I.1 Latar Belakang Penelitian

Transkripsi

1 Bab I Pendahuluan I.1 Latar Belakang Penelitian Mikroorganisme termofilik merupakan salah satu kelompok mikroorganisme yang memiliki kemampuan hidup dan memperbanyak diri pada temperatur 50 o C hingga 110 o C (Brock dan Freeze, 1969; Brock dan Boylen, 1973). Penelitian terhadap genetika mikroorganisme termofilik telah menghasilkan penggambaran baru dalam pohon filogenetik. Di samping itu, mikroorganisme ini menghasilkan enzim dan protein yang memiliki ketahanan termal lebih tinggi dibandingkan padanan mesofilnya (Vieille dan Zeikus, 2001). Sifat stabilitas termal ini akhirnya menjadi isu penting dalam penelitian pada tingkat struktur protein (Daniel and Cowan, 2000; Bartolucci dkk., 2003). Penelitian terhadap sifat stabilitas termal telah membuka wawasan baru terhadap pengembangan ilmu dasar yaitu pemahaman akan keterkaitan antara pelipatan (folding) protein dan stabilitasnya, maupun aplikasi praktis yaitu untuk keperluan rekayasa enzim sehingga dapat bekerja optimal pada temperatur yang lebih tinggi (Kumar dkk., 2000). Dalam dua dekade terakhir telah terjadi pergeseran paradigma industri biokatalis, enzim yang semula hanya dapat digunakan dalam kondisi biasa (mild condition) saat ini dapat digunakan dalam kondisi ekstrim seperti temperatur tinggi. Salah satu enzim termostabil yang banyak diaplikasikan dalam riset bioteknologi, di antaranya untuk proses PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah enzim DNA Polimerase (Pol) I yang berasal dari mikroorganisme Thermus aquaticus (Taq Polimerase). Teknik PCR (Mullis dkk., 1986) digunakan untuk menggandakan daerah tertentu pada DNA secara in vitro, karenanya dibutuhkan enzim pengganda DNA yang tetap stabil pada temperatur tinggi (Barnes, 1994). Taq Pol I merupakan enzim yang bekerja optimal pada temperatur ~75 o C dan tetap stabil pada temperatur 95 o C, yaitu temperatur yang dibutuhkan untuk membuka untai ganda DNA. Sejauh ini hasil penelitian dengan berbagai metode baik secara eksperimen, statistik, bioinformatik maupun komputasi, telah menemukan bahwa sifat stabilitas termal tidak terfokus pada satu jenis interaksi intramolekul dalam 1

2 protein. Data-data menunjukkan bahwa sifat stabilitas termal dapat disebabkan oleh adanya perbedaan komposisi asam amino, interaksi elektrostatik, ikatan disulfida, interaksi hidrofobik, interaksi cincin aromatik, ikatan hidrogen dan lainlain (Jaenicke dan Zàvodszky, 1990; Jaenicke dan Böhm, 1998; Kumar dkk., 2000; Daniel dan Cowan, 2000; Das dan Gerstein, 2000; Gianese dkk., 2002). Akibat tidak spesifiknya faktor penentu stabilitas termal, disarankan bahwa faktor ini dapat berbeda dari satu protein ke protein yang lain (Bartolucci dkk., 2003). Oleh karena itu, penelitian untuk mengungkap faktor penentu stabilitas termal dari suatu protein masih terus dilakukan. Pada awalnya, penelitian terhadap faktor penentu stabilitas termal dari suatu protein ditentukan dengan berbagai teknik eksperimen (Fiorentino dkk., 1998; Haney dkk., 1999; Kumar dkk., 2000). Hal ini secara umum dilakukan dengan memberikan stress termal untuk mendestabilisasi struktur protein. Evaluasi terhadap pentingnya faktor penentu stabilitas termal juga dilakukan dengan memutasi protein target terhadap asam amino tertentu dan menganalisis efek mutasi dengan mengukur stabilitas termalnya pada berbagai temperatur. Dengan cara ini mutasi yang memberikan pengaruh signifikan terhadap kestabilan dalam berbagai temperatur pengukuran diyakini sebagai faktor penentu stabilitas termal dari suatu protein. Kesulitan terbesar dari pendekatan eksperimen yang dilakukan dengan memutasi protein target adalah menentukan daerah atau residu yang akan dimutasi. Satu tahap proses eksperimen umumnya berlangsung dalam orde waktu mikro detik hingga menit karenanya perubahan struktur hingga tingkat atom selama proses denaturasi atau destabilisasi protein belum dapat teramati. Karenanya, dalam dua dekade terakhir muncul pendekatan alternatif yaitu melalui analisis komputasi untuk membantu menentukan daerah maupun residu potensial yang dapat meningkatkan termostabilitas protein (Bartolucci dkk., 2003; Liu dan Wang, 2003). Kelebihan utama pendekatan komputasi dibandingkan eksperimen adalah bahwa metode komputasi dapat mengarahkan serta menentukan secara langsung residu-residu yang menjadi target mutasi serta dapat melihat lebih detail sampai 2

3 pada tingkat atom dalam resolusi waktu yang lebih halus (skala femto hingga nano detik) yang belum memungkinkan untuk dilakukan secara eksperimen. Dengan demikian interaksi-interaksi antar atom yang merupakan penentu stabilitas termal dapat lebih mudah diamati. Walaupun terdapat perbedaan orde waktu antara eksperimen dan komputasi, hasil pendekatan komputasi yang telah dipublikasikan (Chong dan Chu, 2002; Fan dan Mark, 2004) menunjukkan pola yang dapat dibandingkan (comparable) dengan hasil eksperimen. Gen DNA Pol I dari bakteri termofilik Geobacillus thermoleovorans galur lokal dari sumber air panas Cimanggu, Jawa Barat telah diklon dan diekspresikan di Escherichia coli. Enzim ini diberi nama DNA Pol I ITB-1 (Akhmaloka dkk., 2000; Akhmaloka dkk., 2002). Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilaporkan (Pramono, 2004) diketahui bahwa enzim DNA Pol I ITB-1 memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan enzim DNA Pol I dari Bacillus caldotenax (99%) dan B.caldolitycus (99,7%). Tingginya tingkat homologi menunjukkan adanya ekivalensi fungsi (Branden dan Tooze, 1999) dengan kedua DNA Pol I tersebut yang ditandai dengan adanya domain polimerase 5 3, eksonuklease 3 5 dan eksonuklease 5 3. Analisis penjajaran urutan asam amino lebih lanjut pada domain eksonuklease 5 3 menunjukkan adanya enam motif lestari yang umum dijumpai pada domain ini. Hasil analisis penjajaran pada domain eksonuklease 3 5 menunjukkan terdapatnya tiga motif namun beberapa residu penting tidak dimiliki DNA Pol I ITB-1 sehingga diduga DNA Pol I ITB-1 tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3 5. Sedangkan hasil analisis penjajaran pada domain polimerase menunjukkan adanya enam motif lestari dan sisi katalitik enzim terdapat pada motif A dan motif C. Peneliti lain (Ambarsari dkk., 2006) telah melaporkan sifat biokimia enzim meliputi ph (7.4) dan temperatur optimum (65 o C) serta parameter kinetika enzim. Selain itu melalui studi mutasi terarah telah dikaji pula peran penting residu karboksilat yang terdapat pada subdomain telapak yaitu Asp-802 dan Glu-831 terhadap sifat biokimia enzim. Hanya saja, pemahaman mengenai sifat stabilitas termal enzim DNA Pol I ITB-1 belum diketahui. 3

4 I.2 Masalah Penelitian Sampai saat ini faktor penentu stabilitas termal dari enzim DNA Pol I ITB-1 belum dielusidasi. Informasi ini dapat digunakan untuk berbagai keperluan, di antaranya dapat dijadikan sebagai acuan untuk merekayasa protein dan dapat digunakan untuk menghindari kesalahan target mutasi. Namun, hal yang lebih penting adalah untuk membuka dan menambah pemahaman tentang mengapa suatu protein dapat bersifat termostabil. Selama ini, pendekatan untuk mempelajari stabilitas termal keluarga DNA Pol I dilakukan dengan membandingkan urutan asam amino maupun struktur dimensi (3D) enzim yang berasal dari mesofil maupun termofil (Villbrandt dkk., 1997; Kiefer dkk., 1997) serta analisis denaturasi termal (Karantzeni dkk., 2003). Pendekatan komputasi dengan simulasi dinamika molekul (SDM) belum pernah dilaporkan sebelumnya. Pendekatan SDM sangat mungkin dilakukan mengingat metode denaturasi termal secara eksperimen dapat dimodelkan. Selain itu proses denaturasi bahkan dapat diamati hingga tingkat atom. Berangkat dari permasalahan di atas, penelitian ini bertujuan untuk mempelajari sifat stabilitas termal DNA Pol I ITB-1 melalui pendekatan SDM. Untuk keperluan tersebut, diperlukan pemahaman akan struktur 3D dari enzim ini. Struktur kristal Fragmen Bacillus (BF, yaitu residu nomor 297 hingga 876) DNA Pol I B.stearotermophillus (Kiefer dkk., 1997) telah dimanfaatkan sebagai cetak biru dengan tingkat homologi struktur 3D mencapai 99%, yang selanjutnya disebut sebagai Klenow-like DNA Pol I ITB-1. Penelitian difokuskan pada kajian sifat stabilitas termal enzim sehingga didapatkan informasi residu-residu yang bertanggung jawab terhadap sifat tersebut. Selain itu, dipelajari pula pergerakan dinamis enzim sebagai fungsi dari temperatur. Sebagai pembanding, dilakukan kajian yang sama terhadap padanan enzim dari keluarga Klenow-like DNA Pol I yaitu Fragmen Klenow (KF) dari E.coli (Beese dkk., 1993) dan Klenow Taq I (Klentaq) dari T.aquaticus (Kim dkk., 1995; Li dkk., 1998). 4

5 I.3 Pendekatan dan Metode Penelitian Yang Digunakan Untuk mencapai tujuan tersebut pada penelitian ini telah dilakukan simulasi dinamika molekul terhadap Klenow-like DNA Pol I ITB-1 pada berbagai temperatur (300, 350, 400 dan 500 K) dengan menggunakan perangkat lunak AMBER modul SANDER dengan sistem solvasi implisit. Hasil simulasi menyarankan adanya daerah labil dan kaku pada enzim sehingga selanjutnya dilakukan mutasi terarah in silico. Kemudian dilakukan perhitungan perubahan energi bebas dengan menggunakan perangkat lunak NAMD berdasarkan metode Alchemical Free Energy Perturbation. Untuk melihat pergerakan dinamis enzim dengan lebih detail dilakukan simulasi pada temperatur 300 dan 350 K menggunakan perangkat lunak AMBER modul SANDER dengan sistem solvasi eksplisit. Sebagai komparasi, dilakukan pula simulasi dinamika molekul pada berbagai temperatur terhadap padanan enzim yaitu KF dan Klentaq. Perangkat lunak yang digunakan adalah AMBER dengan sistem solvasi implisit. I.4 Pelaksanaan Penelitian Simulasi dinamika molekul memerlukan koordinat awal dan parameter untuk menghitung berbagai komponen energi potensial dan kinetik. Karenanya tahap awal penelitian dimulai dengan melakukan konstruksi model struktur 3D Klenowlike DNA Pol I ITB-1 menggunakan program Predict Protein dan SWISS MODEL. Sedangkan penyiapan struktur 3D KF dan Klentaq diperoleh dari Protein Data Bank (PDB) dengan menggunakan perangkat lunak Visual Molecular Dynamics (VMD). Selanjutnya dilakukan parameterisasi dan solvasi terhadap model-model enzim yang digunakan baik secara implisit dan eksplisit. Tahapan simulasi dinamika molekul dibagi menjadi empat tahap utama, yaitu tahap minimisasi, pemanasan, ekuilibrasi dan produksi. Tahap minimisasi energi bertujuan untuk mengendurkan interaksi-interaksi berenergi tinggi, baik interaksi non-ikatan seperti tumpangsuhnya (overlapping) jari-jari van der Waals antar atom, dan interaksi ikatan yang memiliki dimensi panjang, sudut, atau torsi yang menyimpang dari nilai kesetimbangannya. Setelah energi sistem relatif minimum, kemudian sistem dipanaskan hingga temperatur yang diinginkan. Pada tahap 5

6 ketiga seluruh komponen energi kemudian diekuilibrasi pada temperatur akhir pemanasan hingga nilai setiap komponen energi mencapai konvergensi. Selanjutnya dilakukan produksi simulasi denaturasi termal untuk mempelajari sifat stabilitas termal enzim serta mengamati pergerakan dinamis enzim. Selanjutnya dilakukan mutasi terarah secara in silico untuk mengevaluasi hasilhasil yang disarankan dari simulasi dinamika molekul. Terakhir, dilakukan perhitungan perubahan energi bebas antara enzim wild type (WT) dengan mutanmutannya menggunakan perangkat lunak NAMD. I.5 Sistematika Disertasi Disertasi ini dikelompokkan menjadi lima bagian meliputi: pendahuluan, tinjauan pustaka, metode penelitian, hasil dan pembahasan, kesimpulan dan alur baru yang dihasilkan. Pada bab I yaitu pendahuluan, diuraikan tentang latar belakang, masalah yang memuat tujuan penelitian, pendekatan dan metode penelitian yang digunakan, pelaksanaan penelitian secara garis besar serta sistematika penyajian disertasi. Pada Bab II tinjauan pustaka, berisi informasi yang berkaitan dengan topik yang diteliti yaitu stabilitas termal suatu protein, pendekatan yang digunakan yaitu simulasi dinamika molekul serta model protein yang digunakan yaitu DNA Pol I. Bab III, metode penelitian yang berisi penjabaran lengkap atas pendekatan dan metode yang digunakan untuk mendapatkan data yang mendukung penelitian. Bab IV berisi hasil dan pembahasan, yang menyajikan hasil-hasil yang diperoleh dalam penelitian serta pembahasan terkait dengan hasil tersebut. Bab V, kesimpulan dan alur baru yang diperoleh dari hasil penelitian. 6