ANALISIS UKURAN KROMOSOM DAN POLA RESTRIKSI Bacillus thuringiensis DENGAN ELEKTROFORESIS MEDAN BERPULSA ANDIKA SAPUTRA

Transkripsi

1 ANALISIS UKURAN KROMOSOM DAN POLA RESTRIKSI Bacillus thuringiensis DENGAN ELEKTROFORESIS MEDAN BERPULSA ANDIKA SAPUTRA PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 ABSTRAK ANDIKA SAPUTRA. Analisis Ukuran Kromosom dan Pola Restriksi Bacillus thuringiensis dengan Elektroforesis Gel Medan Berpulsa. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan EDDY JUSUF. Bacillus thuringiensis (BT) merupakan salah satu bakteri yang bermanfaat bagi kehidupan manusia. B. thuringiensis memiliki keistimewaan mensintesis protein δ-endotoksin yang spesifik terhadap serangga tertentu dan beberapa nematoda perusak sehingga sering digunakan sebagai pestisida alami. Laboratorium Biologi Mikroba, LIPI, memiliki beberapa koleksi bakteri BT lokal yang diharapkan merupakan subspesies baru. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan studi awal dari galur-galur lokal BT di daerah sekitar Bogor dan juga untuk memastikan kemungkinan adanya subspesies baru, maka dilakukan uji genotipe dengan menggunakan Elektroforesis Gel Medan Berpulsa. Hasil penelitian menunjukkan secara umum B. thuringiensis memiliki resistensi terhadap antibiotik ampisilin. Isolasi DNA berhasil dilakukan dan dibuktikan dengan elektroforesis. Metode isolasi DNA yang paling cocok untuk PFGE adalah metode plug yang dikembangkan oleh Cantor. Analisis pita restriksi tidak dapat dilakukan dengan baik karena proses restriksi enzim tidak memberikan pita yang jelas tapi justru memberikan pita smear. Perkiraan genom total sementara untuk galur standar berada pada kbp sedangkan untuk galur lokal berada pada kbp. Perhitungan genom total secara nyata dan perkiraan kekerabatan antar galur lokal tidak berhasil dilakukan.

3 ABSTRACT ANDIKA SAPUTRA. Chromosome Sizes and Restriction Patterns Analysis of Bacillus thuringiensis by Pulsed Field Electrophoresis. Under the direction of I MADE ARTIKA and EDDY JUSUF. Bacillus thuringiensis (BT) represents one of worthwhile bacteria for human life. B. thuringiensis is special in that it has ability to synthesize δ- endotoxinprotein specific to certain insect and some nematodes so that often used as a natural pesticide. The Biological Laboratory of Microbe, LIPI, has some bacterium collection of local BT expected to represent new subspecies. This research is intended as an early study of local BT strains around Bogor and also to confirm the possibility of new subspecies, in the present study genotyping is conducted using Pulsed Field Gel Electrophoresis. The results showed that in general the B. thuringiensis show resistancy to ampicillin antibiotic. DNA isolation was successfully conducted and proved by electrophoreses. The most suited method for DNA isolation for PFGE is the plug method developed by Cantor. Band analysis of restriction patterns cannot be carried out because restriction process did not give clear bands but gave smearing bands. Estimation of the total Genome for standard strains is kbp while for local strains is kbp. Accurate calculation for total genome and relatedness prediction for local strains could not be conducted.

4 ANALISIS UKURAN KROMOSOM DAN POLA RESTRIKSI Bacillus thuringiensis DENGAN ELEKTROFORESIS MEDAN BERPULSA ANDIKA SAPUTRA Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

5 Judul Nama NIM : Analisis Ukuran Kromosom dan Pola Restriksi Bacillus thuringiensis dengan ElektroforesisMedan Berpulsa : Andika Saputra : G Disetujui Dr. Ir. I Made Artika M. App. Sc Ketua Drs. Eddy Jusuf DES Anggota Diketahui Dr. drh. Hasim, DEA Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Tanggal lulus :

6 PRAKATA Bismillahirrahmaanirrahim Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan nikmat-nya yang tiada terkira sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan hasil penelitian ini. Bertempat di Laboratorium Biologi Mikroba Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI-Cibinong Bogor, penulis telah melaksanakan penelitian yang berjudul Analisis Ukuran Kromosom dan Pola Restriksi Bacillus thuringiensis dengan Elektroforesis Gel Medan Berpulsa. Penulis pada kesempatan ini ingin mengucapkan terimakasih dan penghargaan kepada Drs. Eddy Jusuf DES dan Dr. I Made Artika M. App. Sc selaku dosen pembimbing yang telah memberikan saran dan pengarahan sehingga penulis dapat melaksanakan penelitiannya dengan baik dan menyelesaikan karya ilmiah ini. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan untuk keluarga penulis, dan sahabat-sahabat penulis yang telah banyak memberi support, teman satu lab, Wisnu, Tutu, Wurian, dan Isra yang telah menemani penulis bekerja juga tak lupa untuk Yanti yang membantu mengecek ulang hasil tulisan penulis dan memberi dukungan moril bagi penulis. Penulis menyadari dalam penulisan hasil penelitian ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari berbagai pihak. Semoga hasil penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi kita semua. Bogor, 18 Januari 2008 Andika Saputra

7 RIWAYAT HIDUP Penulis merupakan anak pertama dari pasangan Cecep Komarudin dan Nurhadiyanti yang dilahirkan di Jakarta pada 30 Desember 1984 dan memiliki empat saudara. Tahun 1996 melanjutkan studinya di Sekolah Menengah Pertama Swasta Setia Negara setelah tamat dari Sekolah Dasar. Tahun 1999 penulis melanjutkan ke SMUN 1 depok dan lulus pada tahun Penulis sempat mengenyam pendidikan di Universitas Indonesia sebelum akhirnya pindah ke Institut Pertanian Bogor pada tahun Selama masa kuliah penulis sempat menjadi asisten praktikum biokimia umum pada tahun 2006/2007. Penulis juga aktif di organisasi kemahasiswaan dan sempat menjadi Ketua Departemen Informasi, Komunikasi dan Kesekretariatan CREBs Biokimia. Penulis mengikuti Praktik Lapang di Laboratorium Biologi Mikroba, Bidang Biologi Molekular dan Mikrob, Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor.

8 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR viii DAFTAR LAMPIRAN... viii PENDAHULUAN TINJAUAN PUSTAKA Bacillus thuringiensis Gen dan Genom... Kromosom... DNA sebagai Materi Genetik.... Analisis Total DNA Genom Enzim Retriksi Endonuklease.... Elektroforesis Medan Berpulsa atau Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE).... BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat..... Metode.... HASIL DAN PEMBAHASAN Induksi Antibiotik... Isolasi DNA Genom... Enzim Restriksi Sma I... Kondisi Optimal Elektroforesis... Analisis Hasil Elektroforesis... SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

9 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Visualisasi Bacillus thuringiensis melalui mikroskop fase kontras Diagram skematik yang menunjukkan hubungan gen dengan struktur- heliks ganda DNA dan sebuah kromosom... 3 Sebuah kromosom eukariot dalam keadaan terkondensasi... 4 Tipe pemotongan blunt end dan tipe pemotongan sticky end Hasil restriksi B. thuringiensis subsp. kurstaki dengan proses isolasi DNA berbeda... 6 Hasil restriksi 12 galur bakteri oleh Sma I pada tegangan 7,1 volt, 20 jam... 7 Hasil restriksi 12 galur bakteri oleh Sma I pada tegangan 6 volt, 20 jam... 8 Hasil restriksi 12 galur bakteri oleh Sma I pada tegangan 6 volt, 17 jam Hasil elektroforesis galur-galur bakteri standar dan lokal yang tidak di restriksi Hasil elektroforesis galur-galur bakteri standar dan lokal yang direstriksi dengan Sma I DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 2 Asal Isolat bakteri Bacillus thuringiensis yang digunakan Tahapan kerja analisis DNA Genom Peremajaan bakteri pada media antibiotik... Proses penyiapan DNA total Proses fragmentasi DNA genom dengan enzim restriksi Sma I Proses elektroforesis dengan PFGE... 20

10 PENDAHULUAN Bakteri Bacillus thuringiensis (BT) sudah sejak lama dikenal sebagai bahan aktif paling umum yang digunakan dalam pembuatan pestisida hayati maupun sebagai sumber gen dalam proses rekayasa tanaman transgenik tahan hama. B. thuringiensis memiliki keistimewaan karena dapat mensintesis protein δ-endotoksin yang spesifik terhadap serangga dan nematoda. Jenis bakteri ini memiliki lebih dari 70 subspesies atau varietas yang berbeda, yang dibedakan oleh perbedaan sifat serologi dari antigen flagelanya, dan menghasilkan lebih dari 300 tipe protein Cry. Studi genom di Indonesia masih jauh tertinggal dari negara-negara tetangga. Oleh karena itu, karakterisasi dari organisasi keseluruhan genom bakteri ini dapat memberikan pendekatan yang baik untuk mempelajari jenis-jenis, varietas, dan galur BT lokal secara akurat dan memungkinkan pemberdayaan galur-galur lokal lebih lanjut. Elektroforesis medan berpulsa atau dikenal sebagai Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) merupakan teknik paling baik untuk mempelajari ukuran dan organisasi genomgenom bakteri. Proses identifikasi spesies dicoba dengan menggunakan enzim pemotong jarang yang diikuti oleh pemisahan fragmenfragmen menggunakan PFGE. Teknik ini telah berhasil diterapkan pada penetapan galur-galur virulen Pseudomonas sp. Penelitian bertujuan untuk mengukur ukuran molekul DNA genom galur-galur bakteri Bacillus thuringiensis dan membandingkan pola restriksi yang dihasilkan untuk lebih memahami hubungan filogenetik antara galur lokal yang diisolasi dari berbagai tempat di sekitar Bogor dengan galur bakteri standar yang ada dalam koleksi Puslit Bioteknologi LIPI. Penggunaan PFGE dalam identifikasi semua molekul DNA dalam berbagai ukuran hasil pemotongan enzim restriksi lebih baik dari teknik elektroforesis konvensional. Probabilitas terdapatnya isolat-isolat lokal yang saling identik cukup besar dan diharapkan terdapat hubungan filogenetik yang erat dengan beberapa galur standar yang tersedia. Penelitian bermanfaat untuk menetapkan kesamaan maupun perbedaan genotip BT hasil pengucilan dari tanah di wilayah Bogor dengan galu-galur standar yang telah diketahui fenotipnya. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa isolat-isolat yang didapat memiliki identitas. Sehingga pemberdayaan isolat-isolat galur lokal sebagai salah satu kekayaan mikrobial Indonesia dapat terwujud. TINJAUAN PUSTAKA Bacillus thuringiensis Seorang ahli biologi dari Jepang, Shigetane Ishiwatari pertama kali mengisolasi bakteri Bacillus thuringiensis (BT) pada tahun 1901 ketika menyelidiki penyebab penyakit sotto yang membunuh sebagian besar populasi ulat sutra. Sepuluh tahun kemudian, Ernst Berliner mengisolasi bakteri yang telah membunuh larva Mediterranean flour moth pada tahun 1911 dan menemukan tipe bakteri yang sama dengan sebelumnya kemudian dinamakannya B. thuringiensis (Gambar 1), mengambil nama sebuah kota Jerman Thuringia tempat serangga tersebut ditemukan. Ishiwatari telah menamakan bakteri ini B. sotto pada tahun 1901 namun nama itu kemudian dinyatakan tidak sah lagi. Pada tahun 1915, Berliner melaporkan keberadaan kristal di dalam BT, namun aktivitas kristal ini belum diketahui hingga beberapa tahun berikutnya. Tahun 1956, beberapa peneliti, Hannay, Fitz-James dan Angus menemukan bahwa aktivitas antiserangga terhadap serangga dari jenis Lepidoptera (ngengat) yang paling besar adalah pada saat pembentukan parasporal kristal yang mengandung δ-endotoksin. Penemuan ini menyebabkan munculnya ketertarikan terhadap struktur kristal, reaksi biokimia dan aktivitas kristal dari BT. Penelitian-penelitian baru mengenai bakteri BT dimulai dengan cepat dan pesat sehingga penggunaan bakteri sebagai pestisida hayati mengalami peningkatan. Bakteri BT tergolong dalam bakteri Gram positif yang terdapat di permukaan tanah. B. thuringiensis adalah bakteri berbentuk batang berspora, bersifat anaerob, dan menghasilkan protein kristal selama masa sporulasi yang bersifat toksik terhadap larva serangga serta mempunyai suhu pertumbuhan minimum o C, suhu maksimum o C dan suhu optimum o C. Gambar 1 Visualisasi Bacillus thuringiensis melalui mikroskop fase kontras