BAB VI PEMBAHASAN. Rimpang temu putih yang sudah dipotong kecil-kecil didestilasi dengan

Transkripsi

1 40 BAB VI PEMBAASAN 6.1 Isolasi Minyak Atsiri dengan Destilasi Uap Rimpang temu putih yang sudah dipotong kecil-kecil didestilasi dengan menggunakan destilasi uap. Pemotongan sampel dengan ukuran kecil bertujuan untuk memperluas permukaan sampel sehingga memudahkan untuk memperoleh minyak atsiri. Sampel yang sudah dipotong ini selanjutnya dimasukkan ke dalam dandang yang telah berisi air, dimana dandang yang digunakan untuk destilasi ini sudah dilengkapi dengan kondensor. Destilat yang diperoleh selanjutnya ditambahkan dengan al 2 anhidrat. Penambahan al 2 anhidrat berfungsi untuk membebaskan sisa-sisa air yang masih tercampur dengan minyak. Setelah diperoleh minyak atsiri murni (tidak bercampur lagi dengan air) selanjutnya dilakukan uji toksisitas terhadap larva Artemia salina L. 6.2 Uji Toksisitas Minyak Atsiri terhadap Larva Artemia salina L Uji toksisitas minyak atsiri terhadap larva Artemia salina L. dilakukan dengan cara pemberian minyak atsiri dengan berbagai konsentrasi terhadap larva Artemia salina L., kemudian dihitung jumlah larva Artemia salina L yang hidup dan yang mati, selanjutnya dilakukan perhitungan untuk mengetahui nilai L 50. L 50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% larva. Dari hasil perhitungan L 50 (lampiran 5) diperoleh nilai L 50 sebesar 19,96 ppm, sehingga dapat dikatakan minyak atsiri rimpang temu putih bersifat toksik terhadap larva Artemia salina L. Jika suatu sampel mempunyai nilai L 50 di bawah 1000 ppm 40

2 41 maka sampel tersebut dikatakan bersifat sitotoksik (toksik terhadap sel) (Meyer, 1982). asil penelitian yang dilakukan oleh Anisa, 2010 diperoleh nilai L 50 dari ekstrak kloroform rimpang temu putih sebesar 29,51 ppm. Jika dibandingkan dengan minyak atsiri, minyak atsiri rimpang temu putih memberikan efek toksik yang lebih baik dari pada ekstrak kloroform rimpang temu putih. 6.3 Uji Antikanker Secara In Vitro terhadap Sel Mieloma Mencit Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan diperoleh jumlah sel sebanyak sel/ml. Jumlah sel ini dianggap telah mencukupi untuk uji sel mieloma menggunakan larutan uji. Setiap perlakuan dimasukkan ke dalam vial kemudian diambil 1mL, ditambahkan dengan pewarna tripan blue 0,4% sebanyak 1 ml. Dengan menggunakan teknik penghitungan cara Thoma di bawah mikroskop dihitung persentase viabilitas selnya yaitu jumlah sel yang hidup dibagi dengan jumlah sel keseluruhan (sel hidup dan sel mati) dikalikan 100% (Meyer and arvey, 2003). Jarak antara pewarnaan dengan penghitungan sel dilakukan tidak kurang dari 3 menit dan maksimum selama 10 menit hal ini untuk menghindari hasil positif palsu (Freshney, 1987). Pewarnaan sel dengan menggunakan larutan trypan blue bertujuan untuk membedakan sel yang hidup dan yang mati. Sel yang mati akan terlihat berwarna biru, karena mengalami lisis sehingga protein dalam plasmanya akan berikatan dengan trypan blue sehingga sel menjadi berwarna biru. Selain itu, sel yang mati akan terlihat berwarna lebih gelap dan bentuknya tidak bulat lagi atau menyusut karena isi sel (sitoplasmanya) keluar. al ini tidak terjadi pada sel yang hidup

3 42 karena tidak mengalami kerusakan pada membran selnya, sehingga sel yang hidup masih terlihat berbentuk bulat, lebih terang dan jernih (Djajanegara, 2009). Adapun grafik yang menggambar perbandingan antara persen viabilitas dengan konsentrasi dapat dilihat pada Gambar 6.1 % Perbandingan persen kematian dengan konsentrasi K e m a t i a n Konsentrasi 10(ppm) Perbandingan % viabilitas dengan konsentrasi Gambar 6.1 Grafik perbandingan persen kematian dengan konsentrasi Berdasarkan grafik di atas dan Tabel 5.2 diketahui dengan meningkatnya konsentrasi larutan uji akan diikuti dengan kenaikan persen kematian sel mieloma. Perbedaan efek antar kelompok larutan uji dianggap sebagai perbedaan perlakuan yang diberikan, dimana perbedaan konsentrasi larutan uji secara bertingkat menyebabkan perbedaan persen viabilitas sel mieloma. Semakin besar konsentrasi larutan uji semakin kecil persen viabilitas sel yang hidup, begitupun sebaliknya semakin kecil konsentrasi larutan uji, semakin besar persen viabilitas sel yang hidup. al ini diperkuat oleh penelitian yang dilakukan oleh Verlianara, 2002 yang menyatakan bahwa meningkatnya konsentrasi minyak atsiri temu mangga dapat menyebabkan meningkatnya persen kematian atau menurunnya persen viabilitas sel mieloma yang hidup.leh karena itu, dapat dikatakan bahwa

4 43 kelompok larutan uji memiliki aktivitas hambatan pertumbuhan terhadap kultur sel mieloma mencit, namun belum dapat diikatakan bersifat antikanker karena nilai L 50 nya yang terlalu tinggi. 6.4 Uji Antikanker secara Invitro terhadap Sel ela Aktivitas antikanker terhadap sel ela ditentukan dengan menggunakan MTT ((3,[4,5-dimetilthiazol-2yl]-2,5-difenil tetrazolium bromida)). Pengujian dengan menggunakan MTT didasarkan pada pemecahan garam tetrazolium yang berwarna kuning dan larut dalam air menjadi kristal biru keunguan formazan yang tidak larut dalam air. Pemecahan MTT terjadi pada mitokondria sel yang hidup oleh enzim suksinat hidrogenasereaksi menggunakan MTT ini melibatkan piridin nukleotida kofaktor NAD dan NADP yang hanya dikatalisis oleh sel hidup, sehingga jumlah formazan yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel yang hidup. Semakin banyak sel yang hidup, semakin banyak kristal formazan yang terbentuk. Selanjutnya diukur absorbansinya dengan menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 550 nm. Semakin tinggi nilai absorbansi yang diperoleh mengindikasikan mortalitas (kematian) yang rendah (Fajarningsih, 2006). Absorbansi tersebut menggambarkan jumlah sel hidup. Semakin kuat intensitas warna ungu yang terbentuk, absorbansi akan semakin tinggi. al ini menunjukkan bahwa semakin banyak MTT yang diabsorbsi ke dalam sel hidup dan dipecah melalui reaksi reduksi oleh enzim reduktase dalam rantai respirasi mitokondria, sehingga formazan yang terbentuk juga semakin banyak. Absorbansi ini yang akan digunakan untuk menghitung persentase sel hidup sebagai respon. Intensitas

5 44 warna ungu yang terbentuk berbanding langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme (Anggrianti, 2008). Berdasarkan absorbansi yang diperoleh, maka dapat dihitung persen kematian sel ela (Tabel 5.6). Untuk mengetahui nilai L 50 nya maka dibuat grafik persen mortalitas Vs log konsentrasi. Adapun grafik penentuan nilai L 50 digambarkan pada Gambar 6.2. Gambar 6.2 Grafik penentuan nilai L 50 minyak atsiri temu putih terhadap sel ela Berdasarkan grafik di atas dengan meningkatnya konsentrasi menyebabkan peningkatan kematian sel. Kematian sel tertinggi yaitu pada konsentrasi 1000 ppm dengan persen kematian sebesar 94,51% sedangkan kematian terendah pada konsentrasi 0,06 ppm dengan persen kematian sebesar 16,50%. Dari grafik tersebut diperoleh nilai L 50 sebesar 13,80 ppm. al ini berarti bahwa dengan pemberian minyak atsiri dengan konsentrasi sebesar 13,80 ppm, dapat membunuh sel ela sebanyak 50%. Sehingga dapat dikatakan minyak atsiri rimpang temu putih bersifat sebagai antikanker karena nilai L 50 nya < 20 µg/ml (idayat, 2002). Perbedaan persentase kematian setiap kelompok larutan uji dianggap sebagai perbedaan perlakuan terhadap efek, dimana

6 45 perbedaan konsentrasi larutan uji secara bertingkat menyebabkan perbedaan persen mortalitas pada sel ela atau meningkatnya persen kemataian sel ela. Penelitian ini juga didukung oleh penelitian yang dilakukan oleh Verlianara, 2002 yang menyatakan bahwa meningkatnya konsentrasi minyak atsiri temu mangga maka % kematian sel ela akan meningkat pula. 6.5 Identifikasi Senyawa Antikanker pada Minyak Atsiri Rimpang temu Putih dengan Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa (G-MS). Identifikasi minyak atsiri rimpang temu putih yang aktif antikanker dengan menggunakan Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa (KG-SM) diperoleh 16 puncak, namun hanya 8 puncak (puncak 1, 2, 3, 5, 8, 10, 14, dan 16) yang diidentifikasi berdasarkan fragmentasinya yang dibandingkan dengan fragmentasi senyawa pada database. Sedangkan puncak yang lainnya (puncak 4,6, 7, 9, 11, 12, 13 dan 15) belum dapat diidentifikasi karena masih memerlukan data pendukung dari spektrometer yang lain sehingga dapat diidentifikasi. A. Identifikasi senyawa pada puncak 1 t R 6,442 menit (4,77%) Spektrum massa senyawa pada puncak 1 identik dengan spektrum massa senyawa alpha pinen yang ditampilkan pada Gambar 6.3. A B

7 46 Gambar 6.3 (A). Spektrum massa senyawa puncak 1 (B). Spektrum massa senyawa alpha pinen Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB alpha pinen mempunyai rumus molekul dan berat molekul senyawa alpha pinen adalah 136. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 1 adalah m/z 136 dengan puncak dasar pada m/z 93. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 1 seperti terlihat pada Tabel 6.1 Tabel 6.1 Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa alpha pinen. No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang Penggalan M M (M - 15) [(M - 15)-28] Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan WILEY229.LIB, maka diduga senyawa puncak 1 identik dengan senyawa alpha pinen yang strukturnya terlihat pada Gambar 6.4. Gambar 6.4 Struktur senyawa alpha pinen Fragmentasi yang terjadi pada senyawa alpha pinen sesuai dengan spektrum massa di atas dapat diperkirakan sebagai berikut:

8 47 Fragmentasi e m/z 136 m/z 121 r m/z m/z 77 m/z 77 B. Identifikasi senyawa pada puncak 2 t R 6,884 menit (4,16%) Spektrum massa senyawa pada puncak 2 identik dengan spektrum massa senyawa kamfen yang ditampilkan pada Gambar 6.5.

9 48 A B Gambar 6.5 (A). Spektrum massa senyawa puncak 2 (B). Spektrum massa senyawa kamfen Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB kamfen mempunyai rumus molekul dan berat molekul sebesar 136. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 2 adalah m/z 136 dengan puncak dasar pada m/z 93. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 2 seperti terlihat pada Tabel 6.2. Tabel 6.2 Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa kamfen No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang Penggalan M M M M Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan WILEY 7, maka diduga senyawa puncak 2 identik dengan senyawa kamfen (2,2-dimetil-3- metilenbicyclo-heptana) yang strukturnya terlihat seperti pada Gambar 6.6.

10 Gambar 6.6 Struktur senyawa kamfen Fragmentasi yang terjadi pada senyawa kamfen sesuai dengan spektrum massa di atas dapat diperkirakan sebagai berikut: Fragmentasi e m/z m/z m/z m/z 93

11 50. Identifikasi senyawa pada puncak 3 t R 8,906 menit (4,82%) Spektrum massa senyawa pada puncak 3 identik dengan spektrum massa senyawa kamfen yang ditampilkan pada Gambar 6.7. A B Gambar 6.7 (A). Spektrum massa senyawa puncak 3 (B). Spektrum massa senyawa 1,8 sineol Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB senyawa 1,8 sineol mempunyai rumus molekul dan mempunyai berat molekul sebesar 154. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 3 adalah m/z 154 dengan puncak dasar pada m/z 43. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 3 seperti terlihat pada Tabel 6.3. Tabel 6.3 Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa 1,8 sineol. No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang Penggalan M M (M -15) (M -15)

12 51 Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan WILEY229.LIB, maka diduga senyawa puncak 3 identik dengan 1,8 sineol yang struktur senyawanya terlihat pada Gambar Gambar 6.8 Struktur senyawa 1,8 sineol Fragmentasi yang terjadi pada senyawa beta pinen sesuai dengan spektrum massa di atas dapat diperkirakan sebagai berikut: e m/z 154 m/z =( 3 ) 2 m/z m/z 43

13 52 D. Identifikasi senyawa pada puncak 4 t R 10, 46 menit (2,03%) Spektrum massa senyawa pada puncak 4 tidak identik dengan spektrum massa senyawa yang terdapat pada database. Adapun gambar spektrum massanya ditampilkan pada Gambar 6.9. A B Gambar 6.9 (A). Spektrum massa senyawa puncak 4 (B). Spektrum massa senyawa pada database Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB senyawa pada puncak 4 mempunyai berat molekul sebesar 152. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 4 adalah m/z 152 dengan puncak dasar pada m/z 67. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 4 seperti terlihat pada Tabel 6.4. Tabel 6.4 Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa puncak 4 No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang M M M M

14 53 E. Identifikasi senyawa pada puncak 5 t R 11,403 menit (8,27%) Spektrum massa senyawa pada puncak 5 identik dengan spektrum massa senyawa kamfor yang ditampilkan pada Gambar A B Gambar 6.10 (A). Spektrum massa senyawa puncak 5 (B). Spektrum massa senyawa kamfor Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB senyawa kamfor mempunyai rumus molekul dan berat molekul sebesar 152. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 5 adalah m/z 152 dengan puncak dasar pada m/z 95. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 5 seperti terlihat pada Tabel 6.5. Tabel 6.5 Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa kamfor. No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang Penggalan M M ( 3 ) M

15 54 Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan WILEY229.LIB, maka diduga senyawa puncak 5 identik dengan kamfor yang strukturnya terlihat pada Gambar Gambar 6.11 Struktur senyawa kamfor Fragmentasi yang terjadi pada senyawa kamfor sesuai dengan spektrum massa di atas dapat diperkirakan sebagai berikut : Fragmentasi e - ( 3 ) m/z 152 ( 3 ) 2 m/z m/z 95

16 55 F. Identifikasi senyawa pada puncak 8 t R 15,460 menit (4,35%) Spektrum massa senyawa pada puncak 8 identik dengan spektrum massa senyawa kamfor yang ditampilkan pada Gambar A B Gambar 6.12 (A). Gambar spektrum massa senyawa puncak 8 (B). Gambar spektrum massa senyawa 1-etenil-1-metil 2,4bis(1-metiletenil) sikloheksana Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB senyawa 1-etenil-1-metil 2,4bis(1-metiletenil) sikloheksana mempunyai rumus molekul dan berat molekul sebesar 189. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 8 adalah m/z 189 dengan puncak dasar pada m/z 81. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 8 seperti terlihat pada Tabel 6.6.

17 56 Tabel 6.6 Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa 1-etenil-1-metil-2,4- bis(1-metiletenil) sikloheksana. No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang Penggalan M M M M M M M Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan WILEY 7, maka diduga senyawa puncak 8 identik denngan 1-etenil-1-metil-2,4-bis(1- metiletenil) sikloheksana yang strukturnya terllihat pada Gambar Gambar 6.13 Struktur senyawa 1-etenil-1-metil-2,4-bis(1-metiletenil) sikloheksana Fragmentasi yang terjadi pada senyawa 1-etenil-1-metil-2,4-bis(1- metiletenil) sikloheksana sesuai dengan spektrum massa di atas dapat diperkirakan sebagai berikut :

18 57 Fragmentasi -e -14 m/z m/z m/z 147 m/z m/z m/z m/z 81 G. Identifikasi senyawa pada puncak 9 tr 16, 210 menit (2,34%) Spektrum massa senyawa pada puncak 9 tidak identik dengan spektrum massa senyawa yang terdapat pada database. Adapun gambar spektrum massanya ditampilkan pada Gambar 6.14.

19 58 A B Gambar 6.14 (A). Spektrum massa senyawa puncak 9 (B). Spektrum massa senyawa pada database Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB senyawa pada puncak 9 mempunyai berat molekul sebesar 204. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 9 adalah m/z 204 dengan puncak dasar pada m/z 107. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 9 seperti terlihat pada Tabel 6.7. Tabel 6.7 Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa puncak 9 No m/z Kemunngkinan fragmen yanng hilang M M M M M

20 59. Identifikasi senyawa pada puncak 10 t R 16,988 menit (91,85%) Spektrum massa senyawa pada puncak 10 identik dengan spektrum massa senyawa furanodiena yang ditampilkan pada Gambar A B Gambar 6.15 (A). Spektrum massa senyawa puncak 10 (B). Spektrum massa senyawa furanodiena Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB senyawa furanodiena mempunyai rumus molekul dan berat molekul sebesar 216. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 10 adalah m/z 216 dengan puncak dasar pada m/z 108. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 8 seperti terlihat pada Tabel 6.8. Tabel 6.8 Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa furanodiena. No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang Penggalan M M (M - 15) (M - 15) (M - 15) (M - 15)

21 60 Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan WILEY229.LIB, maka diduga senyawa puncak 10 identik dengan furanodiena yang strukturnya dapat dilihat pada Gambar Gambar Struktur senyawa furanodiena Fragmentasi yang terjadi pada senyawa furanodiena sesuai dengan spektrum massa di atas dapat diperkirakan sebagai berikut m/z 216 m/z m/z 159 m/z 173 m/z m/z 133

22 61 I. Identifikasi senyawa pada puncak 14 t R 19,624menit (89,37%) Spektrum massa senyawa pada puncak 14 identik dengan spektrum massa senyawa germakron yang ditampilkan pada Gambar A B Gambar 6.17 (A). Spektrum massa senyawa puncak 14 (B). Spektrum massa senyawa germakron Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB senyawa germakron mempunyai rumus molekul dan berat molekul sebesar 218. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 14 adalah m/z 218 dengan puncak dasar pada m/z 107. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 14 seperti terlihat pada Tabel 6.9. Tabel 6.9.Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa germakron. No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang Penggalan M M (M - 15) (M - 15)-28] (M - 15)-28]-14] (M - 15)-28]-14]-26] (M - 15)-28]-14]-26]-28]

23 62 Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan WILEY229.LIB, maka diduga senyawa puncak 14 identik dengan germakron yang strukturnya dapat dilihat pada Gambar Me Me Me Gambar 6.18 Struktur senyawa germakron Fragmentasi yang terjadi pada senyawa germakron sesuai dengan spektrum massa di atas dapat diperkirakan sebagai berikut : Fragmentasi e m/z 218 m/z m/z m/z m/z m/z m/z m/z 67

24 63. Identifikasi senyawa pada puncak 16 t R 20,776menit (8,19%) Spektrum massa senyawa pada puncak 16 identik dengan spektrum massa senyawa velleral yang ditampilkan pada Gambar A B Gambar 6.19 (A). Spektrum massa senyawa puncak 16 (B). Spektrum massa senyawa velleral Berdasarkan data dari library WILEY229.LIB senyawa velleral mempunyai berat molekul sebesar 232. leh karena itu ion molekul (M ) senyawa pada puncak 16 adalah m/z 232 dengan puncak dasar pada m/z 135. Pola pemenggalan spektrum massa senyawa puncak 16 seperti terlihat pada Tabel Tabel 6.10 Kemungkinan fragmen yang hilang dari senyawa velleral. No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang M M M M

25 64 Berdasarkan berat molekul dan pola fragmentasi dari pendekatan WILEY229.LIB maka diduga senyawa puncak 16 identik denngan senyawa velleral yang strukturnya dapat dilihat pada Gambar Gambar Struktur senyawa velleral Fragmentasi yang terjadi pada senyawa velleral sesuai dengan spektrum massa di atas dapat diperkirakan sebagai berikut = 3 = 3 = = 3 = = m /z 23 2 m /z = = 3 m /z = = 3 2 = = 2 3 = = = = = = m /z 147