Jurnal Kimia Indonesia

Transkripsi

1 Jurnal Kimia Indonesia Vol. 1 (1), 2006, h Karakterisasi Enzim -Amilase Ekstrasel dari Isolat Bakteri Termofil SW2 Siswati Setiasih, 1 Budiasih Wahyuntari, 2 Trismilah, 3 dan Dewi Apriliani 1 1 Departemen Kimia FMIPA Universitas Indonesia Kampus Baru Depok, Jawa Barat 2,3 Pusat Pengkajian dan Penerapan Teknologi, BPPT PUSPITEK, Serpong, Tangerang Banten 1 setiasih@makara.cso.ui.ac.id; 2 budiasih_solichin@yahoo.com; 3 trismilah_m@yahoo.com.id Abstrak. Dalam penelitian ini digunakan isolat bakteri termofil SW2, dari Pusat Pengolahan Kompos, sebagai sumber enzim -amilase ekstrasel. Isolasi enzim dilakukan setelah bakteri tersebut diaktifkan dan dikultur dalam medium yang mengandung pati kentang pada suhu 60 C, ph 7,5 selama 39 jam. Enzim -amilase ekstrasel yang diperoleh memiliki keaktifan optimum pada suhu 70 C, dan ph 6,0. Enzim ini merupakan -amilase logam karena keaktifan katalitiknya dapat ditingkatkan oleh ion logam, seperti Na +, K +, Mn + dan Ca 2+ serta diinhibisi sangat kuat oleh Zn 2+, Fe 2+ dan EDTA. Keaktifan enzim ini juga diturunkan oleh adanya senyawa SDS dan urea. Sedangkan efek penyimpanan selama 4 bulan pada suhu kamar dapat menurunkan keaktifan enzim hingga mencapai + 50%. Massa molekul enzim kasar ditentukan dengan metode elektroforesis SDS-poliakrilamid dan diperoleh sekitar 1 kda. Kata kunci: -Amilase, termofil, kompos, ekstrasel, inhibisi. Pendahuluan Berbagai jenis isolat mikroorganisme telah didapatkan dan diketahui memiliki peranan yang besar sebagai penghasil enzim yang berguna dalam industri. Enzim digunakan dalam industri karena bersifat sangat spesifik dibandingkan dengan katalis anorganik. Selain itu, enzim bekerja sangat efisien, beroperasi pada kondisi lunak, aman dan mudah dikontrol, dapat menggantikan bahan kimia yang berbahaya, dan dapat didegradasi secara biologis. 1 Enzim mempunyai nilai ekonomi tinggi. Dalam industri pangan, enzim amilase berfungsi menyediakan gula hidrolisis pati sehingga dapat dimanfaatkan untuk produksi sirup glukosa ataupun sirup fruktosa yang mempunyai tingkat kemanisan tinggi, pembuatan roti, dan makanan bayi. Di industri tekstil enzim amilase digunakan untuk membantu dalam proses penghilangan pati, yang digunakan sebagai perekat untuk melindungi benang saat ditenun agar lentur. Proses ini memerlukan suhu sekitar 70- C. Mikroorganisme termofil dapat menghasilkan enzim yang tahan terhadap suhu tinggi. Kelebihan pada proses industri yang menggunakan suhu tinggi antara lain dapat meningkatkan laju reaksi kimia termasuk reaksi enzimatis, efisien, dan dapat mengurangi kontaminasi. 2-4 Enzim -amilase adalah enzim ekstrasel yang mengkatalisis reaksi pemotongan ikatan glukosidik 1,4 pada bagian dalam molekul substrat (endoenzim). Secara komersial enzim ini dihasilkan baik oleh bakteri seperti dari genus Bacillus, maupun kapang dari genus Aspergillus dan Rhizopus. 2,5 Penelitian ini merupakan lanjutan dari penelitian sebelumnya, yang bertujuan memproduksi enzim -amilase ekstrasel. Sebagai sumber enzim digunakan bakteri termofil Bacillus SW2 yang diisolasi dari Pusat Pengolahan Kompos, BSD-Tangerang. Enzim hasil isolasi tersebut selanjutnya akan digunakan dalam industri tekstil. Alasan utama dari pemanfaatan mikroorganisme adalah untuk menghemat biaya impor enzim tersebut. Sel mikroorganisme merupakan sumber penghasil enzim yang sangat potensial karena untuk peningkatan produksi enzim dapat dilakukan dengan lebih mudah, misalnya dengan cara pengaturan kondisi lingkungan pertumbuhannya. Fokus pekerjaan dari penelitian ini adalah pada uji karakterisasi enzim kasar hasil pemekatan melalui ultrafiltrasi. Uji keaktifan enzim dilakukan terhadap berbagai pengaruh lingkungan seperti: suhu, ph, aktivator serta inhibitor enzim. Untuk Dapat dibaca di

2 Karakterisasi Enzim -Amilase Ekstraseluler dari Isolat Bakteri Termofil SW2 penentuan massa molekul protein enzim digunakan SDS-PAGE. Percobaan Mikroorganisme. Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat bakteri termofil SW2 bersifat gram positif berbentuk batang, koloni bulat tidak beraturan berwarna krem, tebal dan tidak tembus pandang. Bakteri tersebut diisolasi dari pusat pengolahan kompos BSD, Tangerang, dan biakannya dipelihara serta diperbanyak pada medium agar. Media. Komposisi media agar yang digunakan adalah maizena 2%, agar teknis 1,65%, gum gellan Gelrite 0,35%, ekstrak ragi 0,5%, bacto pepton 0,5%, K 2 HPO 4 0,05%, MgSO 4.7H 2 O 0,05%, CaCl 2.2H 2 O 0,1%. Komposisi media fermentasi terdiri atas, pati kentang 1%, ekstrak ragi 0,5%, bacto pepton 0,5%, K 2 HPO 4 0,05%, MgSO 4.7H 2 O 0,05%, CaCl 2.2H 2 O 0,1% Fermentasi. Inokulum yang telah disiapkan dimasukkan secara aseptik ke dalam media fermentasi (90% volume produksi), lalu diinkubasi selama 39 jam pada suhu 60 C di dalam shaker incubator yang berkecepatan 150 rpm. Cairan fermentasi (broth) yang mengandung -amilase ekstrasel dipisahkan dari selnya dengan cara disentrifus pada kecepatan 4000 rpm, 4 C selama 30 menit. Filtrat enzim yang didapat kemudian dipekatkan 10 kali dengan ultrafiltrasi menggunakan membran pemisah berukuran 30 kilodalton (Kda). Penentuan keaktifan enzim. Penentuan keaktifan ini berdasarkan pada penguraian substrat oleh enzim. Keaktifan -amilase ditentukan dengan metode kolorimetri Fuwa. 6,7 Satu unit keaktifan enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menyebabkan penurunan warna sebesar 50% pada kondisi di atas. Penentuan kadar protein. Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford, dan sebagai standar protein digunakan larutan bovine serum albumin. 8,9 Pengaruh suhu dan ph. Kondisi optimum bagi keaktifan enzim -amilase ditentukan dengan cara memvariasikan suhu (yaitu: 20, 30, 40, 50, 60, 70,, 90, dan C) dan memvariasikan ph pada suhu optimumnya (yaitu: ph 4,0; 5,0; 6,0 menggunakan dapar sitrat 20 mm; ph 6,0; 7,0; 8,0 menggunakan dapar fosfat 20 mm; dan ph 9,0; 10,0 menggunakan dapar glisin NaOH). Kestabilan penyimpanan -amilase ditentukan dengan cara menyimpan filtrat enzim pada suhu kamar (30 C) dan suhu dingin (4 C). Kemudian secara berkala dilakukan pengujian keaktifan enzimnya, selama 4 bulan penyimpanan yang diukur pada suhu dan ph optimum enzim. Pengaruh berbagai ion logam dan agen-agen pendenaturasi. Filtrat yang mengandung enzim diikubasi dengan berbagai senyawa ion logam (KCl, LiCl, FeCl 3.6H 2 O, NaCl, CaCl 2.2H 2 O, MgCl 2.6H 2 O, NiCl 2.6H 2 O, ZnCl 2, MnCl 2.4H 2 O) masing-masing pada konsentrasi 1 mm, 5 mm, dan 10 mm selama 30 menit. Sedangkan pengaruh agen-agen pendenaturasi protein dilakukan dengan cara menginkubasi filtrat enzim dengan senyawa SDS (konsentrasi 0,4%, 1,0% dan 1,5%), EDTA dan urea (konsentrasi 1 mm, 5 mm dan 10 mm) selama 30 menit. Keaktifan -amilase diukur pada suhu dan ph optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya. Penentuan massa molekul enzim kasar. Enzim hasil isolasi ditentukan massa molekulnya secara elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid natrium dodesil sulfat 7,5% (SDS/PAGE) Zimogram dibuat dengan standar marker High Molecular Weight (HMW-SDS) (Amershem Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Gel hasil elektroforesis diinkubasi dalam larutan amilum dan pita-pita protein yang terpisah diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue R ,10 Hasil dan Pembahasan Produksi Enzim. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, kondisi optimum proses fermentasi dilakukan pada suhu 60 C, ph awal 7,5 selama 39 jam di dalam shaker incubator yang berkecepatan 150 rpm. 11 Cairan fermentasi yang diperoleh dipisahkan dari selnya dengan cara disentrifuga pada kecepatan 4000 rpm, 4 C selama 30 menit, kemudian dipekatkan 10 kali dengan ultrafiltrasi. Pemekatan dengan ultrafiltrasi berdasarkan pada kemampuan membran dengan tekanan hidrostatik tinggi untuk menahan komponen yang mempunyai ukuran partikel yang relatif besar serta melewatkan pelarut dan zat terlarut dengan ukuran partikel yang lebih kecil, sehingga didapatkan filtrat enzim yang lebih murni. 12 Pemekatan juga bertujuan agar enzim lebih stabil selama masa penyimpanan. Hasil penentuan keaktifan enzim -amilase ekstrasel yang terdapat dalam supernatan dapat dilihat pada Tabel 1. Pemekatan enzim dengan ultrafiltrasi menyebabkan tingkat kemurnian naik sebesar 50 kali dibandingkan broth, kenaikan ini disebabkan karena molekul air dan juga protein lain yang 23

3 Siswati Setiasih, Budiasih Wahyuntari, Trismilah, dan Dewi Apriliani ukurannya lebih kecil dari 30 kda dapat terlewatkan sehingga memberikan kenaikan keaktifan spesifik. Karakterisasi. Suhu optimum bagi keaktifan -amilase yang diperoleh dari hasil percobaan yaitu 70 C. Di bawah suhu optimum (60 C) dan di atas suhu optimum (90 C), enzim masih memiliki keaktifan sebesar ±66%. Pada C enzim masih memiliki keaktifan sebesar ±77% dibandingkan keaktifan pada suhu optimumnya (Gambar 1). Hasil penelitian lain menyatakan bahwa -amilase termofil memiliki keaktifan antara 60- C dan Tabel 1. Tahap Pemekatan -Amilase Ekstraseluler SW2 Volume Keaktifan Total Protein Total Keaktifan Spesifik Tingkat (ml) Rata 2 (unit) (unit) Rata 2 (mg/ml) (mg) (unit/mg protein) Kemurnian Broth , , ,9 1,005 Supernatan (sentrifus) , ,4 0,027 51,775 40, Supernatan 200 4, ,2 0,093 18,69 49, (ultrafiltrasi) Filtrat , , (ultrafiltrasi) Aktivitas relatif (%) Suhu ( O C) Gambar 1. Pengaruh suhu terhadap keaktifan -amilase ekstraseluler SW2 Aktivitas relatif (%) ph Gambar 2. Pengaruh ph terhadap keaktifan -amilase ekstraseluler SW2 24 Jurnal Kimia Indonesia Vol. 1(1), 2006

4 Karakterisasi Enzim -Amilase Ekstraseluler dari Isolat Bakteri Termofil SW2 kehilangan keaktifannya pada suhu di bawah 40 C. 3 Sedangkan enzim -amilase ekstrasel dari isolat bakteri termofil SW2 menjadi tidak aktif pada C. Penentuan ph optimum enzim -amilase ekstrasel dari isolat bakteri termofil SW2 ini dilakukan pada suhu 60 C. Gambar 2 menunjukkan bahwa keaktifan enzim tertinggi diperoleh pada ph 6. Keaktifan enzim relatif masih tinggi baik pada ph 5 maupun pada ph antara 7 9 akan tetapi pada ph di bawah 5 dan di atas ph 9 keaktifan enzim menurun drastis. Pengaruh berbagai ion logam dan senyawa pendenaturasi. Untuk mengetahui pengaruh beberapa ion logam terhadap keaktifan enzim, maka dalam percobaan ini digunakan beberapa senyawa garam klorida, yaitu: KCl, FeCl 3.6H 2 O, NaCl, CaCl 2.2H 2 O, MgCl 2.6H 2 O, NiCl 2.6H 2 O, ZnCl 2, MnCl 2.4H 2 O. Senyawa garam klorida digunakan karena pengaktifan amilase menurun sesuai urutan Cl - > Br - > I Penambahan ion K + pada konsentarasi 1 mm menurunkan keaktifan enzim sebesar ±4%, sedangkan pada konsentrasi 5 mm dan 10 mm ion K + meningkatkan keaktifan enzim masing-masing sebesar ±2% dan ±4%. Ion Na + menaikkan keaktifan enzim pada konsentrasi 1 mm dan 5 mm masing-masing sebesar ±6% dan ±2%, sedangkan pada konsentrasi 10 mm ion Na + menurunkan keaktifan enzim sebesar ±2%. Pada konsentrasi 1 mm dan 5 mm ion Ca 2+ menaikkan keaktifan enzim masing-masing sebesar ±2% dan ±3%, sedangkan pada konsentrasi 10 mm ion Ca 2+ menurunkan keaktifan enzim sebesar ±7%. Ion Mn 2+ menaikkan keaktifan enzim sebesar ±5% pada konsentrasi 1 mm, selanjutnya kenaikan konsentrasi ion Mn 2+ menyebabkan keaktifan enzim menurun yaitu sebesar ±1% pada 5 mm dan ±12% pada 10 mm. Ion Mg 2+ menurunkan keaktifan enzim, dan penurunannya sejalan dengan bertambahnya konsentrasi ion Mg 2+, pada konsentrasi 1 mm, 5 mm dan 10 mm, keaktifan enzim menurun masing-masing sebesar ±8%, ±10% dan ±20%. Ion Zn 2+ dan Fe 3+ menyebabkan enzim sama sekali tidak aktif baik pada konsentrasi 1 mm, 5 mm maupun 10 mm. Begitu pula dengan ion Ni 2+ pada konsentrasi 5 mm dan 10 mm, pada konsentrasi ion Ni 2+ 1 mm keaktifan enzim turun sampai dengan ±24%. Berdasarkan data tersebut (Gambar 3) maka terdapat empat macam ion logam yang dapat meningkatkan keaktifan - amilase hasil isolasi yaitu K +, Na +, Ca 2+ dan Mn 2+ serta tiga macam ion logam yang dapat menghilangkan keaktifan -amilase hasil isolasi yaitu Ni 2+, Zn 2+ dan Fe 3+. Pada Gambar 3, adanya penambahan EDTA (sebagai pengkelat logam) pada berbagai konsentrasi menunjukkan bahwa keaktifan enzim -amilase ini hampir seluruhnya hilang. Dari data tersebut, -amilase hasil isolasi dapat digolongkan sebagai -amilase logam. 120 aktivitas relatif (%) None Na+ Mn2+ Ni2+ Fe3+ Urea senyawa 1 mm 5 mm 10 mm Gambar 3. Pengaruh ion logam, senyawa pengkelat dan pendenaturasi protein terhadap keaktifan -amilase ekstrasel SW2. 25

5 Siswati Setiasih, Budiasih Wahyuntari, Trismilah, dan Dewi Apriliani 105 aktivitas relatif (%) SDS 0% 0,40% 1,0% 1,5% Gambar 4. Pengaruh berbagai konsentrasi deterjen anionik (sulfonil dedosil sulfat) terhadap keaktifan -amilase ekstrasel SW2 Untuk mengetahui adanya pengaruh detergen anion, maka dalam percobaan digunakan SDS dengan konsentrasi sebesar 0,4%, 1,0% dan 1,5%. Dari data hasil percobaan (Gambar 4) terlihat keaktifan enzim menurun sejalan dengan bertambahnya konsentrasi SDS. Urea sebagai agen pendenaturasi protein juga mempengaruhi keaktifan enzim. Pada Gambar 3 konsentrasi urea 1 mm keaktifan enzim naik sampai ±6%. Selanjutnya keaktifan enzim menurun sejalan dengan bertambahnya konsentrasi urea. Pada konsentrasi urea 5 mm dan 10 mm keaktifan enzim menurun masing-masing sebesar ±1% dan ±20%. Gel Elektroforesis. Dari hasil elektroforesis (Gambar 5) diperoleh satu pita protein yang menunjukkan keaktifan katalitik enzim terhadap substrat pati. Terdapat beberapa hasil penelitian yang melaporkan bahwa isolasi -amilase dari sumber mikroorganisme termofil akan menghasilkan dua bentuk enzim -amilase. Menurut Long-Liu Lin et al 1 apabila sumber karbon yang digunakan pada fermentasi berasal dari pati terlarut akan teridentifikasi dua pita amilase dengan massa molekul sekitar 150 dan 42 kda. Akan tetapi apabila sumber karbon berasal dari pati mentah hanya satu pita amilase dengan massa molekul sekitar 150 kda yang dapat teridentifikasi, karena protein dengan massa molekul 42 kda kemungkinan diabsorbsi oleh sumber karbon yang tidak larut dalam air. Percobaan ini menggunakan pati mentah yang berasal dari kentang sehingga hanya amilase dengan massa molekul yang besar dapat teridentifikasi. Dengan menggunakan standar massa molekul diperkirakan pita protein yang memiliki keaktifan mengkatalisis pati tersebut memiliki massa molekul sekitar 1 kda. (a) (b) Gambar 5. a.) Hasil uji elektroforesis (SDS-PAGE) enzim kasar -amilase ekstrasel SW2 (1 dan 2 = native enzim; 3 dan 4 = enzim yang terdenaturasi); b) penanda massa molekul protein Kesimpulan Karekterisasi terhadap enzim kasar -amilase hasil isolasi dari bakteri termofil SW2 telah berhasil dilakukan. Diketahui bahwa enzim ini merupakan enzim ekstrasel dengan suhu dan tingkat keasaman optimum berturut-turut pada 70 C dan ph 6,0. Sebagai tambahan, penelitian ini berhasil mengidentifikasi pengaruh ion-ion logam dan senyawa-senyawa pendenaturasi terhadap keaktifan katalitiknya. Karakter penting lainnya seperti kestabilan keaktifan menunjukkan bahwa Jurnal Kimia Indonesia Vol. 1(1), 2006

6 Karakterisasi Enzim -Amilase Ekstraseluler dari Isolat Bakteri Termofil SW2 keaktifan enzim dapat dipertahankan pada suhu yang relatif rendah selama proses penyimpanannya (hasil tidak dicantumkan dalam makalah ini). Penghargaan. Penelitian ini dibiayai atas dana hibah Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Kementerian Ristek Republik Indonesia. Peneliti sangat berterima kasih atas fasilitas yang diberikan untuk melaksanakan sebagian dari penelitian ini kepada Pusat Pengkajian dan Penerapan Teknologi (PPPT), Serpong. Pustaka 1. Long-Liu Lin; Charng-Cherng Chyau; Wen-Hwei Hsu Biotechnol. Appl. Biochem, 1998, 28, Jei-Fu Shaw, Fu-Pang Lin, Su-Chiu Chen & Hsing- Chen Chen. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 1995, 36, Vielle, C., G.J. Zeikus. Microbiology and Molecular biology Reviews, 2001, 65(1), Trismilah, Sumaryanto, Esti, W. Enzim -amilase dari B. Stearothermophilus DSM22 Menggunakan Kulit Buah Pisang Nangka sebagai Substrat dalam Prosiding Seminar Nasional Kimia Surabaya, Dyah, P.M. Studi tentang Enzim Amilase Penghidrolisis Pati Mentah Ubi Kayu dari Streptomyces sp. dalam Prosiding Seminar Bioteknologi Biomassa BPPT I. Jakarta, Taji, N. (ed.). Handbook of amylase and related enzymes: Their sources, isolation methods, properties and applications. 1 st edition. Pergamon Press: New Jersey, Wiseman, A., (ed.). Topics in Enzymes and Fermentation Biotechnology. Ellis Horwood Limited: New York, Kruger, N.J. J.M. Walker, (ed.). Methods in molecular biology (32) Basic protein and peptide protocols. Humana Press: New Jersey, Bradford, M.N. Anal. Biochem., 1976, 72, Boyer, R.F. Modern experimental biochemistry. 2 nd edition. Benjamin/Cumming Publishing: London, Widyasti, E. Isolasi dan optimasi suhu dan ph pertumbuhan bakteri termofilik penghasil -amilase termostabil dalam Seminar Masalah Khusus Jurusan Biologi FMIPA IPB, Bogor, Copeland, R.A. Methods for Protein Analysis: A Practical Guide to Laboratory Protocols. Chapman and Hall: New York, Bush, D.S., L. Sticher, Huystee, R. van, D. Wagner, & R.L. Jones. J. Biol. Chem, 1989, 246(32),