HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 HASIL DAN PEMBAHASAN Profil Hasil Karakterisasi Marka SSR Saat ini marka SSR (penanda mikrosatelit) telah digunakan secara luas dalam analisis yang berbasis molekuler. Marka tersebut merupakan salah satu penciri genetik yang ideal untuk analisa genom karena jumlahnya yang cukup banyak dalam genom (Hoetzel 1998), selain itu marka SSR bersifat kodominan dan dapat mendeteksi variasi alel yang tinggi (Wu & Tanskley 1993; Panaud et al 1996). Marka SSR telah banyak digunakan pada berbagai studi keragaman genetik (Blair et al. 1999), identifikasi varietas tanaman (Moeljopawiro 2007; Pabedon et al ) dan uji kemurnian benih hibrida (Tamilkumar et al 2009; Liu et al 2007). Informasi detail dari marka SSR yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Table 3. Tabel 3 Nama lokus, sekuen basa berulang, kisaran basa dan jumlah alel dari 16 marka SSR yang digunakan Kode Lokus Sekuen basa Kisaran basa Jumlah alel berulang (bp) Total Polimorfis RM104 (GA) RM154 (GA) RM164 (GT) 16 TT(GT) RM206 (CT) RM209 (CT) RM215 (CT) RM219 (CT) RM250 (CT) RM263 (CT) RM276 (AG) 8 A 3 (GA) RM335 (CTT) RM346 (CTT) RM464 (AT) RM475 (TATC) RM551 (AG) RM570 (AG) Jumlah Sumber :

2 24 Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari 16 pasang primer yang digunakan dua primer tidak menghasilkan pita pada gel elektroforesis. Tidak munculnya pita dapat terjadi akibat optimasi yang tidak sesuai sehingga tidak terjadi amplifikasi saat proses PCR. Sebanyak total 41 alel dihasilkan dari 14 primer yang teramplifikasi, dengan rata-rata jumlah alel 2.92 per lokus. Persentase lokus polimorfik adalah 50% dimana terdapat 7 primer yang bersifat polimorfis dengan jumlah alel yang polimorfis sebanyak 22. Rata-rata jumlah alel per lokus polimorfik adalah Tingkat Polimorfisme (Polymorphism Information Content, PIC) Galur Tetua Tingkat polimorfisme (PIC) diperlukan untuk memilih marka yang dapat membedakan antar galur/tetua yang digunakan. Kuantifikasi PIC adalah jumlah alel yang dapat dihasilkan oleh suatu marka dan frekuensi dari tiap alel dalam set genotipe yang diuji. Nilai polimorfisme ditentukan oleh frekuensi kemunculan alelnya (DeVicente & Fulton 2003). Marka yang menghasilkan alel lebih sedikit memiliki kemampuan yang lebih kecil untuk membedakan sampel yang diuji. Nilai PIC yang tinggi ditunjukan pada marka yang menghasilkan banyak alel. Nilai PIC merupakan standar yang baik untuk mengevaluasi marka genetik (Emrani et al 2011). Marka polimorfis dan informasi tingkat polimorfisme dari marka yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 4. Nilai PIC tertinggi dari marka-marka yang polimorfis ditunjukan oleh RM206 (0.783) dan terendah adalah RM346 (0.195). Nilai PIC diklasifikasikan menjadi tiga kelas yaitu PIC>0.5 adalah sangat informatif, 0.25>PIC>0.5 termasuk sedang dan PIC<0.25 memiliki nilai informatif yang rendah (Botstein et al. 1980). Lima marka termasuk dalam kategori sangat informatif (PIC>0.5), satu marka memiliki nilai PIC sedang yaitu RM263 dan satu marka memiliki tingkat polimorfisme rendah yaitu RM346 (0,195). Nilai PIC ratarata dari tujuh marka untuk delapan galur tetua adalah Dari keseluruhan 16 marka yang digunakan tujuh marka monomorfis dan dua marka tidak menunjukkan hasil amplifikasi (Tabel 3). Marka yang monomorfis memiliki nilai PIC=0.

3 25 Tabel 4 Marka SSR polimorfis dan tingkat polimorfisme (PIC) Kode Lokus Total Jumlah alel Polimorfis Tingkat polimorfisme (PIC) RM RM RM RM RM RM RM Rata-rata Hasil karakterisasi berdasarkan marka SSR, menunjukan koefisien kemiripan genetik dari persilangan galur tetua hibrida berkisar antara atau pada jarak genetik (Tabel 5). Semakin besar nilai koefisien kemiripan genetik antara dua galur berarti semakin besar kemiripan genetiknya. Tabel 5 Jarak genetik galur tetua dari lima varietas hibrida Varietas Hibrida Tetua Kemiripan genetik Jarak genetik Hipa 6 IR A x B 8094 F Hipa 7 IR A x IR Hipa 8 IR A x BP Hipa 9 IR A x S4325 A Hipa 10 IR A x Bio Analisis kelompok (cluster analysis) terhadap galur tetua menggunakan tujuh marka SSR polimorfis menghasilkan dendogram UPGMA dari delapan galur tetua dari lima varietas hibrida (Gambar 3). Kedelapan tetua yang dianalisis dapat dibedakan dengan jelas berdasarkan marka mikrosatelit. Pada tingkat kesamaan 69% terbentuk tiga kelompok, yaitu kelompok-1 terdiri dari IR62829A, kelompok-2 terdiri dari B8094F dan Bio-9 dan kelompok-3 terdiri dari IR58025A, BP51-1, IR68897A, IR40750 dan S4325A.

4 26 Gambar 3 Dendogram analisis UPGMA delapan tetua hibrida padi berdasarkan kemiripan genetik dengan menggunakan tujuh marka SSR polimorfis. Tetua dari Hipa 6 memiliki nilai jarak genetik 0.44 dan berada pada kelompok yang berbeda berdasarkan dendogram kemiripan genetik (Gambar 3). Galur mandul jantan IR62829A berada pada kelompok-1 berbeda dengan restorer B8094F yang beradaa pada kelompok-2. Tetua Hipa 10 juga berada pada kelompok yang berbeda dimana GMJ IR68897A berada pada kelompok-3 dan restorer Bio-9 pada kelompok-2. Jarak genetik antara tetua Hipa 10 tersebut adalah Beberapa tetua dari hibrida yang diuji berada dalam kelompok yang sama. Tetua Hipa 7 dan Hipa 9 memiliki jarak genetik 0.20 dan Jarak genetik terdekat ditunjukan pada tetua Hipa 8 yaitu sebesar Galur Mandul Jantann IR58025A berada kelompok yang sama dengan restorer BP51-1. Keunggulan padi hibrida berupa heterosis, diharapkan muncul terutama pada karakter potensi hasil. Heterosis sering diistilahkan sebagai vigor hibrida, dimana turunan pertama suatu persilangan lebih unggul dibandingkan galur tetuanya (Pannuthurai et al. 1984; Yuan et al. 2003). Secara teori, heterosis akan meningkat bila jarak genetik dari kedua tetua lebih jauh (Melchinnger & Gumber 1998). Potensi dan rata-rata hasil dari hibrida yang digunakan memiliki nilai yang hampir sama yaitu berkisar t/ha untuk potensi hasil dan t/ha untuk rata-rata hasil (Lampiran 5 9). Nilai jarak genetik tertinggi yaitu tetua Hipa 6 tidak memiliki potensi dan rata-rata hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan tetua Hipa 8 yang memiliki nilai jarak genetik terendah

5 27 Jarak genetik yang lebih dekat belum tentu menghasilkan hasil persilangan yang lebih tinggi. Hasil penelitian Zainal & Amirhusin (2005) pada galur-galur tetua padi hibrida menunjukan bahwa jarak genetik yang lebih dekat belum tentu menghasilkan turunan dengan tingkat produktivitas yang lebih tinggi. Efek heterosis pada padi juga dikendalikan oleh banyak gen, sehingga heterosis tidak cukup diterangkan hanya melalui jarak genetik. Nilai jarak genetik belum secara tegas memprediksi bobot biji, nilai daya gabung khusus dan heterosis (Pabedon et al. 2009) Penentuan jarak genetik antar tetua juga dipengaruhi oleh jenis dan jumlah marka genetik yang digunakan. Semakin banyak jumlah populasi dan marka yang diuji maka hasil yang didapatkan akan semakin akurat (Tsegaye et al. 1996). Pada penelitian kali ini pengelompokan keseragaman genetik hanya menggambarkan jarak genetik dari delapan tetua hibrida dengan tujuh marka SSR polimorfis. Bila digunakan marka yang lebih banyak dan berbeda dapat saja dihasilkan pengelompokan genetik yang berbeda. Marka SSR Spesifik yang Dapat Membedakan Tetua Hibrida Sidik jari DNA berdasarkan PCR telah menjadi metode yang sering digunakan untuk karakterisasi plasma nutfah, studi penyebaran dan uji kemurnian varietas. Sejumlah marka DNA saat ini telah tersedia untuk dapat digunakan sebagai sidik jari, maupun untuk marker assisted selection (MAS). Marka mikrosatelit merupakan marka yang sering digunakan karena melimpah, bersifat kodominan dan selain itu juga mudah digunakan ( McCouch et al. 2002). Melalui penelitian ini telah didapatkan beberapa marka SSR yang memiliki potensi untuk membedakan antara tetua padi hibrida (Tabel 6). Tabel 6 Marka SSR polimorfis untuk tetua hibrida yang digunakan Varietas Hibrida Tetua Marka SSR polimorfis Hipa 6 IR A x B 8094 F RM 346, RM 335, RM 570, RM 206 Hipa 7 IR A x IR RM 206, RM 335 Hipa 8 IR A x BP 51-1 RM 263, RM 206 Hipa 9 IR A x S4325 A RM 276, RM 335 Hipa 10 IR A x Bio-9 RM 206, RM 276, RM 263

6 28 Berdasarkan hasil elektroforesis, diperoleh tujuh marka SSR polimorfis dari keseluruhan 16 marka SSR yang digunakan. Enam marka dapat digunakan untuk membedakan galur tetua dari lima varietas padi hibrida yang dipelajari. Marka SSR RM164 merupakan marka polimorfis tetapi tidak dapat digunakan untuk membedakan galur tetua dari varietas padi hibrida yang diuji, sehingga walau marka tersebut memiliki nilai PIC yang cukup tinggi (0.555) tetapi tidak polimorfis untuk untuk dapat membedakan galur mandul jantan dengan restorernya (Gambar 4). Gambar 4 Penampilan pita DNA menggunakan marka SSR RM164 Marka SSR yang dapat menghasilkan pita polimorfis pada galur tetua hibrida, dapat digunakan untuk mengidentifikasi tetua hibrida dan hibrida turunanya. Marka-marka polimorfis tersebut dapat digunakan untuk uji kemurnian benih padi hibrida. Beberapa marka polimorfis untuk identifikasi Hipa 6, Hipa 7, Hipa 8, Hipa 9 dan Hipa 10 dapat dilihat pada Gambar 5 dan 6.

7 29 (a) (b) (c) (d) Gambar 5 Penampilan pita polimorfis dari tetua hibrida untuk marka SSR RM346 (a), RM570 (b) dan RM206 (c)(d)

8 30 (a) (b) Gambar 6 Penampilan pita polimorfis dari tetua hibrida untuk marka SSR RM263 (a) dan RM276 (b) Sterilitas Galur Mandul Jantan Adanya campuran pada benih hibrida akan dapat menurunkan produksi. Setiap adanya campuran sebesar 1 % pada benih galur mandul jantan akan dapat mengakibatkan penurunan produksi sebesar 100 kg/ha (Mao et al.1996). Peraturan perbenihan di India mensyaratkan kemurnian benih untuk padi hibrida adalah 98% (Verma 1996), sedangkan di China tingkat kemurnian benih untuk padi hibrida yang diperbolehkan minimal adalah 96 % (Yan 2000). Di Indonesia, sertifikasi benih hibrida mensyaratkan kemurnian benih 98 % dan campuran varietas lain yang diperbolehkan maksimal 0.5 % (Direktorat Perbenihan 2009). Untuk dapat menjamin kemurnian dari benih hibrida yang dihasilkan diperlukan tingkat kemurnian dari tetua hibrida yang cukup tinggi, tingkat kemurnian yang sebaiknya dimiliki oleh galur tetua adalah sekitar 99 % (Yashitola et al 2004; Direktorat Perbenihan 2009). Salah satu sebab adanya campuran yang paling umum selama proses produksi benih hibrida adalah tidak murninya galur pelestari saat memproduksi galur mandul jantan. Sebelum memasuki stadia berbunga akan sangat sulit membedakan antara galur pelestari dengan galur mandul jantannya karena keduanya merupakan isonuclear sehingga memiliki morfologi yang sangat mirip. Penyebab lain adanya campuran pada galur mandul jantan dapat disebabkan

9 31 oleh terjadinya selfing yang diakibatkan dari tetua galur mandul jantan yang fertil. Kontaminasi pada galur pelestari atau mandul jantan dapat berakibat pada penurunan hasil dan buruknya pertanaman di lapang. Kemungkinan adanya campuran pada proses produksi benih padi hibrida, diminimalkan dengan melakukan isolasi dan rouging mulai dari produksi tetua hingga produksi benih F 1 hibridanya. Uji sterilitas malai dilakukan untuk melihat kemungkinan terjadinya kontaminasi yang diakibatkan dari tetua mandul jantan yang tidak steril. Malai galur mandul jantan dari hibrida yang diuji disungkup dengan menggunakan kantung kertas dan diamati tingkat sterilitasnya (Tabel 7). Tingkat sterilitas malai dibagi menjadi beberapa tingkatan yaitu steril seluruhnya (100 %), tingkat sterilitas tinggi (99,0-99,9 %), steril (95,0-98,9), parsial steril (70,0-94,9%) dan parsial fertil s/d fertil (<70%) (IRRI 2011). Rata-rata persentase sterilitas malai dari ketiga galur mandul jantan masih termasuk dalam kategori steril karena masih diatas 95 %. Galur mandul jantan dikategorikan sebagal galur yang steril bila memiliki tingkat sterilitas lebih besar 95%, bila tingkat sterilitasnya lebih kecil dari itu maka dianggap sebagai galur yang tidak stabil. Tabel 7 Status sterilitas malai beberapa galur mandul jantan padi Galur Mandul Jumlah Sterilitas malai (%) Jantan sampel Rata-rata* Kisaran IR58025A ± 1, ,0 IR62829A ± 0, ,0 IR68897A ± 0, ,0 Keterangan : *) x ± sd Gabah isi masih ditemukan pada beberapa malai dari tiap mandul jantan yang diuji. Gabah isi menunjukkan bahwa peluang terjadinya penyerbukan sendiri masih ada. Tanaman digolongakan sebagai tanaman fertil bila masih ditemukan adanya gabah isi pada malai yang dihasilkan. Pada populasi tanaman yang diamati, galur mandul jantan IR58025A, IR62829A dan IR68897A menunjukkan tanaman fertil berturut-turut sebesar 4%, 8%, 2.7% (Tabel 8). Persentase tanaman fertil tertinggi ditunjukan oleh galur mandul jantan IR62829A yang merupakan tetua GMJ untuk Hipa 6 dan terendah pada IR68897A (GMJ untuk Hipa 10). Tingkat fertilitas dari galur mandul jantan,selain dilihat dari populasi juga diamati pada tingkat individu malai. Persentase gabah isi per malai dihitung hanya pada malai yang fertil. Pada IR58025A nilai rata-rata gabah isi per malai masih tinggi, yaitu 5.5% dan masih terdapat individu tanaman

10 32 yang menghasilkan gabah isi per malai hingga 13.6 %. Untuk IR62829A dan IR68897A rata-rata persentase gabah isi per malai yang dihasilkan cukup rendah, yaitu masih di bawah 3%. Kisaran gabah isi per malai nya pun masih dibawah IR58025A. Tabel 8 Rata-rata persentase fertilitas beberapa galur mandul jantan padi. Galur Mandul Jantan Tanaman Fertil (%) Gabah isi/malai* (%) Kisaran gabah isi/malai* (%) IR58025A IR62829A IR68897A Ket : *)persentase gabah isi hanya dihitung dari malai fertil yang ditemukan Tanaman dianggap sebagai tanaman fertil bila terdapat gabah isi pada malai yang dihasilkan. Galur mandul jantan yang digunakan dalam produksi benih padi hibrida seharusnya menghasilkan 100% malai yang mandul pada satu rumpun tanaman. Adanya gabah isi berpotensi menghasilkan gabah isi pada galur mandul jantan generasi berikutnya dan menyebabkan kontaminasi pada proses produksi benih F 1 hibrida. Dalam kegiatan produksi benih, kegiatan pemurnian perlu dilakukan untuk mendapatkan galur mandul jantan yang baik dimana tingkat sterilitasnya mencapai 100%. Pada kegiatan pemurnian dilakukan quality control pada galur mandul jantan. Proses quality control yang dimaksud adalah dilakukan penyungkupan minimal pada dua malai kemudian diamati gabah isi per malainya. Individu tanaman yang masih menghasilkan gabah isi, tidak digunakan untuk kegiatan produksi benih. Untuk mempertahankan kemurnian dari galur mandul jantan, metode terbaik yang digunakan adalah dengan melakukan silang balik berkelanjutan yang dilakukan secara manual (Youssef 2011). Uji Kemurnian Genetik Benih Padi Hibrida Menjaga kebenaran dan keseragaman varietas merupakan hal yang sangat penting untuk mempertahankan mutu padi hibrida, oleh karena itu uji kemurnian benih sangat dibutuhkan sebelum benih tersebut didistribusikan dan ditanam secara luas. Identifikasi varietas menjadi sangat penting bila dikaitkan dengan perlindungan varietas tanaman dan hak kekayaan intelektual. Teknologi marka molekuler dapat menjadi dukungan yang kuat bagi pemulia dan

11 33 perusahaan penghasil varietas karena dapat menyediakan identifikasi atau bukti yang diakui secara hukum. Oleh karena itu diperlukan marka-marka yang dapat mengidentifikasi kebenaran dan kemurnian dari suatu varietas. Identifikasi kebenaran suatu genotipe tanaman dengan menggunakan marka yang tidak terpaut merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk menilai kemurnian benih hibrida dan satu penanda yang polimorfik sudah cukup untuk pengujian kemurnian benih (Yashitola 2002) Sifat marka SSR yang polimorfis dapat mendeteksi individu yang heterozigot, karena sifatnya itu maka marka SSR dapat digunakan untuk pengujian kemurnian genetik benih padi hibrida. Saat alel polimorfis dapat terditeksi antara tetua hibrida yaitu galur mandul jantan (A) dan restorernya (R), maka diharapkan kedua alel tersebut akan muncul pada pada individu F 1 hibridanya. Pada penelitian ini uji kemurnian benih dilakukan menggunakan dua hibrida yaitu Hipa 6 dan Hipa 7. Pengujian dilakukan pada sampel individu tanaman muda yang diambil dari petak pertanaman di lapang. Marka RM346 digunakan untuk uji kemurnian genetik Hipa 6 dan RM206 untuk Hipa 7. Marka tersebut digunakan karena sifatnya yang polimorfis untuk tetua hibrida Hipa 6 dan Hipa 7. Terdapat beberapa marka yang polimorfis yang dapat membedakan galur tetua Hipa 6, dan untuk uji kemurnian benih dipilih marka RM346. Pemilihan marka RM346 dikarenakan polimorfisme cukup jelas terlihat pada tetua (antara GMJ dan restorer-nya) (Gambar 5a) dibandingkan marka yang lain (RM570 dan RM206). Marka tersebut menghasilkan satu pita pada masing-masing tetua sehingga akan lebih mudah membedakannya pada uji kemurnian benih. Marka RM 206 dipilih untuk uji kemurnian benih Hipa 7, karena marka tersebut merupakan marka yang polimorfis dan merupakan marka yang spesifik untuk Hipa 7. Marka RM335 tidak digunakan untuk uji kemurnian benih karena walaupun polimorfis antara tetua Hipa 6 dan Hipa 7, tetapi marka tersebut tidak dapat membedakan antara Hipa 6 dan Hipa 7. Galur mandul jantan dan restorer dari Hipa 6 dan Hipa 7 teramplifikasi pada jarak yang sama. Hasil pengujian molekuler dengan menggunakan marka RM346 pada 40 individu hibrida Hipa 6 menunjukkan 33 individu tanaman menghasilkan pita heterozigot dan tujuh individu tanaman menghasilkan pita homozigot (Gambar 7 dan 8). Individu yang memiliki pita homozigot adalah individu nomor 2, 3, 12,19, 21, 33 dan 38. Individu-individu tanaman tersebut merupakan campuran karena

12 34 tidak memiliki kedua pita yang berasal dari dua tetua pembentuknya. Tujuh individu tanaman yang menghasilkan pita homozigot, dua tanaman memiliki pita yang identik dengan tetua galur mandul jantan (A) yaitu individu nomor 2 dan 38 dan lima tanamann memiliki pita identik dengan tetua jantan atau restorer-nya (R) yaitu pada individu nomor 3, 12, 19, 21 dan 33. L R L A Gambar 7 Hasil uji kemurniann benih Hipa 6 dengan menggunaka an RM346 pada media elektroforesis gel agarose 3 % L A R Gambar 8 Hasil uji kemurnian benih Hipa 6 dengan menggunakan RM346 pada media elektroforesis gel polyakrilamid Evaluasi kemurnian genetik di lapang (grow-out berdasarkan karakter morfologi. Hasil pengamatann morfologi test) dilakukan mengidentifikasi

13 35 campuran varietas lain pada tanaman nomor 1, 2, 3, 12, 19,37 dan 38 (Tabel 9). Terdapat perbedaan antara hasil uji laboratorium dengan marka SSR dengan identifikasi varietas campuran berdasarkan pengamatan morfologi di lapang. Tabel 9 Identifikasi tanaman campuran pada uji kemurnian genetik menggunakan SSR dan grow out test pada Hipa 6 Uji Kemurnian Jumlah sampel Tanaman campuran (%) Nomor sampel SSR 40 17,5 2, 3, 12, 19, 21, 33, 38 Grow out test 40 17,5 1, 2, 3, 12, 19, 37, 38 Persentase tanaman campuran pengujian SSR dengan grow out test memiliki nilai yang sama yaitu 17,5%. Sebagian besar individu yang dikenali sebagai campuran, sama antara SSR dan grow out test. Individu tanaman tersebut adalah sampel nomor 2, 3, 12, 19 dan 38. Hasil berbeda didapatkan pada beberapa nomor sampel yaitu pada tanaman nomor 1, 37, 21 dan 33. Individu nomor 1 dan 37 (Gambar 9) yang diidentifikasi sebagai campuran di lapang ternyata bukan merupakan campuran pada hasil pengujian dengan marka SSR RM346. Individu tersebut memiliki dua pita polimorfis yang menandakan tetua Hipa 6 (Gambar 7 dan 8). Pada pengamatan grow out test individu 1 dan 37 dikategorikan sebagai tanaman campuran karena memiliki jumlah anakan yang lebih sedikit, tinggi tanaman yang lebih rendah dan warna daun yag sedikit lebih gelap dibandingkan tanaman Hipa 6. Sedikitnya jumlah anakan menyebabkan tampilan tanaman terlihat lebih kompak sehingga tanaman dianggap sebagai campuran. Rincian mengenai penyimpangan karekter pada tanaman-tanaman yang dikategorikan sebagai campuran dapat dilihat pada Tabel 10 Individu nomor 21 dan 33 menunjukan hal sebaliknya. Tanaman tersebut di lapang tidak dikategorikan sebagai campuran, ternyata tidak memiliki dua pita yang merupakan identitas dari tetua hibrida. Tanaman nomor 21 dan 33 yang merupakan campuran varietas lain, memiliki penampilan morfologi mirip dengan Hipa 6. Pada uji SSR individu tanaman nomor 21 dan 33 memiliki pita yang identik dengan restorer Hipa 6, tetapi belum dapat dipastikan bahwa tanaman tersebut adalah restorer. Marka RM346 merupakan marka yang polimorfis untuk tetua Hipa 6 tetapi marka tersebut monomorfis dengan galur tetua lain yang

14 36 digunakan pada penelitian ini. Sehingga dapat saja tanaman nomor 21 dan 33 yang menurut hasil SSR pitanya identik dengan restorer Hipa 6 adalah tanaman varietas lain yang pitanya tidak dapat dibedakan dengan restorer bila menggunakan marka RM346. Tabel 10 Penyimpangan karakter pada tanaman sampel yang dinyatakan sebagai campuran pada grow out test Hipa 6 Nomor sampel Penyimpangan karakter 1 Tanaman lebih pendek, anakan lebih sedikit, tanaman lebih kompak 2 Terdapat malai hampa, lebih rentan terhadap hama 3 Warna merah pada ujung gabah, tanaman sedikit lebih menyebar 12 Umur berbeda lebih dalam, warna daun lebih tua 19 Tanaman lebih tinggi, anakan sedikit, warna daun lebih muda, umur lebih dalam 37 Tanaman lebih pendek, anakan lebih sedikit, tanaman lebih kompak 38 Tanaman lebih pendek dan kompak, lebih rentan terhadap hama dan penyakit 1 HIPA 6 37 HIPA 6 (a) (b) Gambar 9 Identifikasi tanaman nomor 1 dan Hipa 6 (a); Tanaman nomor 37 dan Hipa 6 (b). Tanaman nomor 1 dan 37 yang diidentifikasi sebagai campuran ternyata bukan campuran menurut uji laboratorium Beberapa tanaman lain memperlihatkan penyimpangan karakter yang cukup jelas seperti pada tanaman nomor 19. Tanaman tersebut memiliki jumlah

15 37 anakan yang jauh lebih sedikit, perbedaan tinggi tanaman dan warna daun. serta umur berbunga yang jauh lebih dalam. Tanaman nomor 3 tidak menunjukkan tampilan yang berbeda jauh pada pertumbuhan tanaman. Perbedaan baru terlihat pada pengamatan generatif akhir dimana terdapat warna merah pada ujung gabah. CVL HIPA 6 Gambar 10 Identifikasi tanaman nomor 19 (kiri) dan Hipa 6 (kanan). Tanaman 19 diidentifikasi sebagai campuran pada uji kemurnian di laboratorium dan di lapang Polimorfisme antar tetua HIPA 7 yang dihasilkan oleh marka RM206 pada gel agarose 3% berjarak cukup dekat sehingga pita heterozigot sulit dilihat sebagai dua pita yang terpisah. Identifikasi pita homozigot dilakukan dengan melihat pendaran yang lebih tipis dan diidentifikasi sebagai pita homozigot. Individu-individu tanaman yang bukan hibrida diindikasikan oleh tanaman nomor 4, 14,15, 23 dan agak meragukan pada no 29 (Gambar 11). L A R L Gambar 11 Uji kemurnian benih Hipa 7 dengan menggunakan marka RM206 pada gel agarose 3 %.

16 38 Elektroforesis dengan menggunakan gel polyakrilamid dapat mengidentifikasi individu homozigot yaitu pada tanaman nomor 4, 14, 15, 23 dan 29. Pada tanaman nomor 29 yang sebelumnya agak meragukan pada pemisahan dengan gel Agarose 3% terlihat lebih jelas pada gel polyakrilamid (Gambar 12). Tanaman tersebut bukan merupakan hibrida karena tidak memiliki pita dari galur restorer. Dari lima tanaman homozigot yang diidentifikasi dengan menggunakan marka RM206, tiga tanaman identik dengan pita galur mandul jantan (A) yaitu individu nomor 4, 15 dan 29. Dua tanamann identik dengan restorer (R) yaitu individu nomor 14, dan 23. Kemampuan deteksi padaa gel polyakrilamid lebih baik dibandingkan dengan menggunakan agarose 3% (Azrai 2007), dimana produk PCR yang sebelumnya dideteksi sebagai monomorfis tampak polimorfis setelah menggunakann gel polyakrilamid. Tingkat resolusi gel polyakrilamid lebih tinggi dibandingkan gel agarose, maka gel tersebut mempunyai kemampuan lebih besar untuk mendeteksi sejumlah alel per lokus dibandingkan dengan gel agarose (Makaulay et al. 2001) A A R L Gambar 12. Uji kemurnian benih Hipa 7 dengan menggunakan marka RM206 padaa gel polyakrilamid Perbandingan identifikasi tanaman campuran antara hasil uji SSR dengan grow-out test padaa Hipa 7 dapat dilihat pada Tabel 11. Individu yang diidentifikasi sebagai campuran pada grow-out test adalah tanaman sampel nomor 1, 4, 14, 15, 23, 29 dan 34. Terdapat perbedaan antar penilaian tanamann campuran pada SSR dan grow-out test yaitu pada tanaman nomor 1 dan 34. Tanaman nomor 1 dan 34 yang diidentifikasi sebagai campuran berdasarkan identifikasi morfologi ternyata merupakan hibrida berdasarkan uji SSR. Penampilann morfologi pada kedua tanaman tersebut lebih kompak, anakan lebih sedikit serta pada tanaman nomor 1 waktu berbunganyaa lebih dalam sekitar 2 hari dari ata-rata tanaman

17 39 yang ada pada pertanaman. Penyimpangan karakter dari tanaman-tanaman yang dinilai sebagai campuran pada grow-out test dapat dilihat pada Tabel 12 Tabel 11 Identifikasi tanaman campuran pada uji kemurnian dengan SSR dan grow out test pada Hipa 7 Uji Kemurnian Jumlah sample Tanaman campuran (%) Nomor sampel SSR 40 12,5 4, 14, 15, 23, 29 Grow out test 40 17,5 1, 4, 14, 15, 23, 29, 34 Beberapa tanaman campuran memiliki penyimpangan morfologi yang cukup jelas dan dengan mudah dapat diidentifikasi. Tanaman nomor 14 memiliki ukuran tinggi tanaman dan lebar daun yang jelas berbeda dibandingkan Hipa 7 (Gambar 13). Pada beberapa tanaman yang diidentifikasi memiliki pita identik dengan galur mandul jantan memiliki malai-malai yang hampa pada rumpun tanamannya. tanaman tersebut adalah individu nomor 4, 15 dan 29 Tabel 12 Penyimpangan karakter pada tanaman sampel yang dinyatakan sebagai campuran pada grow out test Hipa 7 Nomor sampel Penyimpangan karakter 1 Tanaman lebih kompak, umur berbunga lebih dalam 4 Biji hampa, parsial streril 14 Tanaman lebih tinggi, daun lebar, diameter batang lebih tebal 15 Terdapat malai steril, tanaman lebih kompak, (regestan) 23 Umur berbunga lebih dalam, tanaman lebih kompak, 29 Tanaman lebih kompak, anakan lebih sedikit, 34 Tanaman lebih kompak, anakan lebih sedikit, Persentase tanaman campuran pada SSR lebih rendah dibandingkan grow-out test (Tabel 11). Dua tanaman yang dinilai sebagai campuran berdasarkan pengamatan morfologi, pada hasil elektroforesis terlihat memiliki pita-pita DNA yang berasal dari dua tetua pembentuk hibrida. Penilaian uji kemurnian dengan menggunakan marka SSR dinilai lebih akurat karena pangamatan yang dilakukan tidak bersifat subjektif dan jelas dapat mendeteksi apakah tanaman tersebut benar memiliki pita yang berasal dari tetua pembentuknya.

18 40 CVL Hipa 7 CVL Hipa 7 (a) (b) Gambar 13 Indentifikasi tanaman campuran nomor 14 (kiri) dan Hipa 7 (a), perbandingan ukuran dan lebar daun antara campuran dengan Hipa 7 (b) Gambar 14. Campuran dari tanaman parsial steril atau parsial fertil, malai 1, 2 fertil dan malai 3 steril (hampa). Malai 1,2,3 diambil dari satu rumpun tanaman yang sama. Malai no 4 adalah galur mandul jantan. Hasil uji kemurnian varietas pada Hipa 6 dan Hipa 7 menunjukkan bahwa penilaian secara morfologi bersifat subjektif dan sangat dipengaruhi pada kondisi lingkungan. Penampilan bentuk tanaman dikendalikan oleh sifat genetik tanaman

19 41 di bawah pengaruh faktor-faktor lingkungan (Sitompul & Guritno 1995). Faktor lingkungan yang dapat mempengaruhi terjadinya perubahan morfologi tanaman antara lain iklim, suhu, jenis tanah, kondisi tanah, ketinggian tempat, dan kelembaban. Apabila faktor lingkungan lebih kuat memberikan pengaruh maka akan terjadi variasi pada morfologi tanaman. Pengalaman dan tingkat keahlian dari petugas pemeriksa pertanaman juga menjadi suatu hal yang sangat penting pada akurasi penilaian pada grow-out test. Pengujian dengan SSR dapat mendeteksi campuran-campuran yang sangat mirip secara morfologi dan membedakannya secara jelas dalam hasil elektroforesis. Beberapa tanaman yang terserang hama penyakit dan berakibat pada perubahan penampilan fisik dan menimbulkan kerancuan pada grow out test, dapat dengan jelas dikenali kebenarannya menggunakan uji kemurnian dengan SSR. Penilaian yang tidak tepat dalam uji kemurnian benih di lapang dapat menyebabkan kerugian besar pada produsen benih. Kerugian tersebut disebabkan oleh tidak akuratnya dalam penilaian tanaman campuran. Tanamantanaman yang dinilai sebagai tanaman campuran, dapat saja berbeda secara kasat mata karena dipengaruhi oleh pemupukan dan serangan hama penyakit bukan karena merupakan campuran. Hasil penilaian yang tidak akurat ini dapat berakibat pada tingginya persentase jumlah tanaman campuran dan dapat menyebabkan tidak lulusnya lot benih dalam proses sertifikasi. Pita Tambahan pada Uji Kemurnian Benih dengan Menggunakan Marka SSR Hasil uji kemurnian benih di laboratorium dengan menggunakan marka molekuler, menunjukkan terbentuk pita tambahan yang bukan merupakan pita spesifik dari tetua padi hibrida. Pita tambahan tersebut terlihat pada hasil elektroforesis dengan menggunakan gel polyakrilamid (Gambar 8 dan 12). Hal yang sama juga terjadi pada penelitian yang dilakukan oleh Hashemi et al. (2009) dan Xin et al. (2005) dimana muncul pita tambahan pada F 1 hibrida padi yang diuji. Pada tanaman F 1, adanya pita tambahan diduga terbentuk akibat pergerakan yang lebih lambat dari pita-pita yang berasal dari kedua tetuanya. Diasumsikan bahwa pita-pita tersebut masih berupa pita yang heteroduplex. Heteroduplex merupakan molekul DNA untai-ganda (double strain) yang terbentuk diantara dua alel yang berbeda, oleh sebab itu maka terjadi

20 42 ketidakcocokan (Perez et al. 1999). Heteroduplex juga dapat terjadi akibat adanya penyimpangan, struktur yang rusak akibat adanya gelembung atau tonjolan pada bagian yang tidak cocok tersebut dan menyebabkan pergerakan yang lebih lambat pada gel elektroforesis bila dibandingkan molekul homoduplex (Kozlowski & Krzyzosiak 2001). Lambatnya pergerakan terjadi akibat adanya perubahan (insersi atau delesi) pada salah satu untai DNA double helix dan menimbulkan gelembung pada sisi tersebut. Pita tambahan yang mucul merupakan bukti dari sifat kodominan dari marka tersebut (Wu et al. 2002). Hal yang sama juga terjadi pada penelitian yang dilakukan dengan marka dan tanaman yang berbeda diantaranya marka RAPD kodominan pada kedelai (Zeng et al 2003), padi (Wu et al. 2002), hibrida krisan (Huang et al. 2000) dan marka SSR pada jagung (Heckenberger et al. 2002). Keberadaan dari DNA heteroduplex yang bergerak lebih lambat ini, berguna untuk menditeksi individu heterozigot. Karakter Morfologi Tanaman Hipa 6 dan Hipa 7 Saat ini varietas-varietas padi yang dilepas memiliki tingkat kemiripan yang cukup tinggi sehingga cukup sulit untuk membedakan antar varietas hanya berdasarkan deskripsi umum dari tanaman. Ciri morfologi yang sering digunakan sebagai pembeda kultivar padi adalah tinggi tanaman, jumlah anakan produktif, warna batang, warna daun, permukaan daun, jumlah gabah permalai, bentuk gabah, warna gabah, dan permukaan gabah. Selain itu karakter pembungaan dapat juga dapat dijadikan karakter pembeda pada varietas-varietas padi (Wet et al. 1986) Deskripsi varietas untuk tanaman Hipa 6 dan Hipa 7 telah ada (Lampiran 5 dan 6) akan tetapi karakterisasi yang dilakukan belum mengikuti sejumlah karakter untuk pengujian individual kebaruan, keunikan dan keseragaman tanaman padi. Karekterisasi yang belum mengikuti standar dapat menyebabkan kerancuan dalam penilaian suatu varietas. Untuk karakter-karakter kualitatif klasifikasi sebaiknya mengikuti varietas contoh yang telah ditetapkan (PPVT 2010). Adanya varietas contoh akan sangat membantu untuk mengklasifikasikan karakter-karakter yang dimaksud. Beberapa kerancuan yang yang mungkin timbul salah satunya pada warna gabah. Pada deskripsi varietas, Hipa 6 memiliki warna gabah kuning jerami dan Hipa 7 berwarna kuning. Bila diamati secara visual antara Hipa 6 dan Hipa 7

21 43 tidak memiliki warna gabah yang berbeda keduanya berwarna kuning jerami (Gambar 15). Karakterr warna telinga daun yang ada pada deskripsi varietas dideskripsikan berbeda yaitu tidak berwarna untuk Hipa 6 dan berwarna hijau untuk Hipa 7. Secara penilaian visual, warna telinga daun menunjukkan karakter warna yang sama yaitu warna hijau dan tidak terdapat antosianin (Gambar 16). Gambar 15 Gabah pada Hipa 6 (kiri) dan Hipa 7 (kanan) Gambar 16 Telinga daun pada Hipa 6 (kiri) dan Hipa 7 (kanan) Pengenalan atau identifikasi varietas adalah suatu teknik untuk menentukann apakah yang dihadapi tersebut adalah benar varietas yang dimaksudkan (true to type). Karakterisasi secara lengkap dan lebih spesifik akan sangat membantu bila terjadi kecurigaan adanya campuran pada pertanaman. Penilaian terhadap suatu varietas tidak hanyaa bisa dibedakan oleh pemulianya saja tetapi juga harus dapat dibedakan secaraa objektif. Beberapa karakter yang tidak termasuk dalam deskripsi varietas telah diamati. Karakter tersebut terdiri dari karakter kualitatif dan kuantitaif (Tabel 13 dan 14).

22 44 Tabel 13 Deskripsi beberapa karakter kualitatif padi hibrida Hipa 6 dan Hipa 7 No Karakter Hipa 6 Hipa 7 1 Koleoptil Warna anthocyanin Tidak berwarna Tidak berwarna 2 Daun Leher daun (Collar) Hijau Hijau Lidah daun (Ligula) Bentuk, Warna Ada. Cleft (berlekuk) Tidak berwarna 3 Anak Bunga (Spikelet): Warna putik (stigma) Putih Putih 4 Batang Warna anthocyanin pada buku Warna anthocyanin pada ruas Tidak ada Tidak ada Ada Cleft (berlekuk) Tidak berwarna Tidak ada Tida ada 5 Lemma Steril Warna Kuning Jerami Kuning Jerami 6 Malai : a. Bulu ujung gabah Warna (pengamatan awal) (pengamatan akhir) Distribusi bulu ujung gabah b. Anak bunga: Kepadatan rambut pada lemma Warna c. Karakternya Putih kekuning Kuning jerami Hanya diujung malai Kuat Kuning Jerami Putih kuningan Kuning jerami Hanya diujung malai Sedang Kuning Jerami terhadap batang Agak terkulai Agak terkulai d. Cabang sekunder perilaku dari cabang malai Ada, kuat Agak tegak Ada, kuat Agak tegak e. Eksersi (pemunculan malai dari leher malai) 7 Daun : Gejala penuaan (senesens) Muncul Sedang Muncul muncul sempurna Sedang 8 Lema Warna Reaksi dan intensitas pewarnaan phenol Kuning jerami Ada, Gelap Kuning jerami Ada, Gelap 9 Gabah : bentuk Ramping/panjang Ramping/panjang Ket : gambar dari beberapa karakter kualitatif dapat dilihat pada Lampiran 11

23 45 Tabel 14 Deskripsi beberapa karakter kuantitatif padi hibrida Hipa 6 dan Hipa 7 Karakter Hipa 6 Hipa 7 Rata-rata Min Max Rata-rata Min Max Lidah daun (cm) Panjang helai daun (cm) Lebar helai daun (cm) Tebal batang (cm) Panjang batang (cm) Leher malai (cm) 1.50 (-) Panjang malai (cm) Tinggi tanaman (vegetatif) (cm) Tinggi tanaman (generatif) (cm) Lebar gabah (cm) Panjang gabah (cm) Rasio panjang/lebar Panjang lemma steril (cm) Jumlah gabah/malai Panjang bulu (cm) Karakter-karakter yang dapat dijadikan penciri tambahan pada Hipa 6 dan Hipa 7 adalah warna koleoptil, bentuk dan ukuran lidah daun, warna putik, warna dan ukuran lemma steril, warna dan ukuran bulu pada ujung gabah, karakter malai terhadap batang, perilaku cabang sekunder, warna lemma dan reaksi lemma terhadap pewarnaan phenol. Dalam mencirikan suatu varietas karakter kualitatif lebih diharapkan dibandingkan dengan karakter kuantitatif. Karakter kualitatif keberadaanya lebih jelas, tidak dipengaruhi lingkungan dan bersifat diskrit sehingga mudah dibedakan. Sebaliknya pada karakter kuatitatif sangat dipengaruhi lingkungan, dan bersifat kontinyu. Bila dibandingkan antara Hipa 6 dan Hipa 7 karakter morfologi yang dapat dijadikan pembeda adalah karakter warna daun, eksersi malai, tinggi tanaman dan kepadatan rambut pada lemma. Warna daun pada Hipa 6 hijau tua (skala 3 bagan warna daun) sedangkan untuk Hipa 7 berwarna hijau (skala 2 bagan warna daun) (Gambar 17(a)). Karakter eksersi malai pada Hipa 6 sangat pendek atau tidak memiliki leher malai. Rata-rata ukuran leher malai Hipa 6 adalah 1,51 dengan kisaran -2,00 s/d 2,50 cm. Leher malai pada Hipa 7 keluar sempurna

24 46 dengan kisaran ukuran 2,00-4,50 cm. Karakter lain yang dapat membedakan Hipa 6 dan Hipa 7 adalah rambut pada lemma. Pada Hipa 6 rambut pada lemma termasuk lebat sedangkan pada Hipa 7 sedang. (a) (b) (c) (d) Gambar 17. Karakter warna daun Hipa 6 (a) dan Hipa 7 (b) karakter eksersi malai Hipa 6 (c) dan Hipa 7 (d)