangan akhir 7 0 C selama 0 menit (Patet et al. 006). Deteksi Mutasi Titik Basa ke76 Gen BMPRIB Deteksi mutasi gen BMPRIB dilakukan melalui teknik RFLP (restriction fragment length polymorphism) menggunakan enzim restriksi AvaII [G GACC]. Berdasarkan Chu et al. (007), mutasi gen BMPRIB terjadi pada basa ke76, yaitu substitusi basa nitrogen A menjadi G yang akan mengubah asam amino glutamin menjadi arginin. Deteksi Mutasi Titik Basa ke78 Gen BMP5 Deteksi mutasi gen BMP5 dilakukan melalui teknik RFLP (restriction fragment length polymorphism) menggunakan enzim restriksi Hinf [G ANTC]. Berdasarkan Chu et al. (007), mutasi gen BMP5 terjadi pada basa ke78 sebagai substitusi basa nitrogen C menjadi T. Substitusi ini menyebabkan terbentuk kodon stop di tempat asam glutamat pada residu asam amino ke9 yang disebut sebagai codon stop premature.

12 Visualisasi Produk PCRRFLP dan Hasil Pemotongan dengan Enzim Restriksi Visualisasi amplikon dan produk PCR RFLP dilakukan menggunakan metode polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang dijalankan pada tegangan 50 V selama 0 menit yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak menurut Tegelstorm (986). HASIL Amplifikasi Gen BMPRIB Hanya 5 dari 70 sampel yang berhasil diamplifikasi. Amplifikasi menggunakan pasangan primer AF8 dan AF85 menghasilkan pita tunggal berukuran 0 pb (Gambar A). Ruas gen BMPRIB ekson ke6 yang teramplifikasi sesuai dengan perkiraan dari desain primer sebesar 0 pb. Amplifikasi Gen BMP5 Amplifikasi menggunakan pasangan primer AF86 dan AF87 menghasilkan pita tunggal berukuran pb untuk semua sampel (Gambar B). Ruas gen BMP5 ekson ke yang teramplifikasi sesuai dengan perkiraan dari desain primer, yaitu sebesar pb. Gambar Hasil pemotongan amplikon gen BMPRIB oleh AvaII (M= marker 00 pb, = homozigot tipe liar, = heterozigot, dan BB= homozigot mutan). Hasil pemotongan amplikon dari gen BMP5 menunjukkan bahwa semua sampel terpotong pada situs HinfI menjadi pb dan 0 pb. Hal ini diterjemahkan bahwa ruas ekson ke gen BMP5 adalah normal atau tipe liar dengan genotip (Gambar ). Jika hasil pemotongan amplikon terbentuk pita sepanjang pb, pb dan 0 pb, menunjukkan bahwa ruas ekson ke gen BMP5 adalah heterozigot atau terjadi mutasi dengan genotip F+. Sedangkan jika hasil pemotongan amplikon hanya terbentuk pita sepanjang pb, menunjukkan bahwa amplikon BMP5 tidak terpotong karena tidak mempunyai situs pemotongan HinfI, ruas ekson ke gen BMP5 memiliki genotip FF. Dengan demikian, 00% sampel yang teridentifikasi adalah normal atau tipe liar (genotip ). Gambar Hasil amplifikasi Gen BMPRIB (A) dan gen BMP5 (B). (M = Marker 00 pb,,, = sampel domba Garut Wanaraja betina) PCRRFLP Pemotongan amplikon gen BMPIRIB menggunakan enzim restriksi AvaII menunjukkan pita DNA dengan ruas ekson ke6 gen BMPRIB tipe normal atau tipe liar (genotipe ) sebanyak 9 sampel dan tipe homozigot mutan (genotipe BB) sebanyak 5 sampel, sedangkan sampel lainnya tipe heterozigot (genotipe ) (Gambar ). Gambar Hasil pemotongan amplikon gen BMP5 oleh Hinf I (M= 00 pb, = wild type) Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip pada Domba Garut Galur Subur Pada gen BMPRIB, frekuensi alel B adalah 6% dan alel adalah 5%. Frekuensi genotip BB,, dan berturutturut adalah %, 69%, dan 0% (Lampiran ). Sedangkan untuk gen BMP5, frekuensi alel F adalah 0 dan alel + adalah sehingga semua sampel memiliki genotip. (Lampiran ). Hasil kombinasi dari kedua gen diperoleh kombinasi genotip memiliki frekuensi

13 yang paling tinggi, yaitu 69%. Kombinasi genotip memiliki frekuensi 0% dan kombinasi genotip BB memiliki frekuensi terendah, yaitu %. PCRSSCP Atas dasar bahwa ruas ekson ke gen BMP5 ditemukan monomorfik makaidentifikasi mutasi dilanjutkan dengan metode single strand conformation polymorphism (SSCP). Metode SSCP merupakan metode yang handal untuk mendeteksi mutasi pada suatu ruas DNA meskipun hanya satu basa. Pada metode ini DNA produk berutas ganda didenaturasi menjadi utas tunggal dalam bufer formamida ( mg/ml xylene cyanol, mg/ml bromthymol blue, 0 mm EDTA dan formamida 80%) dengan perlakuan panas 9 0 C, kemudian didinginkan mendadak dalam icebath. Dengan demikian, molekul DNA utas ganda yang sudah terdenaturasi tetap berada dalam kondisi berutas tunggal. Utas tunggal yang terbentuk akan membentuk lipatan (konformasi). Perbedaan konformasi akan menyebabkan perbedaan diameter molekul utas tunggal, sehingga terjadi perbedaan pola migrasi molekul pada gel poliakrilamid. Rasio antara akrilamid dan bisakrilamid pada gel poliakrilamid dibuat menjadi 59:. Dengan rasio tersebut, poripori gel menjadi lebih memanjang sehingga bisa memisahkan DNA berdasarkan bentuknya. Pada hasil identifikasi ragam gen BMP5, ditemukan konformasi yang saling berbeda (Gambar ). Gambar Pola pita SSCP gen BMP5 di atas gel poliakrilamid % PEMBAHASAN Pada penelitian ini ditemukan bahwa domba Garut galur subur memiliki mutasi FecB pada gen BMPRIB, sehingga dapat diduga berdasarkan silsilah hasil persilangan bahwa domba Garut galur subur memiliki nenek moyang yang sama dengan domba Boorola Merino, Garole, Han dan Hu. Mutasi FecB pada gen BMPRIB ditemukan pada domba Boorola Merino (Australia), domba Garole (India), domba Han (China) dan domba Hu (China). Genotipe gen BMPRIB domba Garut galur subur yang berhasil diidentifikasi adalah homozigot mutan BB dan heterozigot. Davis (005) melaporkan bahwa domba yang mengalami mutasi FecB pada gen BMPRIB akan mengalami kenaikan laju ovulasi dan litter size. Domba dengan mutasi FecB akan memiliki sel granulosa yang lebih sensitif terhadap FSH, sehingga sel tersebut semakin aktif membelah dan menyebabkan folikel ovarium menjadi cepat dewasa dan matang. Jumlah sel granulosa yang banyak di dalam folikel ovarium menandakan semakin banyak pula folikel ovarium dominan yang terbentuk kemudian dapat menyebabkan terjadi superovulasi (dilepaskan lebih dari satu oosit) (Austin & Short 98). Sifat prolifik terjadi jika semua oosit yang dilepaskan berhasil dibuahi sehingga dapat dihasilkan anak yang lebih dari satu (Wilson et al. 00). Pada penelitian ini ditemukan bahwa semua sampel yang diidentifikasi memiliki gen BMP5 tipe normal atau tipe liar (genotip ), namun individu betina yang dijadikan sebagai sampel memiliki tipe kelahiran dari tipe sampai 5, yaitu bisa menghasilkan sampai 5 anak sekaligus dalam sekali kelahiran (Lampiran ). Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa semua sampel domba Garut yang diidentifikasi tidak mengalami mutasi pada gen BMP5. Hal tersebut sesuai bila dilihat dari sejarah penyebarannya, domba Garut merupakan hasil perkawinan silang antara domba lokal Jawa ekor tipis dan domba Merino (Rusyad 977). Domba lokal Jawa ekor tipis adalah domba prolifik yang memiliki laju ovulasi dan litter size yang tinggi. Domba ini mengalami mutasi FecB pada gen BMPRIB namun tidak ditemukan mutasi FecX pada gen BMP5 (genotip ). Domba Merino adalah domba prolifik galur Boorola yang berasal dari Australia (Bindon et al. 98). Pada domba Merino juga ditemukan mutasi FecB pada gen BMPRIB namun tidak ditemukan mutasi FecX pada gen BMP5 (genotip ). Jika terjadi perkawinan silang antara kedua domba ini maka akan dihasilkan keturunan normal atau tipe liar. Terdapat beberapa jenis mutasi gen BMP5 pada domba, diantaranya mutasi FecX I (Inverdale), FecX H (Hanna), FecX G (Gallway), FecX B (Belclare), FecX L (Lacaune), dan setiap mutasi yang terjadi dapat mempengaruhi kenaikan atau penurunan laju ovulasi dan litter size pada domba. Hanrahan & Owen (00) melaporkan bahwa domba Cambridge dan Belclare yang mengalami mutasi homozigot

14 untuk gen FecX G bersifat steril karena mengalami kegagalan dalam perkembangan folikel ovariumnya. Sedangkan domba mutasi heterozigot untuk gen FecX G dan FecX B bersifat fertil dan mengalami kenaikan laju ovulasi. Sehingga individu heterozigot (genotip F+) dapat menghasilkan anak dengan jumlah yang lebih banyak daripada individu normal atau tipe liar (genotip ). Selain itu, hasil identifikasi mutasi pada gen BMP5 tidak ditemukan pada individu domba Garut tipe homozigot mutan (genotip FF) yang menyebabkan domba bersifat steril dan mengalami kegagalan dalam perkembangan folikelnya. Hal tersebut karena semua sampel domba betina yang digunakan adalah fertil sehingga genotip FF memang tidak ada pada domba Garut yang diidentifikasi. Hasil PCR SSCP menunjukan bahwa gen BMP5 memiliki konformasi yang saling berbeda pada DNA tunggalnya. Gen BMP5 sebenarnya beragam (Gambar ), hanya saja keragaman dari gen ini tidak mempengaruhi sifat prolifik pada domba garut. Berdasarkan hasil penelitian ini, sampel domba garut yang digunakan memiliki sifat prolifik. Namun pada domba Garut mutasi hanya terjadi pada gen BMPRIB, dan tidak pada gen BMP5. Sifat prolifik pada domba garut yang diidentifikasi dapat diduga bukan dipengaruhi oleh gen BMP5, melainkan oleh gen BMPRIB. Kebanyakan anggota dari superfamily Transforming Growth Factor β (TGFβ), termasuk BMPRIB dan BMP5, secara biologis aktif dalam bentuk dimer. Namun belum diketahui dengan jelas bentuk dimer yang aktif, dalam bentuk homodimer (BMPRIBMPRIB dan BMP5BMP5), atau heterodimer (BMPRIBMP5). Berdasarkan hal tersebut, maka kombinasi mutasi antar gen BMPRIB dan BMP5 diduga dapat memunculkan sifat prolifik yang lebih kuat pada domba. Namun hasil deteksi mutasi pada kedua gen tidak sesuai jika dikorelasikan dengan data litter size pada domba Garut yang diidentifikasi (Lampiran ). Semua genotipe yang berhasil dideteksi, baik sebagai gen tunggal maupun kedua gen dikombinasikan, tidak berkorelasi dengan jumlah anak per kelahiran. Selain faktor genetik, faktor nutrisi, faktor umur dan faktor keberhasilan dalam fertilisasi (pembuahan) juga dapat mempengaruhi baik atau tidaknya kemampuan domba untuk bereproduksi. SIMPULAN Domba Garut Wanaraja dan Bogor memiliki mutasi FecB pada gen BMPRIB, sama seperti yang ditemukan pada domba Boorola Merino. Namun tidak ditemukan mutasi FecX pada gen BMP5. Sifat prolifik pada domba Garut galur subur diduga bukanlah dipengaruhi oleh gen BMP5, melainkan gen BMPRIB. SARAN Sifat prolifik disebutkan diatur oleh gengen utama BMPRIB dan BMP5. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen tunggal BMP5 kurang baik sebagai marker untuk sifat prolifik. Kombinasi mutasi antar gen dapat memunculkan sifat prolifik yang lebih baik. Untuk itu kombinasi gen yang disarankan adalah tidak melibatkan gen BMP5. DAFTAR PUSTAKA Aaltonen J, et al Human growth differentiation factor9 (GDF9) and its novel homolog GDF9B are expressed during early folliculogenesis. J Clin Endocrinol Metab 8: Austin CR, Short RV. 98. Reproduction in Mammals. Ed kenew York : Cambridge University Press. Bindon BM, Hilliard MA, Piper LR. 98. Reproductive endocrinology of prolific sheep: studies of the Booroola Merino. In: Land RB, Robinson DW, editor. Genetics of Reproduction in Sheep. London: Butterworths. pp. 76. Bodin L, et al A novel mutation in the bone morphogenetic protein 5 gene causing defective protein secretion is associated with both increased ovulation rate and sterility in Lacaune sheep. Endocrinology 8 ():9 00. Bradford GE, et al Reproduction in Javanese sheep: evidence for a gene with large effect on ovulation rate and litter size. J Anim Sci 6:8. Byskov AG, Hoyer PE Embryology of mammalian gonads and ducts. In: Knobil E, Neill J, editor. The physiology of reproduction. New York: Raven Press, Ltd. pp Chu MX, Sang JY, Wang L Mutations in BMPRIB and BMP5 genes are associated with litter size in Small Tailed Han sheep (Ovis aries). J Anim Sci 85:59860.

15 Davis GH, et al. 00. DNA tests in prolific sheep from eight countries provide new evidence on origin of the Booroola (FecB) mutation. Biol Reprod 66: Davis GH Major genes affecting ovulation rate in sheep. Genet Sel Evol 7:S S. Eckery DC, et al. 00. Expression of mrna encoding growth differentiation factor 9 and bone morphogenetic protein 5 during follicular formation and growth in a marsupial, the brushtail possum (Trichasurus vulpecula). Mol Cell Endocrinol 9:5 6. Farajallah A, Suryobroto B, Takenaka O Nucleotide Sequence of Whole Mitochondrial DNA of a Softshelled Turtle, Dogania, and PCR RFLP Analyses of Cytochrome b Gene. Proceeding of the Tokyo International Forum on Conservation and Sustainable. Japan, Agustus 998 Japan: New Energy and Industrial technology Development Organization (NEDO) and Japan Bioindustry Association (JBA). pp Galloway SM et al. 00. Mutations in an oocytederived growth factor gene (BMP5) cause increased ovulation rate and infertility in a dosagesensitive manner. Nat Genet 5:798. Hanrahan JP, Owen JB. 00. Variation and repeatability of ovulation rate in Cambridge ewes. Anim Prod 0:59. Laitinen M, et al A novel growth differentiation factor9 (GDF9) related factor is coexpressed with GDF9 in mouse oocytes during folliculogenesis. Mech Dev 78:5 0. Mulsant P, et al. 00. Mutation in bone morphogenetic protein receptorib is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes. Proc Natl Acad Sci. USA 98: Patet RK, et al Lack of carriers of citrullinaemia and DUMPS in Indian Holstein cattle. J Appl Genet 7 ():9. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T Molecular cloning: A Laboratory Manual. Ed ke8. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Rusyad A Sheep breeds of Indonesia. Report for FAO/UNEP Project Conservation of Animal Genetic Resources. 0 pp. TS. Tegelstrom H Mitochondrial DNA in natural populations: An improved routine for the screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Electrophoresis 7:69. Wilson T, et al. 00. Highly prolific Boorola sheep have a mutation in intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor (ALK6) that is expressed in both oocytes and granulose cells. Biol. Reprod. 6: 55.

16 LAMPIRAN

17 Lampiran. Jumlah litter size genotip BMPRIB dan BMP5 pada semua sampel domba Garut No Sampel Litter size (anak) BMPRIB BMP S S S S S5 S6 S7 S8 S9 D D D D D5 D6 D7 D8 D9 D0 D D D D D5 D6 D7 D8 D9 D0 D D 5 BB BB BB

18 D D A A A A A A5 A6 A7 A8 A9 A0 A A AT5 AT5 AT55 A56 A67 A78 A89 A9 A9 A M M M7 M5 M8 AS AS AS AS6 AS0 AS BB BB

19 68 AS 69 AS7 70 AS9 +

20 Lampiran. Jumlah litter size genotip BMPRIB dan BMP5 pada induk betina domba Garut No Sampel No sampel Litter size (anak) D 0 D D D 5 D5 6 D6 5 7 D7 6 8 D8 7 9 D9 8 0 D0 9 D 0 D 5 D D 5 D5 6 D6 5 7 D7 6 8 D8 7 9 D9 8 0 D0 9 D 0 D D D BMPRIB BB BB BB BMP5

21 Lampiran. Ratarata jumlah litter size induk domba Garut dengan gen BMPRIB. Tipe normal atau tipe liar No Sampel betina No sampel Litter size BMPRIB D8 D5 D 7 Ratarata litter size.5. Tipe heterozigot No Sampel betina No sampel Litter size BMPRIB 5 6 D D D5 D6 D9 D D 0 8 D Ratarata litter size.9. Tipe homozigot No Sampel betina No sampel Litter size BMPRIB D D D 5 BB BB BB Ratarata litter size.

22