Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut Aaptos suberitoides Terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) Secara In Vitro

Transkripsi

1 SIDANG TUGAS AKHIR Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut Aaptos suberitoides Terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) Secara In Vitro Hani Tenia Fadjri DOSEN PEMBIMBING: Awik Puji Dyah Nurhayati, S.si, M.Si Prof. Dr. Drs. Sukardiman. Apt. M.Sc.

2 Latar Belakang Tiga besar kanker yang melanda wanita Indonesia: Kanker serviks, Kanker payudara, Kanker colon (Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002 dalam Heti, 2008) Existing condition of antineoplastik: Kemoterapi: menimbulkan efek samping Pembedahan : tidak dapat dilakukan jika telah metastesis Alternatif: Herbal Spons Menghasilkan Metabolit Sekunder Aaptos suberitoides berpotensi sebagai obat antikanker aaptamin Coutinho, 2002; Tsukamoto, 2010 (Nurhayati et al, 2008). Aaptamin (alkaloid) berpotensi sebagai obat anti kanker Uji in vivo Brine Shrimp Lethality Test (BST) LC50 sebesar 134 ± 36.6 ppm (Nurhayati et al., 2008). Uji Sitotoksisitas Potensi Sitotoksik ekstrak spons laut A. suberitoides.

3 Permasalahan Sitotoksi sitas in vivo Sitotoksi sitas in vitro?? BST (Studi pendahuluan) Aaptos suberitoides memiliki senyawa bioaktif paling potensial untuk antikanker dengan nilai LC ± ppm Mengetahui aktivitas Aaptos suberitoides dalam menghambat pertumbuhan sel-sel kanker Bagaimana mengukur kemampuan ekstrak spons Aaptos suberitoides dalam menghambat pertumbuhan sel kanker HeLa

4 Uji apoptosis sel jumlah sel hidup dan sel yang mengalami apoptosis dimana sel hidup tampak berwarna hijau sedangkan sel yang mengalami apoptosis berwarna orange

5 untuk melakukan evaluasi in vitro toksisitas ekstrak spons laut Aaptosis suberitoides terhadap pertumbuhan sel kanker serviks (HeLa) Sebagai produk farmasi untuk dasar pengembangan obat antikanker baru Manfaat Sebagai dasar pengembangan dalam upaya pemanfaatan sumber daya hayati laut di Jawa Timur

6 Skema Kerja Penentuan Konsentrasi Eksrtrak spons dan cisplatin Pembuatan Medium Kultur (Penumbuh) RPMI Pemanenan Sel Kanker 3 4 Propagasi Sel HeLa Uji Sitotoksisitas MTT Doubling Time

7 Tabel Hasil uji sitotoksisitas ekstrak terhadap sel Konsentrasi sampel (µg/ml) kanker menggunakan metode MTT ABSORBANSI TOTAL RERATA (C ) A-B C-B % mati K.SEL (A) K.MEDIA (B)

8 Tabel Hasil uji sitotoksisitas Cisplatin terhadap Konsentrasi Cisplatin (µg/ml) sel kanker menggunakan metode MTT Absorbansi Total Rerata (C ) A-B C-B % Mati K.SEL (A) K.MEDIA (B)

9 Hasil uji doubling time dengan perlakuan ekstrak spons A. suberitoides terhadap sel kanker pada berbagai waktu inkubasi Waktu Inkubasi (Jam) Konsentrasi sampel (µg/ml) Absorbansi Total Rerata (C ) A-B C-B % Hidup K.SEL (A) K.MEDIA (B) K.SEL (A) K.MEDIA (B) K.SEL (A) K.MEDIA (B)

10 Hasil uji doubling time dengan perlakuan cisplatin terhadap sel kanker pada berbagai waktu inkubasi Waktu Inkubasi (jam) Konsentrasi sampel (µg/ml) ABSORBANSI TOTAL RERATA (C ) A-B C-B % hidup K.SEL (A) K.MEDIA (B) K.SEL (A) K.MEDIA (B) K.SEL (A) K.MEDIA (B)

11 Hasil uji doubling time dengan perlakuan DMSO terhadap sel kanker pada berbagai waktu inkubasi Waktu Inkubasi (jam) Persentase DMSO (%) Absorbansi TOTAL RERATA (C ) A-B C-B % hidup K.SEL (A) K.MEDIA (B) K.SEL (A) K.MEDIA (B) K.SEL (A) K.MEDIA (B)

12 HASIL PENELITIAN Persentase kematian sel HeLa kemudian dikonversikan ke dalam table probit dibuat grafik regresi linier antara log konsentrasi sampel uji dengan persen kematian sel, sehingga dapat dihitung LC50 Nilai LC50 pada uji sitotoksisitas dengan metode MTT adalah µg/ml. sesuai dengan pendapat Meyer et al., 1982 yang menyatakan bahwa suatu senyawa bersifat sitotoksik jika mempunyai LC50 lebih kecil dari 1000 µg/ml kadar DMSO tidak akan berpengaruh terhadap persen kematian sel pada seri kadar yang lain di bawah ekstrak seri ke-8 yaitu dibawah kadar DMSO 0,475 %. Sebagai kontrol positif digunakan Cisplatin. Cisplatin atau Cisplatinum atau cis diamminedichloroplatinum (II) adalah obat kemoterapi kanker yang berbasis logam platinum. Cisplatin merupakan pilihan pertama obat yang digunakan dalam terapi karsinome serviks (Rose, 2006).

13 Grafik Regresi Linier Nilai Probit Ekstrak dan Cisplatin HeLa Sitotoksisitas Cisplatin terhadap Sel Hela probit y = x log konsentrasi R 2 = Ekstrak Spons A. suberitoides Perhitungan LC 50 Y = 1,228x + 2,387 5 = 1,228x + 2, x = 2,613 X = 2,12785 Antilog 2,12785 = 133,967 LC 50 = 133,967 µg/ml probit y = 1.734x R 2 = log konsentrasi cisplatin Perhitungan LC 50 Y = 1,734x + 3,065 antilog 1, = 5 = 1,734x + 3,065 LC 50 = 13,062 µg/ml 1,734x = 1,935 x = 1,115917

14 Proses Pewarnaan Apoptosis Interaksi sel dengan ekstrak atau cisplatin selama inkubasi Sel hidup Sel mati Integritas membran sel tetap utuh Terjadi penurunan integritas membran Permeabilitas tetap utuh Membran sel tidak mampu ditembus oleh ethidium bromide acridine orange dengan gugus kationnya Mampu berinteraksi dengan DNA yang bersifat anionik Permeabilitas menurun Membran sel mampu ditembus oleh ethidium bromide Inti sel terwarnai Membentuk garam terdisosiasi Terwarnai oleh acridine orange (hijau) Hijau Sel apoptosis Inti sel Berwarna orange Terfragmentasi dan terkondensasi Sel nekrosis Berwarna orange dan bentuk inti sel normal

15 Mekanisme Kerja Ekstrak Terhadap Sel Kanker Pada kanker serviks (sel HeLa) mengeekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7. E6 akan berikatan dengan p53 untuk mendegradasi p53 sehingga sel tidak mengalami apoptosis E7 berikatan dengan prb yang menyebabkan sel berproliferasi terus-menerus Dengan Pemberian Ekstrak senyawa aaptamin yang terkandung dalam ekstrak di lingkungan sel menginduksi ekspresi dari protein p21 induksi ekspresi protein p21 menahan siklus sel fase G2/M berperan seperti cyclin/ cdk inhibitor di bawah control gen p53 kerusakan DNA Protein 21 tidak mengaktifasi kompleks cyclin D/cdk 4,6 sehingga mencegah fosforilasi protein Rb restriction point pada fase G1 Perbaikan DNA gen p53 memicu terjadinya apoptosis

16 Kesimpulan Nilai IC 50 ekstrak spons A. suberitoides sebesar 153,006 µg/ml menunjukkan bahwa senyawa sebagai ini bersifat kurang toksik terhadap sel kanker HeLa Pada uji apoptosis diketahui bahwa ekstrak spons A.suberitoides dapat memacu apoptosis pada sel kanker HeLa