ENZIM XILANASE Bacillus licheniformis AQ1 : PEMEKATAN, STUDI TERMOSTABILITAS, DAN ZIMOGRAM. Oleh: AJENG NARESWARI G

Transkripsi

1 ENZIM XILANASE Bacillus licheniformis AQ1 : PEMEKATAN, STUDI TERMOSTABILITAS, DAN ZIMOGRAM Oleh: AJENG NARESWARI G DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

2 2 ABSTRAK AJENG NARESWARI. Enzim Xilanase Bacillus licheniformis AQ1 : Pemekatan, Studi Termostabilitas, dan Zimogram. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan BUDIASIH WAHYUNTARI. Xilan adalah komponen terbesar hemiselulosa pada dinding sel tanaman. Isolat Bacillus licheniformis AQ1 mampu menghasilkan enzim xilanase ekstraseluler bila ditumbuhkan di dalam media yang mengandung xilan. Xilanase isolate AQ1 dapat diendapkan dengan polietilen glikol (PEG) Waktu paruh xilanase isolat AQ1 pada suhu 50 0, 60 0, 70 0, 80 0, 90 0 C dan ph 7 masing-masing sebesar , 91.22, 83.62, 77.19, dan menit. Waktu paruh xilanase isolat AQ1 pada suhu 50 0, 60 0, 70 0, 80 0, 90 0 C dan ph 8 yakni sebesar 88.54, 81.36, 75.26, 66.90, dan menit. Sedangkan waktu paruh xilanase isolat AQ1 pada suhu 50 o, 60 o, 70 o, 80 o, 90 o C dan ph 9 yakni sebesar 79.22, 62.71, 60.21, 56.80, menit. Berdasarkan hasil uji stabilitas penyimpanan enzim xilanase yang disimpan pada suhu 4 o C relatif lebih stabil bila dibandingkan dengan dengan enzim yang disimpan pada suhu ruang (30 o C). Analisis zimogram pada gel poliakrilamida dengan konsentrasi 7.5, 10, dan 12% menunjukkan xilanase B. licheniformis AQ1 mampu menghidrolisis substrat oatspelt xylan, beechwood xylan, dan carboxymethyl cellulose (CMC), akan tetapi pita protein yang menunjukkan aktivitas enzim tidak dapat bermigrasi ke dalam gel sehingga bobot molekul protein yang menunjukkan aktivitas xilanase tidak dapat diperkirakan. ABSTRACT AJENG NARESWARI. Xylanase From Bacillus licheniformis AQ1 : Precipitation, Thermostability Study, and Zimogram. Under supervision of NISA RACHMANIA MUBARIK and BUDIASIH WAHYUNTARI. Xylan is a major component of hemicellulose found in plant cell wall. Isolate Bacillus licheniformis AQ1 produces extracellular xylanase when grown in xylan containing medium. Xylanase from AQ1 could be precipitated by polyethylene glycol (PEG) Thermostability test at 50, 60, 70, 80, and 90 0 C and ph 7 showed that half time of xylanase from AQ1 was , 91.22, 83.62, 77.19, and minute, respectively. At ph 8, half time of the enzyme at 50, 60, 70, 80, and 90 0 C was 88.54, 81.36, 75.26, 66.90, and minute, respectively. While, at ph 9 and temperature 50, 60, 70, 80, and 90 o C half time of the enzyme was 79.22, 62.71, 60.21, 56.80, and minute, respectively. Based on storage stability test, xylanase AQ1 was more stable at temperature 4 o C than temperature 30 o C. Zymogram analysis using 7.5, 10, and 12% polyacrylamide gel showed that xylanase B. licheniformis AQ1 could degrade oatspelt xylan, beechwood xylan, and carboxymethyl cellulose (CMC), however, the active protein bands could not migrated into the gel, therefore, the molecular weight of the active protein could not be proximated.

3 3 ENZIM XILANASE Bacillus licheniformis AQ1 : PEMEKATAN, STUDI TERMOSTABILITAS, DAN ZIMOGRAM Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Oleh: Ajeng Nareswari G DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

4 4 Judul : ENZIM XILANASE Bacillus licheniformis AQ1: PEMEKATAN, STUDI TERMOSTABILITAS, DAN ZIMOGRAM Nama : Ajeng Nareswari NIM : G Menyetujui : Pembimbing I Pembimbing II Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si NIP Dr. Budiasih Wahyuntari NIP Mengetahui : Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S. NIP Tanggal Lulus :..

5 5 PRAKATA Puji syukur senantiasa penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat, karunia dan kesabaran kepada penulis selama melaksanakan penelitian hingga selesainya penulisan skripsi ini. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi. Penelitian ini dilakasanakan mulai bulan Januari 2006 hingga April 2007, dan bertempat di Laboratorium Teknologi Bioindustri, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Puspiptek Serpong dengan judul Enzim Xilanase Bacillus licheniformis AQ1: Pemekatan, Studi Termostabilitas, dan Zimogram. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing pertama dan Ibu Dr. Budiasih Wahyuntari selaku pembimbing kedua atas bimbingan, saran, solusi dan ilmu pengetahuan yang diberikan kepada penulis selama penelitian ini hingga selesainya penulisan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Utut Widyastuti, M.Si. selaku penguji dan wakil komisi pendidikan atas saran dan masukan yang diberikan. Ucapan terima kasih juga penulis berikan kepada seluruh staf dan peneliti di Laboratorium Teknologi Bioindustri Puspiptek Serpong, Mba Rita dan Mba Widi selaku Laboran di Laboratorium Bioindustri, juga kepada Mba Sari, Mba Virli, Mas Ucup, Mas Mukti atas segala bantuannya. Penghargaan terbesar penulis haturkan kepada Mama, Papa dan Adikku tercinta (Adit) atas doa, cinta dan kasih sayangnya yang tiada henti. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Rian Tri Putra dan keluarga, juga kepada Ayu, Febri, Mery, Amel, Dianing, Eva, Sita, Fajar sebagai teman-teman seperjuangan di Laboratorium Teknologi Bioindustri Puspiptek Serpong, tak lupa kepada Vitria, Adhis, Thonkee sebagai sahabat yang selalu memberikan dukungan dan semangat, kepada Riza, Gaga, Bian, Iqbal, Ria dan seluruh rekan-rekan Biologi angkatan 39 yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, terima kasih atas segala dukungan dan doanya. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat. Bogor, Mei 2007 Ajeng Nareswari

6 6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 25 Juli Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara dari Bapak Poernawarman dan Ibu Sri Hartani. Tahun 2002 penulis lulus dari SMU Negeri 8 Jakarta dan pada tahun yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Prestasi Internasional Nasional (PIN). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten dosen untuk praktikum mata ajaran Biologi Dasar tahun ajaran 2004/2005 dan 2005/2006. Penulis melaksanakan tugas praktik lapangan selama satu bulan di PT. ANTAM Tbk. UBPE Pongkor. Selain itu selama kuliah penulis pernah mendapatkan beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik periode 2004/2005 dan 2005/2006. Penulis pernah aktif dalam berbagai organisasi kampus, diantaranya menjadi anggota Dewan Perwakilan Mahasiswa TPB IPB (2002/2003), anggota Badan Eksekutif Mahasiswa FMIPA IPB (2003/2005), anggota Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) FMIPA IPB dan anggota organisasi kewirausahaan Biologi (BIOWORLD).

7 7 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... vi DAFTAR GAMBAR... vi DAFTAR LAMPIRAN... vi PENDAHULUAN Latar Belakang... 1 Tujuan... 1 BAHAN DAN METODE Bahan... 1 Metode... 1 Pembuatan Medium Pertumbuhan Luria Bertani (LB) dan Medium Starter... 1 Produksi Xilanase... 2 Pemekatan Enzim Xilanase... 2 Uji Aktivitas Xilanase dan Kadar Protein... 2 Uji Kestabilan Enzim terhadap ph dan Suhu... 2 Uji Penyimpanan Enzim Xilanase... 2 Pengukuran Waktu Paruh... 3 Analisis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dan Zimogram... 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil... 3 Pemekatan Enzim Xilanase B. licheniformis AQ Uji Kestabilan Enzim terhadap ph dan Suhu... 3 Uji Penyimpanan Enzim Xilanase... 5 Analisis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dan Zimogram... 5 Pembahasan... 6 SIMPULAN DAN SARAN... 9 DAFTAR PUSTAKA... 9 LAMPIRAN... 12

8 8 DAFTAR TABEL Halaman 1 Tahap pemekatan xilanase isolat AQ Waktu paruh xilanase Bacillus licheniformis AQ Perbandingan waktu paruh enzim xilanase berbagai mikroorganisme... 7 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Pengaruh suhu terhadap kestabilan xilanase isolat AQ1 pada ph Pengaruh suhu terhadap kestabilan xilanase isolat AQ1 pada ph Pengaruh suhu terhadap kestabilan xilanase isolat AQ1 pada ph Kurva hubungan log aktivitas dengan waktu penyimpanan xilanase B. licheniformis AQ Profil SDS-PAGE ekstrak kasar xilanase B. licheniformis AQ1 dan LMW (low molecular weight) (A), Zimogram xilanase B. licheniformis AQ1 menggunakan substrat oatspelt xylan dengan gel poliakrilamida 7.5% (B), 10% (C), dan 12% (D) Profil SDS-PAGE ekstrak kasar xilanase B. licheniformis AQ1 dan LMW (low molecular weight) (A), Zimogram xilanase B. licheniformis AQ1 menggunakan substrat beechwood xylan dengan gel poliakrilamida 7.5% (B), 10% (C), dan 12% (D) Profil SDS-PAGE ekstrak kasar xilanase B. licheniformis AQ1 dan LMW (low molecular weight) (A), Zimogram xilanase B. licheniformis AQ1 menggunakan substrat Carboxymethyl cellulose dengan gel poliakrilamida 7.5% (B), dan 10% (C) Profil SDS-PAGE ekstrak kasar xilanase B. licheniformis AQ1 dan LMW (low molecular weight) (A), Zimogram xilanase B. licheniformis AQ1 menggunakan substrat amilum dengan gel poliakrilamida 7.5% (B), dan 10% (C)...6 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Struktur xilan (Kulkarni et al. 1999) Kurva standar xilosa Kurva standar protein bovin serum albumin (BSA) Rumus pengukuran aktivitas xilanase (Bailey 1992) Komposisi gel poliakrilamida (5, 7.5, 10, dan 12%) (Copeland 1994) Kurva standar berat molekul Data aktivitas xilanase B. lichenifomis AQ1 pada berbagai variasi ph dan suhu Data aktivitas xilanase B. lichenifomis AQ1 pada suhu penyimpanan 4 0 C Data aktivitas xilanase B. lichenifomis AQ1 pada suhu penyimpanan 30 0 C... 20

9 PENDAHULUAN Latar Belakang Enzim merupakan biokatalis di dalam sel yang dalam jumlah sangat kecil dapat mempercepat reaksi kimiawi tanpa mengubah strukturnya. Salah satu enzim yang diproduksi oleh Bacillus licheniformis AQ1 ialah enzim xilanase. Xilanase merupakan enzim ekstraseluler yang dapat menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi rantai pendek xilooligosakarida (Kulkarni et al. 1999, Ratanakhanokchai et al. 1999, La Grange et al. 2001). Xilan merupakan komponen terbesar penyusun hemiselulosa sel tanaman dan termasuk polisakarida paling berlimpah di alam setelah selulosa, yaitu menyusun 20-30% komposisi dinding sel tanaman (Kubata et al. 1994, Saha 2002, Subramaniyan & Prema 2002). Xilanase merupakan enzim yang dilaporkan dapat digunakan sebagai pemutih pulp (Richana 2002). Penggunaan xilanase dalam industri kertas dan pulp merupakan suatu alternatif teknologi ramah lingkungan. Menurut Viikari et al. (1994) penggunaan xilanase dapat memberikan dampak yang baik terhadap kelestarian lingkungan untuk menggantikan atau mengurangi jumlah klorin yang digunakan dalam proses pemutih bubur kertas. Untuk proses pembuatan kertas diperlukan xilanase yang bersifat termostabil dan tahan pada ph alkali (Nakamura et al. 1993). Kulkarni et al. (1999) menyebutkan bahwa proses pemutihan kertas memerlukan suhu 80 0 C dengan kisaran ph 6-8. Beberapa kelompok mikroorganisme telah diketahui dapat menghasilkan enzim xilanase antara lain kelompok bakteri dan cendawan (Sunna et al. 1997, Lin et al. 1999, Ryan et al. 2003). Beberapa mikroorganisme penghasil xilanase antara lain Bacillus spp., B. stearothermophilus, B. circulans, Clostridium stercorarium, Thermonospora fusca, dan Thermatoga sp. Produksi xilanase pada penelitian ini menggunakan bakteri Bacillus licheniformis AQ1. Bakteri tersebut dapat memproduksi xilanase optimum pada ph 8 dan suhu 40 0 C (Agustine 2005). Kondisi pertumbuhan mikroorganisme berhubungan erat dengan aktivitas enzim. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain ph, suhu, konsentrasi sumber karbon, dan konsentrasi enzim (Pelczar & Chan 1986). B. licheniformis umumnya hidup di tanah (Balows et al. 1992) dan merupakan bakteri penghasil enzim ekstraseluler yang potensial. B. licheniformis A99 yang ditumbuhkan dengan sistem fermentasi padat menghasilkan xilanase (Archana & Satyanarayana 1997, diacu dalam Kulkarni et al. 1999). Bacillus licheniformis AQ1 adalah bakteri gram positif yang dapat menghasilkan enzim xilanase dengan kondisi optimum pada suhu 40 0 C dan ph 8 (Agustine 2005). Untuk menghasilkan produk enzim yang lebih murni, maka dilakukan pemekatan protein enzim ekstrak kasar terlebih dahulu. Proses ini dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa yang dapat menggumpalkan protein (Suhartono 1989). Salah satu bahan yang digunakan untuk presipitasi enzim adalah polietilen glikol (PEG) (Scopes 1982). Salah satu keuntungan penggunaan polietilen glikol sebagai presipitan yaitu tidak bersifat toksik dan memiliki efek protektif terhadap enzim (Suhartono 1989). Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk: (1) memekatkan enzim xilanase B. licheniformis AQ1 dengan menggunakan polietilen glikol, (2) melakukan studi termostabilitas pada variasi ph dan suhu penyimpanan, dan (3) menganalisis kemampuan enzim menguraikan substrat dengan menggunakan metode zimogram. BAHAN DAN METODE Bahan Bahan yang digunakan ialah Bacillus licheniformis AQ1 dari koleksi Laboratorium Teknologi Bioindustri, BPP Teknologi, Puspiptek, Serpong. Metode Pembuatan Medium Pertumbuhan Luria Bertani (LB) dan Medium Starter. Sebanyak 0.05 g ekstrak khamir, 0.1 g baktopepton, 0.05 g NaCl dilarutkan dalam 10 ml akuades, dihomogenkan dengan pengaduk magnet dan dipanaskan sampai larut. Setelah medium dingin, ph ditepatkan menjadi 7 dengan penambahan HCl 10%, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Komposisi medium starter (inokulum) untuk produksi xilanase ialah 0.5 g tandan kosong kelapa sawit (TKKS), 0.5 g ekstrak khamir (Scharlau), 1 g baktopepton (BDH laboratory supplies), 0.1 g K 2 HPO 4.3H 2 O

10 10 (Merck) dan 0.02 g MgSO 4.7H 2 O (Merck) (Nakamura et al. 1993). Bahan tersebut kemudian dilarutkan dalam 100 ml akuades, dihomogenkan dengan pengaduk magnet dan dipanaskan sampai larut. Setelah medium dingin, ph ditepatkan menjadi 7 dengan penambahan HCl 10%, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Produksi Xilanase. Komposisi medium produksi untuk xilanase ialah 5 g TKKS, 5 g ekstrak khamir, 10 g baktopepton, 1 g K 2 HPO 4.3H 2 O dan 0.2 g MgSO 4.7H 2 O (Nakamura et al. 1993). Bahan tersebut kemudian dilarutkan dalam akuades 1000 ml, dihomogenkan dengan pengaduk magnet dan dipanaskan sampai larut. ph ditepatkan menjadi 8 dengan penambahan HCl 10% (Merck) setelah medium dingin, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Sebanyak 2-3 ose bakteri B. licheniformis AQ1 diinokulasikan pada 5 ml medium pertumbuhan ph 8, kemudian diinkubasi pada suhu 40 C selama 6 jam sehingga jumlah sel mencapai 10 9 sel/ml. Produksi xilanase dilakukan dengan menambahkan sebanyak 5 ml media pertumbuhan ke dalam 45 ml medium starter (pada Erlenmeyer 250 ml), diinkubasi dalam inkubator goyang pada suhu 40 C selama 6 jam dengan kecepatan 150 rpm. Starter kemudian ditambahkan ke dalam 450 ml medium produksi (pada Erlenmeyer 2500 ml) dan diinkubasi dalam inkubator goyang pada suhu 40 C selama 20 jam dengan kecepatan 150 rpm. Enzim kasar dan sel dipisahkan dengan sentrifuse dingin kecepatan 4000 X g pada suhu 4 C. Supernatan hasil sentrifugasi dipisahkan dari peletnya (Siahaan 2003). Pemekatan Enzim Xilanase. Enzim xilanase ekstrak kasar dipekatkan dengan polietilen glikol Sebanyak 30 ml xilanase ekstrak kasar ditambahkan dengan PEG 6000 dengan konsentrasi 20, 25, 30, 35, 40, 45, dan 50% (w/v), kemudian diaduk perlahan selama 60 menit. Setelah itu disentrifus selama 10 menit pada X g lalu diambil endapannya. Endapan enzim yang telah dipisahkan kemudian dilarutkan kembali dengan ditambahkan bufer fosfat 5 mm ph 7. Setelah dipekatkan dengan PEG 6000, enzim xilanase diuji aktivitasnya berdasarkan Bailey (1992) dan diuji kadar proteinnya berdasarkan Bradford (1976). Uji Aktivitas Xilanase dan Kadar Protein. Aktivitas xilanase ditentukan dengan cara mengukur kadar gula pereduksi yang dibebaskan selama reaksi hidrolisis substrat xilan oleh xilanase (Bailey 1992). Satu unit aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat membebaskan satu µmol xilosa per menit. Besarnya gula pereduksi yang dibebaskan diukur berdasarkan metode asam dinitrosalisilat (DNS). Metode tersebut dilakukan dengan mencampurkan 0.2 ml xilanase dengan 0.8 ml larutan substrat xilan oat spelt 1% (w/v) (Sigma) dan diinkubasikan pada suhu dan ph optimum enzim, yaitu suhu 50 C dan ph 7 dalam penangas air selama 5 menit (Agustine 2005). Reaksi enzim dihentikan dengan menambahkan DNS 1% (w/v) sebanyak 1.5 ml. Campuran reaksi dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan sampai suhu kamar, absorbansi dibaca pada λ 540 nm. Besarnya kadar gula pereduksi dihitung sebagai xilosa berdasarkan kurva standar hubungan antara absorbansi dan kadar larutan xilosa standar. Pembuatan kontrol dilakukan dengan menginkubasi 0.8 ml larutan substrat xilan oat spelt 1% (w/v) dalam bufer ph optimum pada suhu optimum selama 5 menit. Larutan substrat tersebut ditambahkan 1.5 ml DNS 1% (w/v), kemudian ditambahkan 0.2 ml xilanase. Campuran larutan tersebut kemudian dipanaskan dalam penangas air yang mendidih selama 5 menit, kemudian didinginkan sampai suhu kamar. Absorbansi dibaca pada λ 540 nm. Kadar protein diukur dengan cara menambahkan sebanyak 400 µl filtrat enzim dengan 4 ml pereaksi Bradford (1976) dan dicampur sehingga homogen. Campuran disimpan pada suhu kamar selama 15 menit. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 595 nm. Sebagai standar digunakan bovin serum albumin (BSA) dengan konsentrasi mg/ml. Uji Kestabilan Enzim Xilanase terhadap ph dan Suhu. Uji kestabilan enzim dilakukan dengan menginkubasi enzim hasil pemekatan dengan PEG pada berbagai suhu (50, 60, 70, 80, dan 90 o C) dan ph 7, 8, 9. Sebagai kontrol ialah enzim yang diinkubasi pada ph uji selama 0 menit. Larutan enzim diinkubasi tanpa substrat selama 2 jam dan diamati aktivitas yang tersisa setiap 15 menit. Uji Penyimpanan Enzim Xilanase. Uji penyimpanan enzim dilakukan dengan menyimpan enzim pada suhu 4 ºC dan 30 ºC selama 30 hari. Pengukuran sisa aktivitas dilakukan tiap 3 hari untuk penyimpanan pada 30 ºC dan 7 hari pada 4 ºC.

11 11 Pengukuran Waktu Paruh. Waktu paruh merupakan waktu pemaparan enzim pada suhu tertentu yang menyebabkan penurunan aktivitas hingga 50% dari aktivitas semula (Chaplin & Bucke 1990). Nilai aktivitas yang diperoleh dari uji kestabilan enzim terhadap ph dan suhu tertentu serta dari uji penyimpanan enzim xilanase kemudian dikonversikan menjadi nilai logaritma (log). Dari hubungan waktu inkubasi dan nilai log aktivitas diperoleh persamaan y=ax + b. Berdasarkan persamaan ini dapat dihitung waktu paruh dengan rumus: t½ = (log ½) a Keterangan : t ½ = Waktu paruh enzim a = Kemiringan (slope) kurva Analisis Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS- PAGE) dan Zimogram. Elektroforesis protein menggunakan SDS-PAGE dengan konsentrasi poliakrilamida 5% untuk gel pengumpul dan 12, 10, 7.5% untuk gel pemisah berdasarkan metode Copeland (1994). Enzim yang digunakan adalah xilanase AQ1 yang telah dipekatkan dengan membran dialisis. Sebelumnya, 40 µl enzim pekat ini ditambahkan dengan bufer sampel 5x sebanyak 10 µl dan dipanaskan pada suhu 50 o C selama 5 menit. Setelah itu, sebanyak 10 µl sampel yang setara dengan 1.2 mg/ml protein dimasukkan ke dalam sumur pada gel pengumpul. Elektroforesis dijalankan pada 125 volt dan 100 Amp selama 2.5 jam. Penanda protein yang digunakan adalah Low Molecular Weight (Amersham Pharmacia Biotech; Uppsala Swedia) yang mengandung phosphorylase b (97 kda), albumin (66 kda), ovalbumin (45 kda), carbonic anhydrase (30 kda), trypsin inhibitor (21.1 kda), dan α- lactalbumin (14.4 kda). Perlakuan penyiapan penanda protein untuk elektroforesis sama dengan enzim dan ditambahkan dengan bufer sampel 5x namun pemanasan dilakukan pada suhu 100 o C selama 5 menit. Setelah elektroforesis, gel kemudian diwarnai dengan Page Blue (Fermentas; Lithuania) yang mengandung pewarna Coomassie Brilliant Blue R250. Perkiraan bobot molekul xilanase dalam larutan enzim kasar dilakukan dengan analisis zimogram. Analisis zimogram adalah analisis yang dilakukan untuk melihat aktivitas xilanase di dalam gel poliakrilamida dengan menggunakan substrat tertentu (Royer & Nakas 1990). Setelah elektroforesis, gel poliakrilamida direnaturasi dengan merendamnya dalam 2.5% (w/v) Triton-X 100 (Merck) selama satu jam. Setelah itu, gel direndam di dalam 1% (w/v) substrat beechwood xylan (Sigma) dan oatspelt xylan pada ph dan suhu optimum enzim selama satu jam. Kemudian, gel diwarnai dengan 0.1% (w/v) pewarna merah kongo (Merck) selama 45 menit dan dicuci dengan NaCl 1 M (Merck) setelah itu HCl 1 M. Aktivitas enzim penghidrolisis karbohidrat lain yaitu selulosa dan pati juga dilakukan dengan metode zimogram dengan menginkubasikan gel elektroforesis kedalam substrat enzim yang diuji yaitu Carboxy methyl cellulose (CMC) (BDH supplies laboratory) 1% (w/v) dan amilum 1% (w/v) (Merck). HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pemekatan Enzim Xilanase B. licheniformis AQ1. Penentuan konsentrasi optimum PEG yang digunakan untuk pemekatan ditunjukkan oleh data hubungan antara konsentrasi PEG (% w/v) dengan aktivitas relatif enzim (%). Konsentrasi PEG 50% menghasilkan aktivitas xilanase tertinggi untuk memekatkan xilanase isolat AQ1 dengan nilai U/ml. Kontrol tanpa PEG memiliki nilai aktivitas sebesar U/ml (Tabel 1). Aktivitas spesifik enzim pekat dengan menggunakan konsentrasi PEG 50% mengalami penurunan sebesar 27.7% jika dibandingkan dengan aktivitas spesifik dari enzim ekstrak kasar, yakni dari 1.79 U/mg menjadi U/mg protein. Aktivitas relatif menunjukkan persentase perbandingan antara aktivitas total hasil pemekatan dengan aktivitas total enzim ekstrak kasar tanpa pemekatan (konsentrasi PEG 0%). Sedangkan aktivitas spesifik menunjukkan perbandingan antara aktivitas total enzim dengan kadar protein total enzim. Uji Kestabilan Enzim terhadap ph dan Suhu. Uji kestabilan dilakukan untuk mengetahui kestabilan enzim xilanase B. licheniformis AQ1 terhadap suhu dan ph, mengingat enzim merupakan protein yang mudah mengalami kerusakan akibat pengaruh lingkungan. Inkubasi xilanase B. Licheniformis AQ1 pada suhu 50, 60, 70, 80,

12 12 Tabel 1 Tahap pemekatan xilanase isolat AQ1 PEG 6000 (%) Aktivitas (U/ml) Protein (mg/ml) Volume (ml) Aktivitas Total (U) Protein Total (mg) Aktivitas Spesifik (U/ mg protein) Aktivitas Relatif (%) dan 90 o C dan ph 7 selama 120 menit menunjukkan adanya aktivitas relatif yang banyak berkurang, masing-masing tersisa sebesar 43.27%, 41.62%, 34.09%, 31.87%, 29.65% (Gambar 1, Lampiran 7). Hal ini juga terjadi pada inkubasi xilanase B. licheniformis AQ1 pada suhu 50, 60, 70, 80, dan 90 o C dan ph 8 selama 120 menit, aktivitas relatif mengalami penurunan dan memperlihatkan adanya aktivitas relatif yang lebih rendah bila dibandingkan dibandingkan dengan perlakuan pada ph 7, masing-masing tersisa sebesar 39.04%, 36.31%, 32.29%, 26.97%, 26.10% (Gambar 2, Lampiran 7). Xilanase B. licheniformis AQ1 yang diinkubasi pada suhu 50, 60, 70, 80, dan 90 o C dan ph 9 selama 120 menit menunjukkan aktivitas relatif yang terendah jika dibandingkan dengan aktivitas relatif pada perlakuan dengan ph 7 dan 8, masing-masing tersisa sebanyak 33.24%, 26.33%, 23.77%, 22.44%, 20.29% (Gambar 3, Lampiran 7). Log aktivitas relatif T 50 T 60 T 70 T 80 T Waktu inkubasi (menit) Gambar 1 Pengaruh suhu terhadap kestabilan xilanase isolat AQ1 pada ph 7. Log aktivitas relatif Log aktivitas relatif T 50 T 60 T 70 T 80 T Waktu inkubasi (menit) Gambar 2 Pengaruh suhu terhadap kestabilan xilanase isolat AQ1 pada ph 8. T 50 T 60 T 70 T 80 T Waktu inkubasi (menit) Gambar 3 Pengaruh suhu terhadap kestabilan xilanase isolat AQ1 pada ph 9. Berdasarkan hasil pengukuran termostabilitas, maka dapat dihitung waktu paruh. Xilanase AQ1 B. licheniformis pada suhu 50, 60, 70, 80, dan 90 0 C dan ph 7 memiliki waktu paruh masing-masing sebesar , 91.22, 83.62, 77.19, dan menit. Waktu paruh xilanase B. licheniformis AQ1 pada suhu 50, 60, 70, 80, dan 90 0 C dan ph 8

13 13 Tabel 2 Waktu paruh xilanase Bacillus licheniformis AQ1 Suhu ( o C) ph 7 ph 8 ph 9 t ½ (menit) t ½ (menit) t ½ (menit) yakni sebesar 88.54, 81.36, 75.26, 66.90, dan menit. Sedangkan waktu paruh xilanase B. licheniformis AQ1 pada suhu 50, 60, 70, 80, dan 90 o C dan ph 9 yakni sebesar 79.22, 62.71, 60.21, 56.80, menit (Tabel 2). Uji Penyimpanan Enzim Xilanase. Pada suhu 4 o C, penyimpanan xilanase B. licheniformis AQ1 selama empat minggu diperoleh persamaan regresi y= x , yang disajikan dalam bentuk kurva hubungan log aktivitas dengan waktu penyimpanan (Gambar 4). Persamaan regresi enzim yang disimpan selama empat minggu pada suhu 30 o C yaitu y= x Berdasarkan kurva hubungan log aktivitas dengan waktu penyimpanan xilanase B. licheniformis AQ1, waktu paruh yang dimiliki xilanase AQ1 B. licheniformis pada suhu 4 o C sebesar 52.8 hari sedangkan pada suhu 30 o C sebesar 27.9 hari (Gambar 4). Log Aktivitas Waktu (hari) T 4 T 30 Gambar 4 Kurva hubungan log aktivitas dengan waktu penyimpanan xilanase B. licheniformis AQ1. Analisis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS- PAGE) dan Zimogram. Berdasarkan hasil SDS-PAGE ekstrak kasar xilanase B. licheniformis AQ1, tidak didapatkan pita protein yang jelas yang menunjukkan kisaran bobot molekul enzim tersebut. Hasil zimogram xilanase dengan menggunakan gel pemisah 7.5, 10, dan 12 %, menunjukkan terdapat satu pita protein yang mampu menghidrolisis substrat beechwood xylan, oatspelt xylan dan CMC. Akan tetapi, pita yang memiliki aktivitas enzim tidak bermigrasi di dalam tiga macam konsentrasi gel yang dicoba sehingga bobot molekul enzim tidak dapat diperkirakan (Gambar 5, 6, dan 7). Berdasarkan hasil zimogram dengan menggunakan substrat amilum, tidak didapatkan pita protein yang dapat menghidrolisis substrat amilum tersebut (Gambar 8). A 97.0 kda 66 kda 45 kda 30.0 kda 20.1 kda 14.4 kda B Gambar 5 Profil SDS-PAGE ekstrak kasar xilanase B. licheniformis AQ1 dan LMW (low molecular weight) (A), Zimogram xilanase B. licheniformis AQ1 menggunakan substrat oatspelt xylan dengan gel poliakrilamida 7.5% (B), 10% (C), dan 12% (D). A B C D 97.0 kda 66 kda 45 kda 30.0 kda 20.1 kda 14.4 kda Gambar 6 Profil SDS-PAGE ekstrak kasar xilanase B. licheniformis AQ1 dan LMW (low molecular weight) (A), Zimogram xilanase B. licheniformis AQ1 menggunakan substrat beechwood xylan dengan gel poliakrilamida 7.5% (B), 10% (C), dan 12% (D). C D

14 14 A B C 97.0 kda 66 kda 45 kda 30.0 kda 20.1 kda 14.4 kda Gambar 7 Profil SDS-PAGE ekstrak kasar xilanase B. licheniformis AQ1 dan LMW (low molecular weight) (A), Zimogram xilanase B. licheniformis AQ1 menggunakan substrat Carboxymethyl cellulose dengan gel poliakrilamida 7.5% (B), dan 10% (C). B A C 66 kda 45 kda 30.0 kda 20.1 kda 14.4 kda Gambar 8 Profil SDS-PAGE ekstrak kasar xilanase B. licheniformis AQ1 dan LMW (low molecular weight) (A), Zimogram xilanase B. licheniformis AQ1 menggunakan substrat amilum dengan gel poliakrilamida 7.5% (B), dan 10% (C). Pembahasan Bacillus licheniformis merupakan bakteri gram positif yang umumnya hidup di tanah (Slepecky & Hemphill 1992). Bacillus licheniformis AQ1 dapat memproduksi xilanase optimum pada suhu 40 0C dan ph 8 dengan media LB+xilan (Agustine 2005). Isolat ini juga dapat menghasilkan xilanase pada media Nakamura dengan sumber karbon tandan kosong kelapa sawit (TKKS) (Agustine 2005). Xilanase B. licheniformis AQ1 yang dihasilkan kemudian diendapkan dengan menggunakan polietilen glikol. Presipitasi dengan PEG bertujuan untuk mengendapkan enzim. Seperti penambahan garam misalnya amonium sulfat, penambahan PEG dapat menarik molekul air sehingga protein akan bersatu membentuk gumpalan endapan. Selain itu, PEG tidak bersifat toksik, tidak mudah terbakar serta memiliki efek protektif terhadap protein (Suhartono 1989). Keuntungan pemakaian polietilen glikol antara lain senyawa ini dapat ditambahkan sampai konsentrasi 50% (w/v) dan presipitasi protein mulai terjadi pada kisaran 6-12% (w/v) (Scopes 1987). Selain itu, selama perlakuan tidak dibutuhkan suhu yang rendah karena senyawa ini memberikan efek stabilisasi terhadap protein (Suhartono 1989). Protein yang pernah diendapkan dengan PEG ialah fibrinogen dan γ-globulin. Sama seperti pelarut organik, protein menjadi lebih larut di dalam larutan PEG seiring dengan bergesernya ph dari titik isoelektriknya (Scopes 1987). Pemekatan dengan menggunakan PEG biasanya dilakukan terhadap protein berdaya larut rendah, seperti globulin. Beberapa penelitian menggunakan PEG untuk memekatkan enzim misalnya tannase (Gupta et al. 1997) dan αamilase ( Thontowi et al. 2001). Pemekatan enzim tanase menggunakan PEG 6000, dan hasil pemekatan terbaik diperoleh pada konsentrasi PEG 0.1% (w/v) (Gupta et al. 1997). Pemekatan enzim α-amilase menggunakan PEG 600 dan 3350 dengan sistem dua fase, dan hasil pemekatan terbaik diperoleh pada konsentrasi PEG 600 (Thontowi et al. 2001). Berdasarkan hasil penelitian, konsentrasi PEG 6000 yang menunjukkan aktivitas unit xilanase tertinggi untuk xilanase isolat AQ1 yaitu konsentrasi 50%, yakni sebesar U/ml (Tabel 1). Aktivitas spesifik enzim hasil pemekatan dengan menggunakan konsentrasi 50% mengalami penurunan sebesar 27.7% jika dibandingkan dengan aktivitas spesifik dari enzim ekstrak kasar, yakni dari 1.79 U/mg menjadi U/mg protein. PEG dengan bobot molekul rendah memiliki kekentalan yang lebih rendah bila dibandingkan PEG dengan bobot molekul yang tinggi. Selain itu, kekentalan yang tinggi dapat menyebabkan penggunaan polimer sebagai bahan pengendap protein tidak efisien (Thontowi et al. 2001). Penurunan aktivitas spesifik dari hasil pemekatan dengan menggunakan PEG ini kemungkinan disebabkan oleh pengotor yang terkandung di dalam PEG teknis, sehingga kemurnian dari PEG berkurang dan menyebabkan inaktivasi pada enzim (Harris & Angal 1989). Selain pemekatan dengan PEG, xilanase AQ1 juga dapat dipekatkan dengan aseton. Agustine (2005) melaporkan bahwa xilanase AQ1 dipekatkan dengan aseton pada konsentrasi pemekatan 30, 40, 50, 60, 70, 80, dan 90%, dan aktivitas tertinggi dicapai pada konsentrasi aseton 70%, yaitu sebesar 0.36 U/ml. Xilanase isolat I-5 dipekatkan dengan menggunakan amonium sulfat, aktivitasnya

15 15 mencapai U/ml pada konsentrasi 70% (Siahaan 2003). Faktor yang sangat perlu diperhatikan pada enzim yang akan diaplikasikan dalam industri dan akan mempengaruhi kestabilannya ialah suhu dan ph (Godfrey & Reichelt 1983). Hasil percobaan terhadap kestabilan xilanase menunjukkan bahwa aktivitas relatif xilanase B. licheniformis AQ1 pada suhu 50, 60, 70, 80, dan 90 o C baik ph 7, ph 8 maupun ph 9 cenderung menurun seiring dengan waktu inkubasi enzim selama 120 menit (Gambar 1, 2, 3). Uji termostabilitas dilakukan untuk mengetahui sejauh mana aktivitas enzim xilanase tetap stabil pada pemanasan, mengingat enzim merupakan protein yang mudah mengalami kerusakan akibat denaturasi termal. Winarno (1983) melaporkan perbedaan sumber atau asal enzim dapat menyebabkan perbedaan terhadap daya tahan panas enzim tersebut, meskipun jenis enzimnya sama. Semakin tinggi suhu dan ph serta semakin lama waktu inkubasi maka aktivitas relatif enzim juga semakin menurun. Hal ini disebabkan pada suhu tinggi enzim dapat mengalami denaturasi. Molekul enzim memiliki struktur yang mudah rusak. Jika molekul enzim menyerap energi terlalu besar akibat naiknya suhu dan dengan bertambahnya waktu inkubasi, jumlah panas yang diterima enzim bertambah sehingga struktur tersier enzim mungkin mengalami perubahan (Lehninger 1994). Hal ini menyebabkan sisi aktif dari enzim tidak dapat berfungsi sebagaimana mestinya sehingga sulit mengikat substrat. Menurut Winarno (1983) apabila pemanasan enzim diperpanjang, maka kestabilan enzim akan menurun, dan laju inaktivasi enzim akan meningkat. Kestabilan panas suatu enzim ditentukan dengan menghitung waktu paruhnya, yaitu waktu pemaparan enzim pada suhu tertentu yang menyebabkan penurunan aktivitas hingga 50% dari aktivitas semula (Chaplin & Bucke 1990). Semakin lama waktu paruh yang dimiliki enzim, maka kestabilannya juga akan semakin baik. Kestabilan xilanase yang dihasilkan oleh berbagai mikroorganisme terhadap suhu dan ph berbeda, begitu pula dengan waktu paruhnya. Xilanase dari B. licheniformis I-5 memiliki waktu paruh selama menit pada kisaran suhu o C dan kisaran ph 7-8 setelah inkubasi selama 2 jam (Siahaan 2003, Firdaus 2005) (Tabel 3). Xilanase dari B. licheniformis AQ1 memiliki waktu paruh selama menit pada kisaran suhu o C dan kisaran ph 7-9 setelah inkubasi selama 2 jam (Tabel 3). Sedangkan, xilanase dari B. stearothermophillus DSM 22 memiliki waktu paruh selama menit pada kisaran suhu o C dan kisaran ph 8-9 setelah inkubasi selama 2 jam (Rahman 2005) (Tabel 3). Berdasarkan uji kestabilan dan waktu paruh yang diperoleh, maka dapat diketahui berapa lama ketahanan enzim xilanae AQ1 terhadap suhu dan ph tertentu, sehingga bila diaplikasikan ke dalam proses industri dapat diketahui dalam waktu berapa lama enzim xilanase AQ1 ini masih memiliki sisa aktivitas. Uji penyimpanan enzim xilanase bertujuan untuk mengetahui seberapa besar penurunan aktivitas enzim selama penyimpanan. Hasil uji stabilitas penyimpanan menunjukkan bahwa enzim yang disimpan pada suhu dingin relatif lebih stabil bila dibandingkan dengan enzim yang disimpan pada suhu kamar. Tabel 3 Perbandingan waktu paruh enzim xilanase berbagai mikroorganisme Mikroorganisme Bacillus sp. galur TAR-1 Berat Molekul (kda) ph Optimum Suhu Optimum ph Uji Suhu Uji Waktu Paruh (menit) B. licheniformis I B. stearothermophillus DSM 22 Td B. licheniformis AQ1 Td Td : Tidak diketahui Sumber Sunna et al Siahaan 2003, Firdaus 2005 Rahman 2005 Penelitian ini

16 16 Berdasarkan kurva hubungan log aktivitas dengan waktu penyimpanan xilanase B. licheniformis AQ1, waktu paruh yang dimiliki xilanase AQ1 B. licheniformis pada suhu 4 o C sebesar 52.8 hari sedangkan pada suhu 30 o C sebesar 27.9 hari (Gambar 4). Dengan demikian, berdasarkan dua kondisi penyimpanan selama satu bulan, penyimpanan pada suhu 4 o C menunjukkan adanya kestabilan yang lebih baik dibandingkan dengan penyimpanan pada suhu ruang (30 o C). Berdasarkan uji penyimpanan ini juga dapat diketahui berapa lama jangka waktu aktivitas yang dimiliki enzim xilanase AQ1 dapat bertahan. Beberapa enzim dilaporkan stabil selama beberapa bulan jika disimpan pada suhu dingin (0-4 o C). Xilanase yang dihasilkan dari B. stearothermophillus DSM 22 masih memiliki aktivitas relatif sebesar 60.16% setelah penyimpanan selama satu bulan pada suhu 4 0 C (Lismawati 2003). Xilanase B. licheniformis I-5 memiliki aktivitas relatif 59.74% setelah penyimpanan selama satu bulan pada suhu 4 0 C (Firdaus 2005). Chaplin dan Bucke (1990) melaporkan bahwa pendinginan di bawah 0 o C dengan penambahan zat aditif yang dapat mencegah pembekuan seperti gliserol secara umum dapat meningkatkan stabilitas penyimpanan. Menurut Palmer (1985), autolisis dan denaturasi enzim meningkat sebanding dengan umur simpan. Penggunaan suhu rendah (bukan suhu pembekuan) dalam penyimpanan enzim dapat membantu menjaga kestabilan enzim karena lebih sedikitnya kemungkinan untuk terjadinya denaturasi akibat perubahan suhu yang merusak struktur tiga dimensi enzim dan dapat mencegah pertumbuhan serta serangan bakteri. Pada suhu rendah, enzim juga dapat mengalami penurunan aktivitas (Rahman 2005). Elektroforesis adalah pergerakan molekul bermuatan di dalam medan listrik. Kecepatan gerak molekul dipengaruhi oleh kekuatan medan listrik, bobot molekul, viskositas dan suhu (Boyer 1993). SDS-PAGE menggunakan protein yang didenaturasi terlebih dahulu dengan β-merkaptoetanol. β-merkaptoetanol akan mereduksi semua ikatan disulfida yang ada pada protein. Senyawa SDS yang ditambahkan pada sampel enzim merupakan detergen anionik. SDS kemudian menyelubungi subunit penyusun protein dengan muatan negatif, dan akan bermigrasi berdasarkan berat molekul ke arah anoda dengan kecepatan berbanding terbalik terhadap logaritma berat molekulnya (Le Maire 1991; Boyer 1993). Zimogram merupakan salah satu metode elektroforesis untuk memperkirakan bobot molekul protein ekstrak kasar yang memiliki aktivitas terhadap substrat tertentu. Pewarnaan gel akan menunjukkan pita yang memiliki aktivitas terhadap substrat tertentu sehingga dapat digunakan untuk memperkirakan bobot molekul enzim yang diuji dengan membandingkan posisi pita dengan penanda pembanding (Khasin et al. 1993, Sunna et al. 1996). Hasil SDS-PAGE (Gambar 5, 6, 7, dan 8) tidak menunjukkan adanya fraksi pita protein yang jelas pada xilanase AQ1. Pita protein tampak menumpuk dan tidak terpisah sehingga bobot molekul yang dimiliki oleh xilanase AQ1 tidak dapat ditentukan. Hal ini menunjukkan bahwa protein dari sampel enzim xilanase B. licheniformis AQ1 belum murni dan memiliki lebih dari satu jenis enzim yang memiliki struktur 3 dimensi kompleks, sehingga pada proses elektroforesis tidak tampak fraksi pita protein. Dari hasil analisis zimogram menggunakan gel pemisah 7.5, 10, dan 12 % dapat terlihat adanya aktivitas hidrolitik enzim terhadap substrat oatspelt xylan, beechwood xylan, dan CMC, tetapi pita aktif tersebut tidak bermigrasi di dalam ketiga konsentrasi gel tersebut. Dengan demikian, bobot molekul enzim tidak dapat diperkirakan dengan metode zimogram. Berdasarkan hasil penelitian SDS-PAGE pada enzim xilanase B. licheniformis AQ1 rekombinan, enzim xilanase dapat terekspresi dalam E. coli dan memiliki bobot molekul pita protein aktif sebesar 20 kda (Helianti 2007, komunikasi pribadi). Kulkarni (1995) melaporkan xilanase yang dihasilkan oleh Bacillus sp. NCIM 59 merupakan glikoprotein. Kemungkinan protein xilanase AQ1 juga merupakan glikoprotein sehingga bobot molekul xilanase asal lebih besar daripada xilanase AQ1 rekombinan. Oleh karena itu, untuk memperoleh fraksi pita protein yang diharapkan, enzim xilanase B. licheniformis AQ1 perlu dimurnikan terlebih dahulu. Kulkarni et al. (1999) melaporkan bahwa secara umum xilanase dari berbagai mikroorganisme memiliki berat molekul dengan kisaran kda. Xilanase dari mikroorganisme berbeda akan memiliki berat molekul yang berbeda. Xilanase B. licheniformis galur K-3D memiliki berat

17 17 molekul sebesar 69 kda dan xilanase B. flavothermus galur LB3A memiliki berat molekul 130 kda (Sunna et al. 1997). Firdaus (2006) melaporkan bahwa hasil analisis zimogram dari xilanase B. licheniformis I-5 memiliki pita protein sebesar 127 kda yang menunjukkan adanya perbedaan intensitas pita dengan menggunakan substrat oatspelt xylan dan beechwood xylan. Intensitas pita dengan menggunakan oatspelt xylan lebih tinggi bila dibandingkan dengan menggunakan beechwood xylan, karena oatspelt xylan terdapat dalam struktur yang lebih sederhana jika dibandingkan dengan beechwood xylan (Firdaus 2006). Beechwood xylan terdapat dalam bentuk O-asetil-4-Ometilglukoronoxilan, sedangkan oatspelt xylan terdapat dalam bentuk yang lebih sederhana, yaitu asam D-glukoronik, 4-Ometil eter dan arabinosa (Kulkarni et al. 1999). Selain itu, enzim xilanase AQ1 juga memiliki aktivitas terhadap CMC. Hal ini terlihat dari adanya pita protein aktif yang memiliki aktivitas hidrolitik enzim terhadap substrat CMC. Pengujian xilanase terhadap substrat jenis CMC perlu dilakukan karena menurut Tjusibo et al. (1991) ada beberapa xilanase yang tidak hanya dapat menghidrolisis xilan namun juga selulosa. Aktivitas pada substrat CMC ini menunjukkan dihasilkannya enzim selulase yang memiliki aktivitas hidrolitik terhadap struktur selulosa. Berdasarkan hasil zimogram juga dapat diketahui bahwa enzim xilanase AQ1 tidak memiliki aktivitas terhadap amilum. Hal ini dapat diketahui dengan tidak adanya pita protein aktif yang memiliki aktivitas hidrolitik enzim terhadap substrat amilum. Tidak adanya aktivitas pada substrat amilum ini menunjukkan tidak dihasilkannya enzim amilase yang memiliki aktivitas hidrolitik terhadap struktur amilum. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Polietilen glikol (PEG) 6000 dapat digunakan untuk memekatkan xilanase B. licheniformis AQ1. Konsentrasi PEG yang menghasilkan aktivitas unit xilanase B. licheniformis AQ1 tertinggi terdapat pada konsentrasi PEG 50%, namun menyebabkan penurunan aktivitas spesifik sebesar 27.7% dibandingkan enzim ekstrak kasar tanpa PEG. Termostabilitas xilanase AQ1 pada berbagai suhu dan ph, menunjukkan kestabilan panas xilanase cenderung menurun seiring dengan waktu inkubasi enzim selama 120 menit. Berdasarkan hasil uji stabilitas penyimpanan menunjukkan bahwa enzim xilanase AQ1 yang disimpan pada suhu 4 o C memiliki waktu paruh 52.8 hari, sedangkan pada suhu ruang (30 o C) hanya 27.9 hari. Analisis zimogram dengan menggunakan substrat oatspelt xylan, beechwood xylan, dan Carboxymethyl cellulose menunjukkan kemampuan enzim untuk menghidrolisis substrat, namun bobot molekul xilanase B. licheniformis AQ1 tidak dapat diperkirakan. Saran Perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui konsentrasi PEG yang paling baik untuk memekatkan xilanase B. licheniformis AQ1 dengan menggunakan PEG khusus untuk analisis. Selain itu, perlu dilakukan karakterisasi yang lebih lengkap dan ditentukan bobot molekul yang tepat dari xilanase AQ1. Demikian pula perlu dilakukan pemurnian enzim, seperti dengan menggunakan teknik kromatografi. DAFTAR PUSTAKA Agustine W Penentuan kondisi optimum pertumbuhan dan produksi xilanase isolat AQ1. [skripsi].bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bailey MJ Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Biotechnology 23: Balows A, Truper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH The Prokaryotes. Ed ke-2. New York: Springer Verlag. Boyer RF Modern Experimental Biochemistry. Edisi ke-2. California: The Benjamin Cummings Publishing Company. Bradford M A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Ann Biochem 72: Chaplin MF, Bucke C Enzyme Technology. Cambridge: Cambridge University Press. Copeland RA Methods for Protein Analysis: A Practical Guide To Laboratory Protocols. New York: Chapman and Hall.

18 18 Daniel RM The upper limits of enzyme thermal stability. Enzyme Microb Technol 19: Firdaus RA Karakterisasi xilanase Bacillus licheniformis I-5. [skripsi]. Depok: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. Godfrey T, Reichelt J Industrial Enzymology. Britain: The Nature Pr. Gupta R, Bradoo S, Saxena RK Rapid purification of extracellular tannase using polyethylene glycol-tannic acid complex. Appl Microbiol 24: Harris EL, Angal S Protein Purification Methods : A Practical Approach. New York: Oxford Univ Pr. Irawan Karakterisasi xilanase bakteri xilanolitik termofilik yang diisolasi dari sumber air panas Gunung Pancar Bogor [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Khasin A, Iris A, Shoham Y Purification and characterization of a thermostable xylanase from B. stearothermophillus T-6. Appl Environ Microbiol 59: Kubata BK, Suzuki T, Horitsu H, Kawal K, Takamizawa K Purification and characterization of Aeromonas caviae ME-1 xylanases V, which produces exclusively xylobiose from xylan. Appl Environ Microbiol 60: Kulkarni N, Chauthaiwale J, Rao M Characterization of the recombinant xylanases in E. coli from an alkaliphilic thermophilic Bacillus sp. NCIM 59. Enzyme Microb Technol 17: Kulkarni N, Shendye A, Rao M Moleculer and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiol Rev 23: La Grange DC, Pretorius IS, Glaesysens M, Van Zyl WH Degradation of xylan to D-xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae coexpresing the Aspergillus niger b-xylosidase (Xln O) and the Trhichoderma reesei xylanase II (Xyn 2) genes. Appl Environ Microbiol 67: Lehninger A Dasar Dasar Biokimia. Volume ke-1. Suhartono MT, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari Principles of Biochemistry. Le Maire M, Chabaud R, Herve G Laboratory guide to biochemistry, enzymology, and protein physical chemistry. New York : Plenum Press. Lin J, Ndlovu LM, Singh S, Pillay B Purification and biochemical characteristics of β-d-xylanase from thermophilic fungus, Thermomyces lanuginosus-ssbp. Biotechnol Appl Biochem 30 : Lismawati S Penggunaan molase pada media kulit buah pisang nangka Musa (AAB) dan media pisang kapendis Musa (AAA) untuk produksi xilanase dari Bacillus stearothermophillus DSM 22. [skripsi]. Jakarta: Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila. Nakamura S, Wakabayashi, Nakai R, Aono R, Horikoshi K Purification and some properties of an alkaline xylanase from alkaliphilic Bacillus sp. strain 41M1. Appl Environ Microbiol 59: Nakamura et al Thermophilic alkaline xylanase from newly isolated alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp. strain TAR-1. Biosci Biotechnol Biochem 58: Palmer T Understanding Enzymes. Edisi ke-2. Chichester : Ellis Horwood. Pelczar MF, Chan ECS Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press. Rahman T Karakterisasi xilanase bakteri termofilik isolat lokal dan Bacillus stearothermophilus DSM 22. [skripsi]. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Ratanakhanokchai K, Kyu KL, Tanticharoen M Purification and properties of a xylan-binding endoxylanase from alkalophilic Bacillus sp. strain K-1. Appl Environ Microbiol 65: Richana N Produksi dan prospek enzim xilanase dalam pengembangan bioindustri di Indonesia. J Agrobiol 5(1): Royer JC, Nakas JP Simple, sensitive zymogram technique for detection of xylanase activity in polyacrylamide gels. Appl Environ Microbiol Ryan RE et al Purification and characterization of a new low molecular weight endoxylanase from Penicillium capsulatum. Enzyme Microb Technol 33:

19 Saha BC Purification and characterization of an extracellular β- xylosidase from a newly isolated Fusarium verticilloides. J Indust Microb Biotechnol 27: Scopes RK Protein Purification, Principles and Practice. Ed ke-2. New York: Springer-Verlag Siahaan HM Karakterisasi xilanase termofil dari isolat Bacillus sp. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Slepecky RA, Hemphill HE The Genus Bacillus Nonmedical. Di dalam: Balows A, Truper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH. The Prokaryotes. Ed ke-2. New York: Springer Verlag. Subramaniyan S, Prema P Biotechnology of microbial xylanases: enzymology, molecular biology and application. Critical Rev Biotech 22: Suhartono MT Enzim dan Bioteknologi. Bogor: Pusat Antar Universitas Biotek, Institut Pertanian Bogor. Suhartono MT Bioteknologi enzim termostabil. Bul Teknol Indust Pangan 5: Sunna A, Pruwe SG, Stoffregen T, Antranikian G Characterization of the xylanases from the new isolated thermophilic xylan degrading Bacillus thermoleovorans strain K-3d and Bacillus flavothermus strain LB3A. FEMS Microbiol 148: Thonthowi H, Marni YF, Richana N Pemurnian parsial α-amilase Bacillus stearothermophillus TII-12 dengan sistem dua fase polietilena glikolgaram fosfat. J Mikrob Indon 6: Tjusibo H, et al Purification, properties, and partial amino acid sequences of thermostable xylanases from Streptomyces thermoviolaceus OPC Appl Environ Microbiol 58: Viikari L, Kantelinen A, Sundquist J, Linko M Xylanases in bleaching: from an idea to the industry. FEMS Microbiol 13: Whitaker JR Principles of Enzymology for The Food Science. New York: Marcel Dekker Inc. Winarno Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia 19

20 LAMPIRAN 20

21 21 Lampiran 1 Struktur xilan (Kulkarni et al. 1999) Lampiran 2 Kurva standar xilosa Absorbansi (540 nm) y = x R 2 = Kadar Xilosa (mg/ml)

22 22 Lampiran 3 Kurva standar protein bovin serum albumin (BSA) Absorbansi (595 nm) y = x R 2 = Kadar BSA (mg/ml) Lampiran 4 Rumus pengukuran aktivitas xilanase (Bailey 1992) Aktivitas Xilanase (U/ml) : [X] x 1000 Keterangan: [X] 151 x 5 x 0,2 : Jumlah total xilosa yang dihidrolisis dari xilan 1000 : Faktor perubah dalam µmol 151 : Berat molekul xilosa 5 : Waktu inkubasi pada suhu optimum (menit) 0,2 : Jumlah (volume) enzim yang digunakan dalam analisis (ml) Lampiran 5 Komposisi gel poliakrilamida (5, 7.5, 10, dan 12%) (Copeland 1994) Bahan Aquades Tris-HCl ph 6.8 SDS Akrilamid APS 10% TEMED Tris-HCl ph 8.8 Gel Penahan Gel Poliakrilamida 5% 1525 µl 675 µl 20 µl 325 µl 25 µl 5 µl - Gel Poliakrilamida 7.5% 2400 µl - 50 µl 1250 µl 50 µl 10 µl 1250 µl Gel Pemisah Gel Poliakrilamida 10% 1565 µl - 50 µl 1665 µl 50 µl 10 µl µl Gel Poliakrilamida 12% 1700 µl - 50 µl 2000 µl 50 µl 10 µl 1300 µl