EFEK ANTIKANKER SERVIKS EKSTRAK KUMBANG TOMCAT (Paederus fuscipes) MELALUI MEKANISME MODULASI SIKLUS SEL DAN KEMATIAN SEL: STUDI IN VITRO SKRIPSI

Transkripsi

1 EFEK ANTIKANKER SERVIKS EKSTRAK KUMBANG TOMCAT (Paederus fuscipes) MELALUI MEKANISME MODULASI SIKLUS SEL DAN KEMATIAN SEL: STUDI IN VITRO SKRIPSI Skripsi diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Diajukan Oleh Wahyu Rhamadhan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto Purwokerto 2016 i

2 ii

3 iii

4 iv

5 MOTTO Janganlah meminta bukti bahwa doamu akan dijawab oleh Allah swt, tapi buktikanlah kesungguhan dari doamu. Ketika perjuanganmu tak dihargai, Allah sedang mengajarimu apa arti ketulusan. Ketika hatimu sedang disakiti seseorang, Allah sedang mengajarimu apa arti memaafkan. Ketika badanmu sungguh letih dan melelahkan, Allah sedang mengajarimu apa arti kesungguhan Bukan kurangnya bakat atau tidak adanya modal yang menghalangi kita dari sukses, melainkan tidak cukupnya keberanian. v

6 PERSEMBAHAN Dengan nama Allah yang Maha Pengasih lagi Maha Penyayang. Skripsi ini akan persembahkan untuk : 1. Bapak dan Ibu tercinta, yang selama ini memberikan kasih sayang yang begitu besar dan senantiasa memberikan usaha berupa dukungan dari segala aspek serta doa yang selalu dipanjatkan untuk mengiringi perjalanan hidup anakanaknya. Tak pernah cukup aku membalas sayang dan cinta kalian Sampai kapanpun. 2. Kelima kakakku tersayang (aang, mba dan aa) terimakasih sudah selalu mendukung dan setia mendengarkan keluh kesah dan selalu menyemangati adikmu ini. 3. Teruntuk semua keponakanku, semoga kelak kalian juga bisa termotivasi untuk terus belajar mencari ilmu setingi-tingginya, untuk keponakan paling besar (hanya berbeda 1 tahun usianya denganku) Cartono terimakasih ya nang sudah banyak membantu dan selalu direpotkan. Semangat terus kuliahnya ya nang, perjuanganmu sebentar lagi selesai. 4. Dosen pembimbingku (Ibu Nunuk dan Ibu Tanti) yang selama ini dengan sabar membimbingku, terima kasih. 5. Sahabat-sahabatku yang selalu setia berada disampingku Radika Afiko Pradesti, Hendri Mulyadi yang selalu direpotkan ketika saya melakukan penelitian di Jogja, Sahabat seperjuangan dalam penelitian Azizah Yudiarti terimakasih sudah saling membantu dan menyemangati. Ratri Rokhani, Muhammad Maadani, Aulya khanifatunnisa Nana, Tia, Hanjar, Sofyan, a rusyanto, a kusnanto yang selalu menghibur dan selalu memberikan dukungan. Farmasi angkatan 2012 terimakasih sudah menemani dan berjuang bersama, khususnya anak-anak kelas farmasi B dan FSOA canda tawa selalu hadir dalam waktu 3 tahun terakhir di Purwokerto. Mba sally, mba kokom, mba meinar, mba elza, pak mamat, mba juju dan mas farid terimakasih telah memberiku arahan dan nasehat. 6. Almamaterku Universitas Muhammadiyah Purwokerto. vi

7 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat, hidayah serta inayahnya, sehingga dapat menyelesaikan penelitian skripsi yang berjudul EFEK ANTIKANKER SERVIKS EKSTRAK KUMBANG TOMCAT (Paederus fuscipes) MELALUI MEKANISME MODULASI SIKLUS SEL DAN KEMATIAN SEL: STUDI IN VITRO. Skripsi ini disusun untuk memenuhi syarat dalam memperoleh gelar S1 Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto. Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari berbagai pihak, penulis tidak dapat menyelesaikan tugas ini dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Drs. H. Syamsuhadi Irsyad, S.H., M.H. Selaku Rektor Universitas Muhammadiyah Purwokerto 2. Dr. Agus Siswanto, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto 3. Dr. Nunuk Aries Nurulita, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing I yang telah memberikan arahan, masukan dan bimbingan dalam penyusunan skripsi. 4. Dwi Hartanti,M.Farm., Apt. selaku dosen pembimbing II yang telah memberikan arahan, masukan dan bimbingan dalam penyusunan skripsi. 5. Seluruh dosen Fakultas Farmasi UMP yang telah memberikan ilmunya sehingga dapat membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan skripsi. 6. Prof. dr. H. Supargiyono, DTMH. S.U., Ph.D., Sp.ParK. yang telah memberikan perkuliahan mengenai kultur sel kepada penulis, sehingga penulis dapat memahami tentang penelitian ini lebih dari sebelumnya. 7. Mba Juanna N (mba juju) dan Mas Farid Abdullah, selaku teknisi Laboratorium parasitologi kedokteran tropis Fakultas Kedokteran UGM yang telah membimbing dan membantu peneliti selama penelitian berlangsung. 8. Kedua orang tua tercinta yang selama ini telah memberikan usaha berupa doa dan dukungan dari segala aspek 9. Kakak-kakak tersayang (aang, mba, aa) yang selalu mendukung dan setia mendengarkan keluh kesah adiknya. vii

8 10. Sahabat-sahabat tersayang yang tak dapat disebutkan satu per satu disini, terima kasih atas bantuan, doa dan dukungan kalian selama ini yang selama ini telah mewarnai perjalanan hidup penulis. 11. Azizah Yudiarti yang telah berjuang bersama, terimakasih atas kerjasama, kesabaran serta suka dukanya selama penelitian berlangsung. 12. Semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat saya sebutkan satupersatu. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, untuk itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi perbaikan penelitian di masa mendatang. Semoga Allah SWT senantiasa membalas amal baik yang telah Bapak/Ibu/Saudara berikan, dan harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis sendiri pada khususnya dan bagi semua pihak yang membutuhkan.. Purwokerto, 24 Februari 2016 Penulis WAHYU RHAMADHAN viii

9 INTISARI WAHYU RHAMADHAN. Efek Antikanker Serviks Ekstrak Kumbang Tomcat (Paederus fuscipes) melalui Mekanisme Modulasi Siklus Sel dan Kematian Sel: Studi In Vitro Di bawah bimbingan Nunuk Aries Nurulita dan Dwi Hartanti. Latar Belakang: Kanker serviks menduduki urutan teratas bagi kanker ginekologi wanita di negara berkembang. Berbagai macam senyawa telah dikembangkan untuk melawan kanker tetapi tidak satupun jenis senyawa ini menimbulkan efek yang memuaskan tanpa efek samping. Kumbang tomcat (Paederus fuscipes) mengandung senyawa toksin disebut pederin. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa pederin pada dosis 1 ng/ml mampu menghambat protein dan sintesis DNA tanpa mempengaruhi sintesis RNA pada sel normal. Tujuan penelitian: Penelitian ini bertujuan untuk menentukan dan mengetahui aktivitas sitotoksik, efek antiproliferasi, mekanisme penyebab kematian sel dan penghambatan dalam fase siklus sel yang diberi perlakuan ekstrak metanol P. fuscipes. Metode Penelitian: Uji sitotoksik dilakukan mengggunakan metode MTT dengan inkubasi 24 jam. Pengamatan apoptosis dilakukan dengan metode annexin V. dan pengamatan penghambatan siklus sel dilakukan dengan metode Flowcytometry. Hasil: Uji sitotoksik menunjukkan bahwa Ekstrak Metanol P. fuscipes (EMPF) memiliki potensi yang baik sebagai agen sitotoksik karena memiliki IC 50 3,058 µg/ml. Nilai IC 50 doxorubicin (kontrol positif) 2,085 µg/ml. Uji apoptosis menggunakan annexin V, EMPF menunjukkan akumlasi sebaran sel tertinggi terjadi di kuadran tiga sebesar 45,18% menandakan terjadi induksi apoptosis. Akumulasi sebaran sel pada perlakuan doxorubicin paling dominan terjadi di kuadran empat yang menandakan sel mengalami nekrosis. Uji siklus sel dilakukan dengan metode flowcytometry yang menunjukkan terjadinya akumulasi pada fase sub G1 yang sejalan dengan penambahan konsentrasi EMPF. Kesimpulan: Nilai IC 50 EMPF sebesar 3,058 µg/ml hampir sebanding dengan doxorubicin dengan mekanisme kematian sel melalui induksi apoptosis dan penghambatan siklus sel pada fase sub G1. Kata kunci: Ekstrak metanol P.fuscipes, Sel HeLa, doxorubicin, nilai IC 50, Apoptosis. ix

10 ABSTRACT WAHYU RHAMADHAN. Cervical Anticancer Effects of Rove Beetle Extract (Paederus fuscipes) through Modulation of Cell Cycle and Death of Cells Mechanism: In Vitro Studies Under the guidance Nunuk Aries Nurulita and Dwi Hartanti. Background: Cervical cancer ranks top for women gynecological cancer in developing countries. A lot of variety of compounds have been developed to fight cancer but none of these types of compounds satisfying effect with no side effects. Rove beetle (Paederus fuscipes) contain compound called pederin toxin. Former studies reported that pederin at level as low as 1 ng/ml a protein was inhibiting protein and DNA synthesis without affecting the synthesis of RNA in normal cell. Objective: This study aimed to determine and recognize the cytotoxic activity, the anti-proliferation effect, cell death mechanism and inhibition of cell cycle phase treated with methanol extracts of P. fuscipes. Methods: Cytotoxic assay was conducted using MTT method with a 24-hour incubation. Observation of apoptosis was conducted using annexin V method. and observations of inhibition of cell cycle was conducted using flowcytometry method. Results: Cytotoxic assay showed that Methanolic Extract P. fuscipes (EMPF) has good potential as a cytotoxic agent for having IC ug / ml. IC 50 value of doxorubicin (positive control) is 2,085 ug / ml. In apoptosis aasay using annexin V, EMPF showed the highest accumulation of cell distribution in quadrants 3 of 45.18% that indicates induction of apoptosis occurs. The accumulation of cell distribution in doxorubicine treatment dominantly occurs in quadrants 4 that indicates necrosis. of cell. Cell cycle aasay was conducted using flowcytometry that showed accumulation in sub G1 phase is comparable with increasing of EPMF concentration Conclusion: The IC 50 value of EPMF is ug / ml are almost comparable to doxorubicin with cell death mechanism through the induction of apoptosis and inhibition of cell cycle at sub-g1 phase. Keywords: Methanolic extract of P.fuscipes, HeLa cells, Doxorubicin, IC50, Apoptosis. x

11 RIWAYAT HIDUP Nama : Wahyu Rhamadhan Tempat, Tanggal Lahir : Indramayu, 05 Maret 1993 Nama Orang Tua : H. Nurita (Ayah), Hj. Warniah (Ibu) Riwayat Pendidikan : a. Sekolah Dasar : SDN Paoman 9 b. Sekolah Menengah Pertama : SMP Negeri 2 Sindang c. Sekolah Menengah Atas : SMA Negeri 1 Indramayu d. Perguruan Tinggi : Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto Kegiatan Ilmiah Mahasiswa PKM-K (Program Kreativitas Mahasiswa - Kewirausahaan) = Yoghurt Leri : Minuman Prebiotik dari Fermentasi Air Cucian Beras. Tahun 2013 (Anggota) PKM-P (Program Kreativitas Mahasiswa - Penelitian) Pemanfaatan Paederin Racun Kumbang Tomcat (Paederus fuscipes Curti ) Sebagai Anti Kanker Payudara : Studi In Vitro. Tahun 2014 (Ketua) Keanggotaan Organisasi Anggota PIK-MA Youth Center Universitas Muhammadiyah Purwokerto tahun Ketua bidang Divisi I Penalaran aspirasi Mahasiswa Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi periode Ketua Pelaksana UP-Grading Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto periode xi

12 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... xiv DAFTAR GAMBAR... xv DAFTAR LAMPIRAN... xvi DAFTAR SINGKATAN... xvii BAB I PENDAHULUAN... 1 A. Latar Belakang... 1 B. Perumusan Masalah... 2 C. Tujuan... 2 D. Manfaat Program... 3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 4 A. Kanker Servik (Leher Rahim)... 4 B. Kumbang Tomcat BAB III METODE PENELITIAN... 9 A. Jenis dan Rancangan Penelitian... 9 B. Variabel Penelitian... 9 C. Waktu dan Tempat Penelitian... 9 D. Bahan dan Alat E. Prosedur Penelitian F. Analisis Hasil BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Identifikasi Serangga B. Ekstraksi Kumbang Tomcat C. Uji sitotoksik ekstrak P. fuscipes terhadap sel HeLa menggunakan Metode MTT D. Uji Apoptosis dengan annexin V E. Uji Siklus Sel Metode Flowcytometry xii

13 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan B. Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xiii

14 DAFTAR TABEL Tabel Halaman Tabel 1. Persen Viabilitas Sel Dari Perlakuan Ekstrak Metanol P. fuscipes Tabel 2. Persen Viabilitas Sel Dari Perlakuan Doxorubicin Tabel 3. Hasil Persentase Induksi Apoptosis pada Sel HeLa Tabel 4. Hasil analisis siklus sel menggunkan program cell quest yang dengan atau tanpa diberi perlakuan xiv

15 DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman Gambar 1. Gambar 1. Paederus fuscipes (Sumber Ekstrak). Morfologi kumbang tomcat dari atas (a), dari bawah (b) (U.S. Army Public Health Comand, 2010) dan pengumpulan kumbang tomcat (c) (Foto pengumpulan kumbang tomcat, 2015)... 7 Gambar 2. Struktur kimia pederin (Aplikasi Chemdraw., 2014)... 8 Gambar 3. Gambar 3. Morfologi sel HeLa (A) kontrol sel; (B) EMPF 20 µg/ml ; (C) EMPF 0,25 µg/ml; (D) doxorubicin 2,5 µg/ml sel hidup: ;sel mati: ) Gambar 4. Reduksi MTT di dalam sel hidup oleh enzim reduktase di dalam mitokondria menghasilkan kristal formazan (Ebada et al, 2008).. 19 Gambar 5. Kristal formazan yang terbentuk setelah pemberian MTT yang sebelumnya sudah diberi perlakuan (A) kontrol sel; (B) EMPF 0,25µg/ml Gambar 6. Hasil analisis dengan cell quest pada konsentrasi EMPF= (A)5μg/ml; (B)2,55μg/ml; (C)1μg/ml; doxorubicin=(d)5μg/ml; (E)2,5μg/ml dan (F)kontrol sel. (keterangan: R1=sel hidup; R2=apoptosis awal; R3=apoptosis akhir; R4=nekrosis) Gambar 7 Hasil deteksi distribusi sel menggunakan flow cytometry 5x10 4 sel HeLa ditanam dalam 6-well plate dan diinkubasi dalam media RPMI tanpa ataudengan perlakuan. Deteksi flow cytometry menggunakan reagen PI terhadapsel HeLa setelah perlakuan EMPF= (A)5μg/ml; (B)2,55μg/ml; (C)1μg/ml; doxorubicin=(d)5μg/ml; (E)2,5μg/ml dan (F)Kontrol sel. analisis hasil dilakukan dengan program cell quest xv

16 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Halaman Lampiran 1. Cara kerja sistematis Lampiran 2. Tahapan Pembuatan Ekstrak metanol P. fuscipes dan Perhitungan Rendemen Ekstrak Metanol P. fuscipes Lampiran 3. Hasil identifikasi kumbang tomcat Paederus fuscipes Lampiran 4. Pemetaan (maping) Uji Sitotoksik, Apoptosis dan Siklus Sel ekstrak metanol P. fuscipes Lampiran 5. Perhitungan Seri Konsentrasi Sampel ekstrak metanol P.fuscipes untuk Uji Sitotoksik Sel Kanker Serviks HeLa Lampiran 6. Perhitungan Seri Konsentrasi Doxorubicin untuk Uji Sitotoksik Sel Kanker Serviks HeLa Lampiran 7. Persentase Viabilitas Sel pada Uji Sitotoksik Metode MTT Lampiran 8. Perhitungan IC50 ekstrak metanol P.fuscipes dan Doxorubicin (waktu inkubasi 24 jam) dengan Menggunakan Program GraphPad Prism Lampiran 9. Perhitungan konsentrasi perlakuan Uji apoptosis dan siklus Sel menggunakan 6-well plate Lampiran 10. Hasil Uji apoptosis dengan annexin V menggunakan program cell quest Lampiran 11. Hasil Uji siklus sel dengan metode flow cytometry menggunakan program cell quest xvi

17 DAFTAR SINGKATAN EMPF (Ekstrak Metanol P. fuscipes) DMSO (Dimetil Sulfoksida) ELISA (Enzym-linked Immunosorbent Assay) FBS (Fetal Bovine Serum) PI (Propidium iodide) IC 50 (Inhibition concentration 50) MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) PBS (Phosphate Buffer Saline) RPMI (Roswell Park Memorial Institute) SDS (Sodium Dudecyl Sulphate) MK (Media Kultur) xvii