KONSTRUKSI DAN EKSPRESI GEN PENYANDI ENZIM L-ARABINOSA ISOMERASE PADA PERMUKAAN SEL KHAMIR Pichia pastoris AGNES YULIANA

Transkripsi

1 KONSTRUKSI DAN EKSPRESI GEN PENYANDI ENZIM L-ARABINOSA ISOMERASE PADA PERMUKAAN SEL KHAMIR Pichia pastoris AGNES YULIANA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

2

3 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa Tesis yang berjudul Konstruksi dan Ekspresi Gen Penyandi Enzim L-Arabinosa Isomerase pada Permukaan Sel Khamir Pichia pastoris adalah karya saya bersama komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor dan LIPI. Bogor, Agustus 2016 Agnes Yuliana NIM P

4 RINGKASAN AGNES YULIANA. Konstruksi dan Ekspresi Gen Penyandi Enzim L-Arabinosa Isomerase pada Permukaan Sel Khamir Pichia pastoris. Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO dan WIEN KUSHARYOTO. D-tagatosa, isomer dari D-galaktosa merupakan golongan ketoheksosa yang langka di alam. D-tagatosa memiliki kemiripan tingkat kemanisan (92%) dan rasa dengan sukrosa, namun sedikit menghasilkan kalori, sehingga D-tagatosa berpotensi menjadi pemanis dan pengganti gula pada industri makanan dan farmasi. Belakangan ini mulai berkembang pembuatan D-tagatosa dari D- galaktosa secara biologis menggunakan biokatalis. Beberapa enzim yang terlibat dalam biotransformasi D-tagatosa telah banyak dipelajari dan L-arabinosa isomerase (L-AI) dianggap paling berpotensi untuk digunakan pada produksi D- tagatosa karena dapat mengkatalis isomerisasi D-galaktosa menjadi D-tagatosa. Penelitian sebelumnya menunjukkan aktivitas relatif L-AI dalam mengkatalis D- galaktosa menjadi D-tagatosa meningkat sejalan dengan kenaikan temperatur. Oleh karena itu, penggunaan temperatur tinggi pada L-AI diharapkan dapat meningkatkan produksi D-tagatosa. Teknologi berbasis permukaan sel adalah salah satu pendekatan yang memungkinkan peptida atau protein target diekspresikan pada permukaan sel dan sejauh ini sistem ekspresi pada permukaan sel khamir merupakan sistem yang paling banyak digunakan dibandingkan sistem ekspresi yang lain. Sistem ini membutuhkan suatu protein permukaan yang dapat menampilkan protein target pada pemukaan sel khamir. α-agglutinin adalah protein yang terdapat pada permukaan Saccharomyces cerevisiae dan dapat digunakan dalam sistem tampilan permukaan pada khamir lainnya, seperti Pichia pastoris. P. pastoris merupakan khamir metilotropik yang dapat menggunakan metanol sebagai sumber karbon. Kelebihan utama yang dimiliki oleh P. pastoris dibandingkan sel prokariot adalah sel ini mampu melakukan modifikasi pascatranslasi seperti pelipatan protein, glikosilasi, dan pembentukkan ikatan disulfida. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi dan mengekspresikan gen penyandi L-AI pada permukaan sel khamir P. pastoris. Gen araa, penyandi L-AI, telah disubkloning ke dalam vektor pj912-agα di bawah kontrol promotor terinduksi metanol (P AOXI ) dan difusi dengan sinyal sekresi MF-α, α-agglutinin, dan tag His sehingga menghasilkan vektor rekombinan pj912-agα-araa. Vektor rekombinan tersebut telah berhasil dikonstruksi dan urutan basanya telah diverifikasi, serta telah dilinearisasi dengan enzim SacI sebelum digunakan untuk transformasi. P. pastoris GS115 digunakan sebagai inang dalam transformasi. Vektor rekombinan tersebut telah berhasil diintegrasikan ke dalam genom P. pastoris GS115. Sel transforman yang stabil secara genetik telah diperoleh melalui seleksi pada media yang mengandung zeocin hingga konsentrasi 1000 μg/ml. Protein rekombinan L-AI juga telah berhasil diekspresikan pada permukaan sel P. pastoris GS115. Pengamatan menggunakan mikroskop fluoresence telah membuktikan bahwa sel transforman berhasil memancarkan pendaran berwarna hijau pada permukaan sel yang berasal dari interaksi protein fungsional His6 dan antibodi rabbit polyclonal to 6 His tag. Hal ini didukung dengan adanya pita protein target berukuran sekitar 91 kda dalam analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa sel transforman telah

5 berhasil mengekspresikan protein target yang menyatu dengan α-agglutinin dan tag His. Percobaan menggunakan manik magnet menunjukkan bahwa sel P. pastoris rekombinan melekat pada permukaan manik magnet. Secara keseluruhan hasil tersebut meyakinkan bahwa fusi protein L-AI telah berhasil diekspresikan pada permukaan sel P. pastoris. Kata Kunci: Sistem tampilan permukaan khamir, Pichia pastoris, araa, L- arabinosa isomerase, D-tagatosa.

6 SUMMARY AGNES YULIANA. Construction and Expression Gene Encoding of L-Arabinose Isomerase in Cell-Surface of Pichia pastoris. Supervised by ANTONIUS SUWANTO and WIEN KUSHARYOTO D-tagatose, an isomer of D-galactose is a rare natural ketohexose. It has similar levels of sweetness (92%) and flavor with sucrose, but it has low caloric value. D-tagatose potentially be a sweetener and sugar substitute in the food and pharmaceutical industries. Recently, there has been great interest in the biological manufacture of D-tagatose from D-galactose. Several enzymes involved in the biotransformation of D-tagatose have been investigated and L-arabinose isomerase (L-AI) is considered the most potential to be used in the production of D-tagatose as it can catalyze the isomerization of D-galactose to D-tagatose. Previous research showed relatively L-AI activity in catalyzing the D-galactose to D- tagatose increases at elevated temperature. Therefore, the use of high temperature in L-AI may expected to increase the production of D-tagatose. Microbial cellsurface based technology is one approach that allows a target peptide or protein to be presented on the surface of cells, and yeast cell-surface display is the most useful among various display systems developed so far. This system requires a surface protein that could display target protein on the cell surface. The α- agglutinin is a protein found on the cell-surface of Saccharomyces cerevisiae and can be used in yeast cell-surface display system in other yeast strains, such as Pichia pastoris. P. pastoris is a methylotropic yeast which could use methanol as carbon source. A main advantage possessed by P. pastoris over prokaryotic cells is that the cell could proceed post-translational modifications of proteins such as protein folding, glycosylation and disulfide-bond formation. The aim of this study is to construct and express the gene encoding L-AI in the cell-surface of P. pastoris. The araa, gene encoding L-AI, was subcloned into pj-912-agα vector under the control of the promoter is induced methanol (P AOXI ) and fused with MFα signal peptide, α-agglutinin and His-Tag, resulting in pj912-agα-araa recombinant vector. The recombinant vector was successfully constructed and its sequence was verified, and had been linearized with SacI enzyme before it was used for transformation. P. pastoris GS115 was used as the host of transformation. The recombinant vector has been successfully integrated into the genome of P. pastoris GS115. Genetically stable transformed cells had been obtained after selection on up to 1000 μg/ml zeocin-contained medium. L-AI recombinant proteins have been successfully expressed in the cell-surface of P. pastoris GS115. Observation using fluorescence microscope had proven that successful transformed cells emit green fluorescence on the cell surface derived from the interaction of functional His6 protein and rabbit polyclonal antibody to 6 His tag. This was supported by the presence of target protein band with the size of approximately 91 kda in the SDS-PAGE analysis which showed that transformants cells have successfully expressed the target protein fused α- agglutinin and His tag. The experiment using magnetic beads showed that transformed P. pastoris cells are found to be well attached to the surface of magnetic beads. It revealed the interaction between Ni 2+ on the magnetic beads

7 surface and His6-tagged protein. Those results also assured that the L-AI fusion protein was successfully expressed on the cell-surface of P. pastoris. Keywords: yeast surface display sistem, Pichia pastoris, araa, L-arabinose isomerase, D-tagatose.

8 Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB dan LIPI Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB dan LIPI

9 KONSTRUKSI DAN EKSPRESI GEN PENYANDI ENZIM L-ARABINOSA ISOMERASE PADA PERMUKAAN SEL KHAMIR Pichia pastoris AGNES YULIANA Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Teknologi Industri Pertanian SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

10 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si

11 Judul : Konstruksi dan Ekspresi Gen Penyandi Enzim L-Arabinosa Isomerase pada Permukaan Sel Khamir Pichia pastoris Nama : Agnes Yuliana NIM : P Disetujui oleh Komisi Pembimbing Prof Dr Ir Antonius Suwanto, M.Sc Ketua Dr rer nat Wien Kusharyoto Anggota Diketahui oleh Ketua Program Studi Bioteknologi Dekan Sekolah Pascasarjana Prof Dr Ir Suharsono, DEA Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr Tanggal Ujian : 26 Agustus 2016 Tanggal Lulus:

12 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta ala karena berkat Rahmat dan Hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian yang dilaksanakan sejak November 2014 dengan judul Konstruksi dan Ekspresi Gen Penyandi Enzim L-Arabinosa Isomerase pada Permukaan Sel Khamir Pichia pastoris. Tesis ini merupakan hasil penelitian yang dilakukan di Laboratorium Rekayasa Genetika Terapan dan Disain Protein, Pusat Penelitian Bioteknologi- LIPI dan dibiayai oleh Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI. Hasil penelitian ini sedang dalam penelaahan untuk dipublikasikan pada International Journal on Advanced Science, Engineering and Information Technology (IJASEIT). Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc dan Dr. rer. nat. Wien Kusharyoto selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan arahan selama penelitian hingga penyusunan tesis ini. Penulis juga tidak lupa berterima kasih kepada Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si selaku penguji di luar komisi pembimbing pada sidang tesis yang telah memberikan kritik dan saran dalam penulisan. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Dr. Asrul Muhamad Fuad, M.Si beserta seluruh staf Laboratorium Rekayasa Genetika Terapan dan Disain Protein serta Laboratorium Rekayasa Protein dan Sistem Penyampaian Obat, Pusat Penelitian Bioteknologi- LIPI yang telah membantu penulis selama melakukan penelitian. Ungkapan terima kasih juga tidak lupa disampaikan kepada mama, papa, dan seluruh keluarga yang telah memberikan begitu banyak perhatian, dukungan, do a dan kasih sayang kepada penulis, serta sahabat, orang terkasih, dan teman-teman Bioteknologi IPB 2013 atas segala perhatian, do a, kerja sama, dan waktu luang kepada penulis. Penulis menyadari akan keterbatasan yang dimiliki, maka masukan berupa saran dan kritik guna penyempurnaan penulisan karya ilmiah ini sangat diharapkan. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan terutama pengembangan ilmu penulis. Bogor, Agustus 2016 Agnes Yuliana

13 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN DAFTAR ISI 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Tujuan Penelitian 3 Manfaat Penelitian 3 2 TINJAUAN PUSTAKA 4 D-Tagatosa 4 L-Arabinosa Isomerase 5 Sistem Ekspresi P. pastoris 7 Sistem Tampilan Permukaan Khamir (Yeast Surface Display/YSD) 8 3 METODE PENELITIAN 12 Waktu dan Tempat Penelitian 12 Bahan 12 Prosedur Penelitian 13 Konstruksi vektor ekspresi dan sub-kloning 13 Pembuatan sel kompeten Pichia pastoris 13 Transformasi P. pastoris melalui elektroporasi 14 Seleksi koloni P. pastoris transforman 14 Ekspresi protein rekombinan 14 Analisis ekspresi protein rekombinan dengan Immunofluoresence 15 Ekstraksi protein rekombinan dari dinding sel P. Pastoris 15 Analisis ekspresi protein dengan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 16 Analisis ekspresi protein permukaaan dengan manik magnet 16 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 18 Subkloning Gen araa ke dalam Vektor Ekspresi 18 Introduksi P. pastoris dengan Vektor Rekombinan 24 Seleksi Transforman P. pastoris 26 Ekspresi Protein Rekombinan 27 5 SIMPULAN DAN SARAN 34 Simpulan 34 Saran 34 DAFTAR PUSTAKA 35 LAMPIRAN 45 RIWAYAT HIDUP 57 x xi xi xii

14 DAFTAR TABEL 1. Karakteristik fisik dan kimia D-tagatosa (Levin 2002; Skytte 2006) 4 2. Primer yang digunakan 12 DAFTAR GAMBAR 1. Perbandingan struktur molekul tagatosa dan fruktosa 4 2. Reaksi isomerisasi yang dikatalis enzim L-AI 6 3. Model molekul L-AI ketika mengikat substrat galaktosa 7 4. Komposisi dan struktur permukaan sel S. cerevisiae Prinsip tampilan permukaan sel khamir Vektor kloning dan ekspresi pj912-agα (DNA 2.0) Konstruksi vektor PJ912-AGα-araA Immunofluorescence di permukaan sel khamir Pemotongan rantai β-glukan oleh selulase kompleks Analisis protein permukaan menggunakan manik magnet Hasil isolasi plasmid pet-21b-araa Skema amplifikasi PCR dan pemotongan gen araa Hasil analisis elektroforesis gel agarosa terhadap hasil isolasi gen target Skema pemotongan plasmid pj912-agα dengan enzim restriksi SalI dan Kpn2I Visualisasi hasil isolasi plasmid pj912-agα dan pemotongan menggunakan enzim restriksi Vektor rekombinan pj912-agα-araa Koloni hasil transformasi pada E. coli DH5α Hasil isolasi vektor rekombinan pj912-agα-araa Skema amplifikasi PCR vektor rekombinan pj912-agα-araa menggunakan primer AOX-F dan AOX-R Hasil amplifikasi vektor rekombinan pj912-agα-araa dengan menggunakan primer AOX-F dan AOX-R Skema pemotongan vektor rekombinan pj912-agα-araa dengan enzim restriksi SalI dan NcoI Hasil analisis restriksi pj912-agα-araa Hasil analisis restriksi pj912-agα-araa dengan enzim SacI Integrasi vektor reokombinan pada genom P. pastoris Sel P. pastoris hasil transformasi Skema amplifikasi PCR vektor rekombinan pj912-agα-araa menggunakan primer PPAI-F dan PPAI-R Hasil PCR koloni P. pastoris transforman dengan menggunakan primer PPAI-F dan PPAI-R Struktur bagian permukaan sel P. pastoris rekombinan Ekstraksi protein target dari dinding sel P. pastoris rekombinan dengan menggunakan enzim selulase Visualisasi SDS-PAGE supernatan protein rekombinan bebas sel Analisis immunofluorescence menggunakan mikroskop fluorescence 31

15 32. Struktur kimia Histidin Skema pengikatan gugus N cincin imidazole pada protein His Tag dengan ion logam Ni 2+ yang menempel pada manik magnet Analisis mikroskopis interaksi antara sel, manik magnet dan antibodi fluoresence 33 DAFTAR LAMPIRAN 1. Sekuen DNA dan asam amino dari Indo-GSAI Sekuen DNA vektor ekspresi pj912-agα (DNA 2.0) Elektroforesis gel agarosa Komposisi larutan dan media yang digunakan beserta cara pembuatannya Komposisi gel poliakrilamid Hasil analisis sekuensing DNA dari pj912-agα-araa 53

16

17 1 1 PENDAHULUAN Latar Belakang L-arabinosa isomerase (L-AI) merupakan enzim intrasel yang mengkatalis isomerisasi reversibel D-galaktosa menjadi D-tagatosa (Cheetam dan Wootton 1993). D-tagatosa dikenal sebagai salah satu pemanis rendah kalori (1.5 kkal/g). D-tagatosa merupakan ketoheksosa yang diisomerisasi dari D-galaktosa oleh L-AI, memiliki rasa seperti sukrosa, namun tingkat kemanisan 92% jika dibandingkan dengan sukrosa (Levin et al. 2002). D-tagatosa secara alami terdapat di alam dalam jumlah sedikit pada getah Stericulia setigera, dan dapat ditemukan pada produk olahan susu (Troyono et al. 1992; Mendoza et al. 2005). D-tagatosa bermanfaat bagi kesehatan diantaranya dapat menurunkan berat badan, bertindak sebagai prebiotik, anti-histolisis (Oh 2007), serta mereduksi sejumlah gejala yang berhubungan dengan diabetes tipe 2, hiperglikemia, obesitas, anemia dan hemofilia (Levin 2002; Lu et al. 2007). Peran D-tagatosa sebagai antidiabetes akan bermanfaat sebagai gula alternatif di Indonesia, mengingat Indonesia menempati peringkat ke-4 dengan jumlah penderita diabetes terbesar di dunia (Wild et al. 2004). Produksi tagatosa dalam bentuk bulk sweeteners telah dilakukan pada skala industri secara kimiawi menggunakan katalis kalsium (Beadle et al. 1991). Tahapan-tahapan dan proses purifikasi yang kompleks, limbah kimia, serta produk samping (by-product) yang dihasikan menyebabkan penggunaan katalis kimia mulai ditinggalkan. Alternatif yang saat ini banyak digunakan adalah menggunakan katalis biologis seperti enzim (Oh 2007). L-AI merupakan salah satu enzim yang dapat digunakan dalam pembentukan D-tagatosa dan menjadi enzim yang paling banyak dicari untuk memproduksi D-tagatosa. Pembentukan D-tagatosa dari D-galaktosa menggunakan enzim L-AI lebih efisien dalam hal substrat dan tahapan produksinya. Studi produksi dan pencarian enzim L-AI termostabil lebih difokuskan, sebab konversi D-galaktosa menjadi D-tagatosa akan meningkat dengan peningkatan temperatur (>50ºC) (Kim et al. 2002). Selain itu, enzimenzim pangan yang bersifat termostabil juga menjadi semakin penting dalam dunia industri. Hal ini berkaitan dengan keuntungan yang akan diperoleh bila proses produksi dilakukan pada temperatur tinggi diantaranya adalah mengurangi kontaminasi, meningkatkan kecepatan reaksi sehingga menghemat waktu, tenaga dan biaya, serta menurunkan viskositas larutan fermentasi sehingga memudahkan proses produksi. Pada industri temperatur produksi D-tagatosa yang direkomendasikan jika menggunakan enzim L-AI adalah 60-65ºC, karena pada temperatur yang lebih tinggi akan menyebabkan terjadinya reaksi pencoklatan (Cheng et al. 2009). Oleh karena itu perlu adanya enzim yang dapat tetap aktif dan memiliki aktifitas optimal pada suhu tinggi. Seperti yang dilaporkan oleh Lee et al. (2005a) bahwa L-AI termofilik memiliki aktivitas katalitik untuk mengkonversi D-galaktosa menjadi D-tagatosa pada teperatur tinggi >70 o C. Dari beberapa penelitian sebelumnya, diperoleh beberapa bakteri termofilik yang menghasilkan enzim L-AI, seperti Geobacillus stearothermophilus (Jung et al. 2005), G. thermodenitrificans (Kim dan Oh 2005), Thermus sp. (Kim et al. 2003), Thermoanaerobacter mathranii (Jørgensen et al.

18 2 2004) dan Alicyclobacillus acidocaldarius (Lee et al. 2005b). Menurut Kim et al (2003) L-AI yang berasal dari G. stearothermophilus dapat menghasilkan 230 g/l tagatosa dari 500 g/l galaktosa dengan produktivitas mencapai 319 g/l per hari pada sistem batch. Sedangkan fermentasi secara kontinu menghasilkan 145 g/l tagatosa dari 300 g/l galaktosa dengan produktifitas 1,296 g/l per hari (Ryu, et al. 2003). Hasil tersebut mendekati kriteria produksi komersial. Dalam beberapa tahun terakhir, kemajuan ilmu bioteknologi dan rekayasa genetika, telah mengembangkan sistem ekspresi yang dapat menghasilkan protein heterolog fungsional seperti enzim dari inang asal ke sel mikroorganisme lainnya untuk diproduksi lebih banyak, seperti menggunakan mutan Escherichia coli (Kim et al. 2002), dan Saccharomyces cerevisiae (Sedlak dan Ho 2001), dan sistem tampilan protein heterolog pada permukaan sel mikroorganisme (bakteri, fage dan khamir). Teknik tampilan permukaan sel (cell-surface display) merupakan teknik baru yang secara luas digunakan untuk pengembangan biokatalis sel dengan menggunakan sel sebagai pembawa enzim amobil, sehingga protein yang diinginkan menyatu dengan protein dinding sel dan diperoleh strain yang dapat menghasilkan enzim sebagai protein fusi permukaan sel (Tanaka et al. 2012; Tsai et al. 2015; Smith et al. 2015; Mohamad et al. 2015). Produksi biokatalis melalui sistem tampilan permukaan sel merupakan salah satu metode yang paling hemat biaya karena tidak memerlukan pemecahkan sel, pemurnikan protein dan imobilisasi enzim, karena dengan menumbuhkan dan menginduksi sel inang, enzim akan diproduksi sebagai protein amobil pada permukaan sel, dan sel yang dipanen dapat langsung digunakan sebagai biokatalis. Sel-sel yang mengekspresikan enzim pada permukaan sel dapat digunakan beberapa kali sebagai biokatalis (Kondo dan Ueda 2004). Perkembangan sistem tampilan permukaan sel untuk ekspresi protein terus dilakukan hingga diperoleh sistem ekspresi protein heterolog pada permukaan sel mikroorganisme salah satunya adalah sistem ekspresi protein pada permukaan sel khamir. Teknik tampilan permukaan khamir (Yeast Surface Display/YSD) merupakan metode baru ekspresi protein fungsional pada permukaan sel khamir yang dapat meningkatkan afinitas, spesifisitas, dan stabilitas dari protein yang diekspresikan (Boder dan Wittrup 1997). Teknik ini juga menarik perhatian para peneliti karena dapat diaplikasikan di berbagai bidang bioteknologi dan industri, seperti imobilisasi enzim, biokonversi, bioremediasi, transduksi sinyal, biosensor, pengembangan vaksin hidup, dan screening untuk mengidentifikasi biokatalis baru (Becker et al. 2004; Ueda dan Tanaka 2000a, b; Won et al. 2006; Yue et al. 2008; Zhu et al. 2006). Teknik YSD pertama kali dikembangkan menggunakan khamir S. (Schreuder et al. 1993), namun dalam perkembangannya khamir metilotropik P. pastoris juga dapat digunakan sebagai inang dalam ekspersi pada permukaan sel (Mergler et al. 2004). Kelebihan menggunakan P. pastoris dibandingkan S. cerevisiae sebagai inang, yaitu integrasi DNA transformasi menjadi DNA genomik, pembentukan transforman yang lebih stabil dengan produktivitas protein yang lebih tinggi, dan tidak terjadinya proses hiperglikosilasi (Daly dan Hearn 2005). Hampir seluruh sistem YSD pada P. pastoris didasari pada pengembangan sistem tampilan permukaan pada S. cerevisiae (Mergler et al. 2004). Teknik ekspresi ini membutuhkan suatu protein permukaan yang dapat menampilkan protein target pada pemukaan sel khamir, seperti α-agglutinin yang

19 merupakan salah satu protein permukaan pada S. cerevisiae. Mergler et al. (2004) telah mengkonstruksikan enzim Kluyveromyces yellow pada sebagian α-agglutinin ujung C terminal dari S. Cerevisiae, dan mengekspresikannya pada permukaan sel P. pastoris. Sejak itu, mulai dikembangkan teknik ekspresi protein heterolog pada permukaan sel khamir menggunakan beberapa jenis protein permukaan sebagai jangkar protein, seperti Flo1p (Jiang et al. 2007; Tanino et al. 2006), Pir1 (Wang et al. 2008; Khasa et al. 2011), sistem Sed1 (Su et al. 2010; Dai et al. 2012) dan α-agglutinin (Pan et al. 2012), yang semua berasal dari S. cerevisiae telah dikembangkan dan diterapkan pada sistem tampilan permukaan sel P. pastoris. 3 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi dan mengekspresikan gen araa penyandi enzim L-AI dari G. stearothermophilus pada permukaan sel khamir P. pastoris. Manfaat Penelitian Adapun manfaat yang diharapkan dari penelitian ini, yaitu sistem ekspresi enzim pada permukaan sel khamir P. pastoris dapat diaplikasikan pada produksi enzim skala industri.

20 4 2 TINJAUAN PUSTAKA D-Tagatosa D-tagatosa termasuk ke dalam monosakarida golongan ketoheksosa (Karabinos, 1952). D-tagatosa merupakan isomer dari D-galaktosa dan sangat jarang ditemukan di alam. Oleh karena itu D-tagatosa termasuk ke dalam golongan gula langka. Secara alami D-tagatosa dapat ditemukan pada getah S. setigera (Hirst et al. 1949). D-tagatosa memiliki struktur kimia yang mirip dengan fruktosa dan telah dikenal sebagai pemanis yang aman digunakan pada bahan pangan dan produk farmasi. Food and Drug Administration Amerika Serikat (US. FDA) telah menetapkan D-tagatosa sebagai komponen Generally Recognized As Safe (GRAS) (Levin 2002). Gambar 1 Perbandingan struktur molekul tagatosa dan fruktosa (Skytte 2006) Temperatur leleh (Tm) D-tagatosa berkisar 134 o C dan stabil pada ph 2-7. D- tagatosa memiliki kelarutan yang tinggi (58% (w/w) pada suhu 21 o C). D-tagatosa merupakan gula reduksi dan akan mengalami reaksi karamelisasi pada temperatur tinggi sehingga akan menghasilkan warna coklat. D-tagatosa lebih mudah terurai pada temperatur tinggi dibandingkan dengan sukrosa (Kim 2004; Levin 2002). D- tagatosa merupakan gula malabsorbing, gula ini dapat diserap dalam jumlah sedikit di usus kecil (Buemann et al. 1999a,b, 2000; Laerke dan Jensen 1999). Fraksi D-tagatosa yang tidak dapat diserap tubuh dapat ditemukan pada usus besar dan difermentasi oleh mikroflora usus (Bertelsen et al. 2001). D-tagatosa memiliki kemiripan rasa dan tingkat kemanisan (92%) dengan gula sukrosa namun tidak menimbulkan cooling effects setelah mengkonsumsinya (Levin et al 1995). Meskipun rasa D-tagatosa mirip dengan sukrosa, D-tagatosa tidak berperan dalam menghasilkan kalori (Levin 2002, Zehner dan Lee 1988). Tabel 1 Karakteristik fisik dan kimia D-tagatosa (Levin 2002; Skytte 2006) Karakteristik Penjelasan Nama umum D-tagatosa, tagatosa Sinonim D-lyxo-hexulose Titik leleh o C Massa jenis (g/ml) Bentuk fisik Kristal Nilai kalori < 1.5 Kkal/g Cooling effect dan karsinogenesitas Tidak ada

21 5 D-tagatosa bermanfaat bagi kesehatan karena berperan dalam penurunan berat badan (Buemann et al. 2000), tidak memiliki efek glikemik (Donner et al. 1999; Seri et al. 1993), dapat mengurangi gejala diabetes tipe 2, hiperglikemia, anemia, dan hemofilia (Levin 2002; Seri et al. 1993). D-tagatosa dapat digunakan sebagai pemanis rendah kalori dalam berbagai makanan, minuman, suplemen kesehatan, obat-obatan, dan pasta gigi, dll. D-tagatosa juga digunakan dalam sintesis senyawa aktif, dan sebagai bahan tambahan dalam detergen, kosmetik, dan formula obat-obatan (Ibrahim dan Spardlin 2000). D-tagatosa dapat diproduksi dengan metode kimia menggunakan katalis kalsium (Beadle et al. 1991), namun metode kimia memiliki beberapa kelemahan seperti membutuhkan proses purifikasi yang kompleks, menghasilkan limbah kimia dan produk samping. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan metode produksi D-tagatosa melalui proses biologis dengan menggunakan biokatalis. Pembentukan D-tagatosa secara biologi telah dipelajari menggunakan beberapa sumber biokatalis, seperti enzim sorbitol dehidrogenase yang dihasilkan oleh Arthrobacter globiformis (Izumori et al. 1984), Gluconobacter oxydans (Manzoni dan Rollini 2001; Rollini dan Manzoni 2005), Mycobacterium smegmatis (Izumori dan Tsuzaki 1988), Klebsiella pneumoniae (Shimonishi et al. 1994) dan Enterobacter agglomerans (Muniruzzanman et al. 1994) yang dapat mengkonversi D-galaktikol menjadi D-tagatosa (Rollini & Manzoni 2005). Selain itu, enzim D-psikosa 3-epimerase dari Agrobacterium tumefaciens (Kim et al. 2006) dan D-tagatosa 3-epimerase yang dihasilkan oleh Pseudomonas cichorii yang dapat mengkonversi D-sorbosa menjadi D-tagatosa (Itoh et al. 1994; Ishida et al. 1997; Yoshida et al. 2007). Namun, D-sorbosa dan D-galaktikol merupakan substrat yang mahal sehingga kecil kemungkinan untuk dapat diproduksi pada skala industri. Mekanisme baru dalam memproduksi D-tagatosa adalah menggunakan mekanisme konversi D-galaktosa menjadi D-tagatosa (Cheetham dan Wootton 1993; Patel et al. 2016). E. agglomerans dapat menghasilkan D-tagatosa dari D- galaktosa ketika ditumbuhkan dalam media terinduksi L-arabinosa (Oh et al. 1998). Berdasarkan studi selajutnya ditemukan enzim L-AI dari mikroorganisme seperti E. coli dan Bacillus subtilis yang dapat mengkatalis konversi D-tagatosa dari D-galaktosa (Roh et al. 2000). L-Arabinosa Isomerase L-arabinosa isomerase (L-AI; EC ) merupakan enzim intraseluler yang mengkatalis konversi L-arabinosa menjadi L-ribulosa sebagai tahap awal dari jalur metabolisme aldopentosa pada bakteri dengan operon ara. Secara in vitro L-AI juga memiliki kemampuan untuk mengkatalis proses isomerisasi D- galaktosa menjadi D-tagatosa (Lee et al. 2004). Kemampuan L-AI dalam mengkatalis reaksi isomerisasi D-galaktosa menjadi D-tagatosa dikarenakan kemiripan struktur konfigurasi antara D-galaktosa dengan L-arabinosa (Yoon et al. 2003). Karena kemampuannya dalam mengkatalis reaksi isomerisasi pada D- galaktosa, enzim L-AI sering juga disebut sebagai galaktosa isomerase (Zhang, et al. 2010). Pada tahun 1993, terjadi peningkatan penggunaan L-nukleosida

22 6 dibandingkan dengan D-nukleosida, karena pada penggunaan L-nukleosida dihasilkan aktivitas biologis yang lebih tinggi dan toksisitas yang lebih rendah (Cho et al. 2005). Gambar 2 Reaksi isomerisasi yang dikatalis enzim L-AI (Lee et al. 2004) Beberapa mikroorganisme telah diketahui menghasilkan enzim L-AI. Beberapa mikroorganisme mesofilik yang menghasilkan enzim L-AI antara lain E. coli (Yoon et al. 2003), B. halodurans (Lee et al. 2005a), dan Lactobacillus fermentum (Xu et al. 2011). Selain itu L-AI juga telah diisolasi dari mikroorganisme termofilik seperti G. stearothemophilus (Lee et al. 2005a), G. thermodenitrificans (Kim dan Oh 2005), B. stearothermophilus US100 (Rhimi dan Bejar 2005), B. stearothermophilus IAM11001 (Cheng et al. 2010), B. coagulans (Mei et al. 2016), Alicyclobacillus acidocaldarius (Lee et al. 2005b), Anoxybacillus flavithermus (Li et al. 2011), Thermus sp. IM6501 (Kim, 2003), Acidothermus cellulolytics (Cheng et al. 2010), Thermoanaerobacter mathranii (Jørgensen et al. 2004), dan Enterococcus faecium (Manzo et al. 2015), dan pada mikroorganisme hipertermofilik seperti Thermotoga neapolitana (Kim et al. 2002), dan T. maritima (Lee et al. 2004; Bortone dan Fidaleo 2015). Sebagian besar L-AI aktif dan optimal pada temperatur o C dan ph lebih dari 7; hanya L-AI yang berasal dari L. sakei23k yang menunjukkan aktivitas optimum pada temperatur rendah berkisar o C dan kisaran ph 5-7. Selain itu, hampir semua karakteristik L-AI memerlukan ion logam bivalen seperti Mn 2+ atau Co 2+ sebagai kofaktor untuk stabilitas dan aktivitas yang lebih tinggi (Lee et al. 2005b). Namun, untuk memproduksi bahan pangan penggunaan kofaktor Co 2+ tidak direkomendasikan karena menimbulkan bahaya kesehatan (Jørgensen et al. 2004). Beberapa kofaktor lain yang dapat meningkatkan aktivitas katalis dan stabilitas enzim L-AI antara lain ion Fe 2+, Mg 2+ dan Ca 2+ (Oh 2007; Kim dan Oh 2005). Aktivitas enzim L-AI akan menurun jika tidak ada ion logam sebagai kofaktor (Lee et al. 2005a) Enzim L-AI disandikan oleh gen araa yang terletak pada kompleks gen L- arabinosa. Gen araa terdiri dari pasang basa (pb). Jumlah pb yang dimiliki gen araa tergantung dari mikroorganisme yang menghasilkannya. Gen araa yang dimikili G. stearothermophilus strain lokal adalah 1512 pb (Firiani dan Saksono 2010). Enzim L-AI yang diekspresikan oleh mikroorganisme B. stearothermophilus US 100, G. stearothermophilus dan G. thermodenitrificans berukuran sekitar 56 kda (Rhimi dan Bejar 2006; Kim dan Oh 2005). Umumnya

23 L-AI terdiri dari 4 (tetramer) struktur sekunder yang berbentuk alfa-heliks, namun L-AI yang dihasilkan oleh E. coli terdiri dari heksamer. Asam amino yang berada pada sisi aktif L-AI adalah asam glutamat pada posisi 305 dan 330 yang akan mengikat substrat arabinosa maupun galaktosa untuk dikatalis menjadi produk. Struktur L-AI pada saat mengikat substrat galaktosa dapat dilihat pada gambar 3 dibawah ini. 7 Gambar 3 Model molekul L-AI ketika mengikat substrat galaktosa (Kim et al. 2009) Sistem Ekspresi P. pastoris Dalam pengembangan industri bioproses, pemilihan inang mikroorganisme yang sesuai merupakan hal yang paling penting. Beberapa parameter yang harus dipertimbangkan dalam memilih inang mikroorganisme antara lain harus aman, mudah diperoleh, memiliki produktivitas yang tinggi, menghasilkan sedikit produk samping, dapat tumbuh dalam media yang sederhana, dapat tumbuh dalam kondisi yang moderat dan memungkinkan untuk peningkatan skala produksi (Kirk dan Othmer 1994; Soetaert dan Vandamme 2010). Salah satu sel inang yang paling populer digunakan untuk ekspresi protein rekombinan yang merupakan turunan dari genom eukariotik adalah khamir metilotropik P. pastoris (Eckart dan Bussineau 1996). P. pastoris merupakan khamir metilotropik yang memanfaatkan metanol sebagai sumber karbon tunggal dan pertama kali dilaporkan oleh Ogata et al. (1969). P. pastoris diketahui berpotensi sebagai penghasil protein sel tunggal (PST) untuk pakan ternak. Pada tahun 1970, Philips Petroleum Company mengembangkan metode pertumbuhan dan komposisi media untuk P. pastoris dan diketahui bahwa pertumbuhan P. pastoris pada media metanol kultur kontinu mencapai kepadatan sel tertinggi berkisar > 130 g/l berat sel kering (Wegner 1990). Setelah itu di tahun 1980-an, Philips Petroleum Company and Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Inc. (SIBIA, La Jolla, CA) mulai mempelajari P. pastoris sebagai sistem ekspresi untuk produksi protein heterolog (Cereghino dan Cregg, 2000). Kelebihan menggunakan sistem ekspresi P. pastoris yang merupakan organisme eukariot antara lain (1) teknik biologi molekuler yang diterapkan sama seperti yang dipelajari pada khamir S. cerevisiae, (2) memiliki kemampuan untuk ekspresi protein asing baik secara intraseluler maupun ekstraseluler, (3) memiliki kemampuan untuk melakukan banyak modifikasi pasca translasi seperti proses

24 8 glikolisasi, pembentukan ikatan disulfida, dan proses sproteolitik, (4) ketersediaan sistem ekspresi sebagai kit komersial, (5) dapat hidup pada media yang sederhana (6) memiliki promotor yang sangat kuat yaitu alkohol oksidase 1 (P AOX1 ) sehingga tingkat ekspresinya tinggi dan dapat menginduksi hingga 1000 kali lipat ketika sumber karbon diubah menjadi metanol, (7) penggunaan metanol dapat mengurangi kontaminasi bakteri, (8) kemampuannya untuk tumbuh hingga diperoleh kepadatan sel yang tinggi mencapai 10 kali lipat dibandingkan dengan kultur S. cerevisiae sehingga memungkinkan untuk diproduksi dalam skala besar, dan (9) mensekresikan sangat sedikit protein native sehingga mempermudah proses purifikasi protein rekombinan yang disekresikan (Cereghino dan Cregg 2000). Sudah lebih dari 700 protein telah diekspresikan menggunakan P. pastoris (Zhang et al. 2009), diantaranya adalah enzim Lipase B yang dihasilkan oleh Candida antartica (Moura et al. 2015), Lipase dari Rhizopus orizae (Li et al. 2015), serta protein mpmrab7 dab pvp28 yang merupakan protein pertahanan dari White Spot Syndrome Virus (WSS) pada udang (Ananphongmanee et al. 2015). Ada tiga fenotipe P. pastoris yang dapat memanfaatkan metanol. Pertama, Mut + atau methanol utilization plus phenotype yang mempunyai gen AOX1 dan AOX2, tumbuh dalam metanol pada tingkat tipe liar dan karena itu membutuhkan metanol dalam jumlah banyak pada saat kultivasi skala besar (Cereghino dan Cregg 2000). Kedua, Mut s atau methanol utilization slow phenotype, gen AOX1 dihilangkan sehingga tingkat penyerapan metanol melambat karena AOX2 lemah. Pada kasus yang sama strain Mut s mempunyai produktivitas yang tinggi dibandingkan dengan strain tipe liar (Cregg et al. 1987; Pal et al. 2006). Yang ketiga Mut - atau methanol-utilising minus phenotype, dimana kedua gen AOX dihilangkan sehingga tidak dapat tumbuh pada metanol dan memiliki tingkat pertumbuhan yang rendah (Macauley-Patrick et al. 2005). Ekspresi protein rekombinan sebagian besar dilakukan menggunakan strain fenotip Mut + (Macauley-Patrick et al. 2005). Promotor yang biasa digunakan dalam sistem ekspresi protein rekombinan pada P. pastoris adalah promotor alkohol oksidase 1 (P AOX1 ) (Cereghino dan Cregg 2000, Bushell et al. 2003, Lee et al. 2003, Macauley-Patrick et al. 2005, Jahic et al. 2006, Potvin et al. 2010). P AOX1 akan ditekan/direpresi ketika P. pastoris tumbuh dalam medium yang mengandung glukosa atau gliserol, tapi akan terinduksi kuat hingga 1000 kali lipat ketika sel ditumbuhkan pada media yang mengandung metanol. Kemampuan menekan ekspresi protein asing akan bermanfaat ketika protein yang dihasilkan merupakan racun bagi sel (Cereghino et al. 2002). Enzim alkohol oksidase membuat hingga 33% dari total protein sel ketika sel ditumbuhkan pada media metanol (Couderec dan Baretti 1980). Sistem Tampilan Permukaan Khamir (Yeast Surface Display/YSD) Sel dan virus memiliki sejumlah molekul protein dan kompleks lipid seperti membran sel, dinding sel atau mantel protein yang memiliki kemampuan dalam mempertahankan kondisi fisiologis. Molekul protein dan kompleks lipid pada permukaan sel bukan hanya sebagai pembatas antara bagian sitosol sel dan bagian luar sel tetapi juga berperan dalam komunikasi antara bagian dalam dan luar sel,

25 pertukaran molekul, transpor protein dan sebagainya (Shibasaki et al. 2009) Beberapa protein permukaan diperpanjang melintasi membran plasma dan yang lainnya terikat oleh interaksi kovalen maupun nonkovalen dengan komponen permukaan sel. Sel memiliki sistem untuk menahan protein permukaan spesifik dan untuk membatasi protein permukaan domain tertentu pada permukaan sel. Di bidang bioteknologi, permukaan sel dapat dimanfaatkan dengan memanfaatkan mekanisme transpor protein ke permukaan sel. Pembentukan sistem untuk menampilkan protein heterolog pada permukaan sel mikrooraganisme diharapkan dapat digunakan dalam pemisahan polipeptida yang dihasilkan; memproduksi katalis mikroba, dan vaksin hidup, dan screening dan modifikasi protein baru. Pemanfaatan permukaan sel hidup sangat berguna untuk aplikasi dalam bidang mikrobiologi dan biologi molekuler (Ueda dan Tanaka 2000a, b). Sistem ekspresi permukaan awalnya diketahui ketika sebuah penelitian menunjukkan bahwa peptida dapat berfusi dengan protein docking (PIII) dari filament fage tanpa mempengaruhi kemampuannya untuk menginfeksi E. coli (Scott dan Smith 1990). Hal ini menyebabkan pengembangan terhadap sistem tampilan fage (Chiswell dan McCafferty 1992; Wu et al. 2016; Tan et al. 2016). Namun, hibridisasi polipeptida yang berukuran lebih besar dan menyatu dengan mantel protein fage membuatnya tidak mudah untuk dimasukkan ke dalam fage, akhirnya muncul teknologi baru yang menggunakan bakteri sebagai inang untuk ekspresi protein heterolog (Georgiou et al. 1997; Little et al. 1993; Ko et al. 2015; Michon et al. 2016). Bakteri gram negatif seperti E. coli yang memiliki membran luar pada permukaan selnya telah digunakan untuk ekspresi sejumlah protein heterolog pada permukaan sel. Selain itu bakteri gram positif dalam kelompok Staphylococcus telah digunakan sebagai inang sistem tampilan permukaan (Francisco et al. 1993). Meskipun beragam mikroorganisme telah diteliti, namun untuk menampilkan ekspresi protein heterolog yang berasal dari organisme eukariot sangat sulit dilakukan di sel bakteri (Shibasaki et al. 2009) sehingga dikembangkan teknik baru menggunakan khamir sebagai inang untuk ekspresi protein heterolog. Sistem ekspresi YSD merupakan teknik yang paling populer digunakan diantara berbagai sistem ekspresi protein heterolog yang telah dikembangkan (Kondo dan Ueda 2004; Liu et al. 2015; Tanaka dan Kondo, 2015). Sistem ekspresi ini merupakan salah satu metode ekspresi protein fungsional yang kuat dan dapat digunakan untuk meningkatkan afinitas, spesifisitas dan stabilitas protein yang diekspresikan (Boder dan Wittrup 1997). Kelebihan utama dari sistem ekspresi tampilan permukaan sel khamir adalah pada kesamaan mekanisme pelipatan dan sekresi protein dengan sel mamalia. Pada sistem ini protein rekombinan diekspresikan pada permukaan sel khamir dalam bentuk fusi dengan protein permukaan yang bertindak sebagai jangkar protein (anchoring protein) (Kondo dan Ueda 2004). Sistem ekspresi pada pemukaan sel khamir pertama kali dikembangkan menggunakan S. cerevisiae (Screuder et al. 1993). S. cerevisiae telah memiliki status GRAS yang menyatakan khamir ini aman digunakan untuk aplikasi di bidang pangan dan farmasi (Kondo dan Ueda 2004) S. cerevisiae merupakan sel inang eukariot yang digunakan dalam rekayasa genetika. Penggunaan S. cerevisisiae sebagai sel inang disebabkan karena sel ini dapat melakukan modifikasi pasca translasi seperti melipat protein dan melakukan glikosilasi pada protein heterolog eukariot. Selain itu penggunaan S. cerevisiae 9

26 10 menguntungkan karena sel ini dapat tumbuh hingga diperoleh kepadatan sel yang tinggi pada media yang sederhana. Ditambah lagi khamir memiliki kemampuan untuk menampilkan protein eukariot yang berbeda beda pada permukaan sel yang sama (Shibasaki et al. 2009). Sel khamir S. cerevisiae dikelilingi oleh dinding sel yang tebal (Gambar 4) yang terdiri dari rantai β-glukan dan mannoprotein (Fleet, 1991). Dinding sel khamir terdiri dari lapisan glukan pada bagian dalam yang tersusun atas rantai β-glukan (β-1,3-glukosa dan β1,6-glukosa) (Manners et al. 1973). Dan pada lapisan luar sebagian besar tersusun atas mannoprotein yang berbentuk fibri atau sisir (Horisberger dan Vonlanthen 1977). Ada berbagai jenis mannoprotein pada dinding sel (Cid et al. 1995). Salah satu jenis mannoprotein yang ada pada dinding sel khamir adalah yang beikatan secara non-kovalen dengan dinding sel dan dapat diekstraksi dengan sodium dodecyl sulfate (SDS), sedangkan jenis lainnya dapat diekstraksi dengan digesti dinding sel menggunakan β-1,3- atau β-1,6- glukanase (Fleet dan Manners 1997; Nakayama et al. 2005). Mannoprotein yang dapat diekstrak menggunakan glukanase pada permukaan khamir, antara lain agglutinin (Aga1 dan Aga2), Flo1, Sed1, Cwp1 dan Tip1 yang memiliki jangkar glycosylphosphatidylinositol (GPI) yang tersusun atas ethanolamine phosphate-phosphate-6-mannose-α1,2-mannose-α1,6- mannose-α1,4-glucosamine-α1,6-myo-inositol-1-phospholipid (Hardwick et al. 1992; Lipke et al. 1989; Van der Vaart et al. 1995; Watari et al. 1994; Roy et al. 1991). Jangkar GPI ditemukan pada banyak protein membran plasma organisme eukariot, banyak berperan pada protein permukaan sel dan esensial untuk viabilitas khamir. Rantai glukofosfolipid ini berikatan kovalen dengan protein C- terminal dan mempunyai fungsi utama dalam asosiasi protein dengan membran sel. Gambar 4 Komposisi dan struktur permukaan sel S. cerevisiae (Schreuder et al. 1996) Protein agglutinin merupakan salah satu mannoprotein yang berikatan dengan glukan (Lipke dan Ovalle 1998) dan hanya dapat dilepaskan dengan pemecahan enzimatik menggunakan glukanase dan tidak dapat diekstraksi menggunakan SDS (Gambar 4) (Schreuder et al. 1996). Agglutinin merupakan

27 komponen dinding sel yang terletak pada permukaan terluar dan berperan dalam mediasi adhesi sel pada saat reproduksi seksual antara tipe mating sel yang berbeda. Selama mating, satu dari dua tipe agglutinin diekspresikan ke permukaan sel. Tipe mating a dan α masing-masing mengekspresikan a-agglutinin dan α- agglutinin. Protein a-agglutinin terdiri atas subunit Aga1p yang menghubungkan ke Aga2p dan merupakan subunit yang lebih kecil melalui ikatan disulfida. Aga1p dikode oleh gen AGα1 dan Aga2p dikode oleh gen AGα2. Sedangkan α-agglutinin dikode oleh gen AGα1, dan berinteraksi dengan subunit Aga2p pada tipe sel mating a. Struktur dari α-agglutinin dan subunit Aga1p tersusun atas daerah sinyal sekresi, daerah aktif, dan daerah pendukung yang mengandung serin dan treonin, dan jangkar GPI (Lipke et al. 1989). Domain yang mengandung serin dan treonin berperan sebagai spacer yang membentuk konformasi seperti batang yang merupakan hasil perluasan O-glikosilasi (Schreuder et al. 1996). Untuk menampilkan protein asing pada dinding sel, diperlukan informasi genetik dari masing-masing tipe agglutinin. Tipe α-agglutinin merupakan jangkar penahan pada permukaan sel dan sering dikombinasikan dengan sekuen sinyal sekresi melalui rekayasa genetika (Gambar 5). Fusi pada setengah bagian C-terminal α- agglutinin digunakan sebagai jangkar penahan protein asing pada permukaan sel. Dalam kasus a-agglutinin, tipe protein sekresi Aga2, subunit berikatan dengan ikatan disulfida pada protein inti Aga1, sehingga protein heterolog akan berikatan dengan lapisan glukan (Boder dan Wittrup 1997). 11 Gambar 5 Prinsip tampilan permukaan sel khamir. A. Desain genetik target protein yang akan ditampilkan di permukaan sel (Shibasaki et al. 2009). B. mekanisme transport target fusi protein ke permukaan sel dengan jangkar α-agglutinin (Kuroda dan Ueda 2011)

28 12 3 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2014 sampai dengan Juli 2016 di Laboratorium Rekayasa Genetika Terapan dan Disain Protein, Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah gen araa penyandi enzim L-AI yang diperoleh dari isolasi bakteri G. sterothermophylus di Tanjung Api, Poso, Indonesia (Fitriani dan Saksono 2010). Vektor pj912-agα IP-Free, E. coli DH5α, P. pastoris GS115, enzim restriksi SalI, Kpn2I, NcoI, dan SacI, media tumbuh bakteri LSLB (Low Salt Luria Bertani), media tumbuh khamir YPD (Yeast Potato Dextrose), BMGY (Buffered Glycerol Complex Medium), dan BMMY (Buffered Methanol Complex Medium), antibiotik ampisilin dan zeocin, primer spesifik untuk proses subkloning maupun sekuensing. Tabel 2 Primer yang digunakan Primer Sekuen nukleotida (5' 3') PPAI-F 5'-GCGTCGACATGCATCACCATCACCATCACATGCTGTC ATTACGTCCTTATGAATTTTGG-3' PPAI-R 5'-GTCACAGTACTCCGCCCCCGCCAAAATACTTCATTCC ATC-3' SeqPPAI-F 5'-CCTTGAGGGTGATTTCGACGTC-3' SeqPPAI-R 5'-GACCTCGGAAGTAGTTCTGTTTCC-3' AOX1-F 5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3' AOX1-R 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC 3' Desain primer menggunakan software online Primer3Plus Gambar 6 Vektor kloning dan ekspresi pj912-agα (DNA 2.0)

29 13 Prosedur Penelitian Konstruksi vektor ekspresi dan sub-kloning Pada penelitian sebelumnya telah diperoleh gen araa yang mengkode enzim L-AI yang diisolasi dari isolat G. stearothermophilus asal Tanjung Api, Poso, Indonesia, dan telah dikloning dalam plasmid pet-21b serta digunakan untuk transformasi E.coli DH5α. Sub-kloning gen araa ke dalam plasmid pj912-agα diawali dengan proses amplifikasi gen araa pada plasmid pet-21b. Gen araa diamplifikasi menggunakan pasangan primer PPAI-F dan PPAI-R. Pada gen araa ditambahkan tag His dan situs restriksi SalI pada ujung 5' serta situs restriksi Kpn2I pada ujung 3'. Gen araa hasil amplifikasi dan plasmid pj912-agα kemudian dipotong dengan enzim restriksi SalI dan Kpn2I. Fragmen araa dan plasmid pj912-agα yang telah dipotong selanjutnya dielektroforesis pada gel agarosa 1%. Kedua komponen tersebut kemudian diekstraksi dari gel agarosa menggunakan MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen). Hasil ekstraksi kemudian diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Ligasi antara gen araa dan plasmid pj912-agα dilakukan menurut protokol umum biologi molekuler (Ausubel et al. 2002). Hasil ligasi kemudian digunakan untuk transformasi E.coli DH5α menggunakan metode kejut panas (heat shock) dan ditumbuhkan pada media seleksi LSLB agar yang mengandung antibiotik zeocin (25µg/mL). Zeocin dipilih karena vektor pj912- AGα membawa faktor resisten terhadap antibiotik zeocin. Gambar 7 Konstruksi vektor PJ912-AGα-araA Analisis vektor rekombinan dapat dilakukan dengan isolasi plasmid rekombinan dari sel E.coli DH5α yang tumbuh pada media seleksi yang mengandung zeocin (25µg/mL), PCR vektor rekombinan, dan analisis sekuen basa DNA. Pembuatan sel kompeten Pichia pastoris Sebanyak 1 ml kultur P. pastoris strain GS115 ditumbuhkan pada media YPD dalam tabung reaksi pada temperatur 30 o C selama semalam (overnight). Selanjutkan diinokulasikan kultur yang telah diinkubasi tersebut dalam 50 ml media baru pada flask berukuran 500 ml, dan ditumbuhkan selama semalam hingga diperoleh OD 600 = Kemudian kultur disentrifugasi pada 1500 g selama 5 menit di temperatur 4 o C. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 50 ml akuabidestilata dingin steril. Sentrifugasi dilakukan kembali seperti tahapan sebelumnya dan pelet diresuspensi dengan 25 ml akuabidestilata dingin steril. Proses sentrifugasi dilakukan kembali dan pelet hasil sentrifugasi

30 14 diresuspensi dengan 2 ml sorbitol 1M. Kultur kembali disentrifugasi dan selanjutnya pelet diresuspensi menggunakan sorbitol 1M sebanyak 1 ml. Sel kompeten P. pastoris GS115 dapat disimpan dalam kondisi beku sebelum digunakan. Transformasi P. pastoris melalui elektroporasi Sebanyak 5-10 μg vektor rekombinan pj912-agα-araa dilinearisasi dengan cara dipotong menggunakan enzim restriksi SacI. Hasil pemotongan diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Vektor rekombinan yang telah dipotong dipurifikasi menggunakan MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen). Transformasi P. pastoris dilakukan dengan metoda elektroporasi. Sebanyak 80 µl sel kompeten dan 5-10 µg DNA linier (dalam 5-10 μl air steril) dimasukkan dalam kuvet elektroporasi steril (2 mm gap) kemudian diinkubasi dalam es selama 5 menit. Selanjutnya elektroporasi dilakukan menggunakan elektroporator (Gene Pulser BioRad, USA). Kondisi elektroporasi adalah kondisi optimal yang disarankan oleh produsen alat (Biorad, USA), yaitu 2000 V, 25 μf, 200 Ω, dan 5 msec. Segera setelah elektroporasi dilakukan, ditambahkan 1 ml sorbitol 1M ke dalam kuvet, dan isi kuvet kemudian dipindahkan ke tube 1.5 ml steril untuk selanjutnya diinkubasi pada temperatur 30 o C selama 1-2 jam. Hasil elektroporasi disebar pada cawan media YPDS agar yang mengandung 100 µg/ml zeocin dengan volume beragam pada setiap cawan (25, 50 dan 100 μl). Cawan diinkubasikan selama 3-10 hari pada temperatur 30 o C sampai koloni tumbuh (Invitrogen 2001) Seleksi koloni P. pastoris transforman Analisis integrasi gen araa ke dalam genom P. pastoris dilakukan menggunakan teknik PCR koloni. Sebelum dilakukan PCR, koloni khamir rekombinan diberi perlakuan terlebih dahulu. Koloni khamir dicuplik dengan tusuk gigi steril dan diresuspensikan ke dalam 50 μl NaOH 0.04M. Suspensi tersebut diinkubasi selama 5 menit pada temperatur 37 C. Suspensi ini digunakan sebagai sumber DNA dan pasangan primer PPAI-F dan PPAI-R digunakan pada proses PCR. Kondisi PCR yang digunakan adalah 40 siklus dengan kondisi denaturasi pada temperatur 95 C selama 30 detik, penempelan primer pada temperatur 56 C selama 30 detik dan perpanjangan pada temperatur 72 C selama 1 menit. Sebelum siklus PCR, dilakukan denaturasi awal selama 8 menit pada temperatur 95 C dan perpanjangan akhir selama 5 menit pada temperatur 72 C pada akhir siklus. Ekspresi protein rekombinan Koloni P. pastoris rekombinan ditumbuhkan pada media agar miring YPD dengan zeocin 100 μg/ml, kemudian dilakukan uji ekspresi protein rekombinan. Uji ekspresi protein rekombinan mengikuti prosedur pada manual EasySelectTM Pichia Expression Kit (Invitrogen, 2001). Sebanyak 1 ose koloni P. pastoris rekombinan diinokulasikan ke dalam 2 ml media cair YPD yang mengandung 100 µg/ml zeocin sedangkan untuk P. pastoris non rekombinan digunakan media

31 cair YPD tanpa zeocin. Biakan selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada temperatur 30 C dengan agitasi 250 rpm. Biakan yang tumbuh selanjutnya dipindahkan ke 5 ml media BMGY. Biakan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada inkubator bergoyang dengan temperatur 30 o C dan kecepatan 250 rpm. Sel khamir dipanen dari media BMGY dengan cara disentrifugasi pada temperatur 4 C dengan kecepatan 3000 g selama 7 menit. Biomassa sel diresuspensi dalam 5 ml media induksi BMMY. Suspensi sel dipindahkan ke dalam 25 ml BMMY baru dengan OD 600 awal= 1. Metanol dengan konsentrasi akhir 0.5% (v/v) ditambahkan ke dalam media induksi BMMY setiap 12 jam selama 3 hari untuk menginduksi ekspresi protein rekombinan. Biakan diinkubasi pada temperatur 30 C, dengan kecepatan 250 rpm. Pengambilan contoh untuk analisis dilakukan setiap jam ke-24, 48, dan 72 setelah waktu induksi pertama dan densitas sel (OD 600 ) diukur. Biakan dipanen dengan cara sentrifugasi pada temperatur 4 C, dengan kecepatan 3000 g selama 10 menit. Analisis ekspresi protein rekombinan dengan Immunofluoresence Sebanyak 10 μl kultur sel ( sel/ml) dicuci dengan 500 μl bufer TBS (50 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl [ph7.5]) dan disentrifugasi selama 3 menit pada temperatur4 o C dan kecepatan 5000 g. Selanjutnya pelet diresuspensi dalam 300 μl bufer TBS dan kemudian ditambahkan 3 μg FITC-conjugated rabbit polyclonal antibody to His6 (Abcam). Suspensi lalu diinkubasi selama 2 jam pada temperatur ruang di inkubator bergoyang dengan kecepatan 100 rpm. Sel kemudian dicuci dengan 200 μl TBST 0.1% dan setelahnya diresuspensi dalam 300 μl bufer TBS (Berlec et al. 2011). Sel diamati di bawah mikroskop fluoresence Zeiss Axio Imager.Z2 (Zeiss Axio, Jerman) menggunakan filter FITC. 15 Gambar 8 Immunofluorescence di permukaan sel khamir Ekstraksi protein rekombinan dari dinding sel P. Pastoris Protein rekombinan diekstraksi dengan menggunakan enzim selulase. Biakan sel yang diinduksi metanol selama 72 jam (OD 600 = ~20) dipanen dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 4000 g selama 5 menit. Pelet sel dibersihkan sebanyak dua kali dengan bufer A yang mengandung 1 mm PMSF (phenylmethane sulfonyl fluoride). Pelet sel diberi perlakuan dengan menambahkan 3 % enzim selulase kompleks Cellic Ctec2 (Novozymes) di dalam 100 mm bufer natrium asetat (ph 5.2) yang mengandung 1 mm PMSF untuk mengekstrak fusi protein α-agglutinin- araa dari dinding sel. Cellic Ctec2 digunakan sebagai sumber selulase kompleks karena mengandung enzim selulase,

32 16 hemiselulase, dan β-glukosidase. Selulase kompleks tersebut yang dapat memutus ikatan glikosidik pada rantai β-glukan di dinding sel khamir, sehingga protein rekombinan dapat terpisah dari sel. Inkubasi dilakukan selama 4 jam pada temperatur 37 C. Suspensi sel dan enzim kemudian disentrifugasi pada kecepatan 15,000 g selama 10 menit. Selanjutnya bagian supernatan dipipet untuk dipisahkan dari debris sel. Bagian supernatan merupakan bagian yang mengandung protein target. Sampel protein kemudian dianalisis dengan SDS PAGE. Gambar 9 Pemotongan rantai β-glukan oleh selulase kompleks Analisis ekspresi protein dengan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) Protein rekombinan yang diekspresikan dianalisis menggunakan SDS- PAGE. Sampel yang dianalisis merupakan supernatan yang telah dipresitasi sebelumnya menggunakan larutan aseton absolut. Prosedur SDS-PAGE dilakukan sesuai metode Ausubel et al. (2002) dengan pewarnaan coomasie blue. SDS-PAGE dimulai dengan pembuatan gel poliakrilamid. Pembutan gel poliakrilamid dilakukan dengan dua tahap yaitu pembuatan gel stacking dan gel separating. Gel separating dibuat dengan konsentrasi 15% sedangkan gel stacking dibuat dengan konsentrasi 8% (Lampiran 5). Larutan dihomogenkan kemudian dicetak pada kaca elektroforesis hingga menjadi gel. Langkah selanjutnya adalah memasukkan sampel yang telah ditambahkan dengan bufer Laemmli (Tris HCl, bromopenol biru, gliserol, dan SDS) dan telah didenaturasi pada temperature 100 o C selama 5 menit ke dalam sumur gel. Pemisahan dilakukan dengan tegangan 90 volt selama 2.5 jam. Protein yang telah terpisah dalam gel kemudian diwarnai menggunakan coomasie blue selama satu malam, dilanjutkan dengan destaining menggunakan akuadestilata selama 1 jam. Gel poliakrilamid kemudian divisualisasi dengan kamera. Analisis ekspresi protein permukaaan dengan manik magnet Analisis ini menggunakan interaksi antara manik magnet Pure ProteomeTM Nickel Magnetic Beads (Milipore, USA) dengan protein target yang memilliki protein His di permukaan sel khamir. Sebelum digunakan untuk mengikat sel P. pastoris transforman, manik magnet dibersihkan terlebih dahulu. Sebanyak 25 μl suspensi manik magnet dimasukkan ke dalam tube 1.5 ml. Tube diletakkan pada

33 magnetic stand agar manik magnet terkumpul dan bufer dapat dibuang dengan cara dipipet. Selanjutnya, manik magnet diresuspensi dengan 100 μl bufer binding dan diinkubasi selama 1 menit di temperatur ruang. Untuk menghilangkan cairan bufer binding, tube diletakkan pada magnetic stand dan bufer dibuang dengan cara dipipet. Proses pembersihan ini dilakukan sebanyak dua kali. Setelah manik magnet bersih, 20 μl manik magnet dicampurkan dengan 20 μl sel P. pastoris transforman dan diinkubasi dengan agitasi rendah selama 1 jam pada temperatur ruang. Sel P. pastoris transforman yang digunakan dalam proses ini merupakan sel yang telah diinduksi dengan metanol dan telah dibersihkan dengan bufer A yang mengandung 1 mm PMSF sebanyak tiga kali. Untuk memisahkan manik magnet dan suspensi sel yang tidak terikat dari manik magnet, tube diletakkan pada magnetic stand dan suspensi sel dipipet keluar. Selanjutnya, manik magnet diresuspensi dengan 100 μl bufer binding dan diinkubasi selama 1 menit di temperatur ruang. Proses ini dilakukan untuk membersihkan manik magnet dari sel yang tidak terikat dan dilakukan sebanyak tiga kali. Manik magnet disuspensi dengan 20 μl bufer TBS dan diamati di bawah Zeiss Axio Imager.Z2 (Zeiss, Jerman). 17 Gambar 10 Analisis protein permukaan menggunakan manik magnet

34 18 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Subkloning Gen araa ke dalam Vektor Ekspresi Gen araa yang digunakan dalam penelitian ini merupakan penyandi enzim L-AI berasal dari isolat G. stearothermophilus yang diisolasi dari Tanjung Api, Poso, Indonesia. Enzim L-AI dapat mengisomerisasi D-galaktosa menjadi D- tagatosa. Sebagai gula rendah kalori, D-tagatosa dapat digunakan sebagai pemanis pengganti sukrosa. Secara umum proses isomerisasi berjalan pada temperatur tinggi, oleh kerena itu digunakan gen penyandi L-AI yang berasal dari bakteri termofilik G. stearothermophilus. Isomerisasi pada temperatur tinggi memiliki beberapa kelebihan, yaitu hasil atau produk konversi yang lebih tinggi, laju reaksi cepat, dan viskositas substrat rendah (Liu et al. 1996). Pada studi sebelumnya, L- AI yang berasal dari G. stearothermophilus (GSAI) sangat sesuai untuk memproduksi D-tagatosa pada skala besar karena memiliki tingkat konversi D- tagatosa yang tinggi (Kim et al. 2003; Ryu et al. 2003). Gen araa dari G. stearothermophilus sebelumnya telah diisolasi dan diklon di dalam plasmid pet- 21b. Hasil isolasi plasmid pet21b yang mengandung gen araa dapat dilihat pada Gambar 11. Isolasi gen araa selanjutnya telah dilakukan dengan teknik PCR, yaitu dengan mengamplifikasi gen araa pada pet-21b-araa menggunakan pasangan susunan primer spesifik PPAI-F dan PPAI-R (Gambar 12). Gambar 11 Hasil isolasi plasmid pet-21b-araa Amplifikasi gen dengan cara PCR membutuhkan sepasang primer yang sesuai. Susunan basa primer (primer forward dan reverse) didesain berdasarkan urutan nukleotida gen yang akan diamplifikasi dan urutan sisi pengenalan enzim restriksi yang terdapat pada multiple cloning site (MCS) dari vektor ekspresi yang digunakan (Sambrook dan Russel 2001). Pada primer PPAI-F ditambahkan situs pemotongan SalI dan polihistidin (tag His), sedangkan pada primer PPAI-R ditambahkan situs pemotongan Kpn2I. Penambahan situs restriksi dimaksudkan untuk mempermudah proses subkloning gen ke dalam pj912-agα. Pemilihan situs restriksi yang berbeda pada posisi yang berbeda dimaksudkan untuk kloning yang efisien dan menghindari orientasi yang tidak benar dari DNA insert yang terklon. Setiap situs yang dipilih memiliki sekuen nukleotida yang overlap antara gen araa dan vektor pj912-agα. Hal ini diperlukan untuk membatasi adanya nukleotida tambahan dalam konstruksi yang didesain yang dapat mempengaruhi fungsionalitas protein yang diekspresikan.

35 19 Gambar 12 Skema amplifikasi PCR dan pemotongan gen araa Hasil PCR gen target selanjutnya telah dipotong menggunakan enzim restriksi SalI dan Kpn2I. Hasil analisis dengan elektroforesis gel agarosa terhadap hasil pemotongan tersebut menunjukkan adanya pita tunggal berukuran 1515 pb yang sesuai dengan ukuran gen target yang diharapkan (Gambar 12). Gambar 13 Hasil analisis elektroforesis gel agarosa terhadap hasil isolasi gen target. Keterangan: M= Marker 1 kb, 1= produk PCR gen araa, 2= purifikasi hasil PCR gen araa, 3= pemotongan dengan enzim SalI, 4= Pemotongan dengan enzim Kpn2I, 5= Pemotongan dengan enzim SalI-Kpn2I, 6= purifikasi hasil pemotongan dengan enzim SalI-Kpn2I Plasmid pj912-agα merupakan vektor ekspresi yang memiliki perangkat gen yang penting untuk mengekspresikan protein target, yaitu promotor alkohol oksidase 1 (P AOX1 ) sebagai promotor terinduksi metanol, gen MF-α (mating factor-α) sebagai gen penyandi sinyal peptida yang dapat mensekresikan protein

36 20 keluar sel, gen She ble sebagai gen penyandi resisten terhadap antibiotik zeocin yang digunakan sebagai marker selektif untuk transforman, puc ORI sebagai titik awal replikasi pada E.coli, dan gen AGα1 yang merupakan gen penyandi ujung C dari α-agglutinin yang berfungsi sebagai protein penahan pada permukaan sel khamir. Gambar 14 Skema pemotongan plasmid pj912-agα dengan enzim restriksi SalI dan Kpn2I Plasmid pj912-agα telah diperbanyak di dalam sel E. coli DH5α dan diperoleh dengan cara isolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep KIT (Qiagen). Plasmid hasil isolasi tersebut kemudian dipotong menggunakan enzim restriksi SalI dan Kpn2I. Hasil pemotongan dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa dan menunjukkan adanya pita berukuran 4813 pb dan 750 pb sesuai dengan ukuran plasmid linier teoritis (Gambar 15). Gambar 15 Visualisasi hasil isolasi plasmid pj912-agα dan pemotongan menggunakan enzim restriksi. Keterangan : M= Marker 1 kb, 1= hasil isolasi plasmid pj912-agα, 2= pj912-agα dipotong dengan enzim SalI, 3= pj912-agα dipotong dengan enzim SalI dan dipurifikasi, 4= pj912-agα dipotong dengan enzim Kpn2I, 5= pj912-agα dipotong dengan enzim Kpn2I dan dipurifikasi, 6= pj912-agα dipotong dengan enzim SalI-Kpn2I. Vektor rekombinan telah diperoleh melalui proses ligasi gen araa dengan vektor pj912-agα menggunakan enzim ligase. Enzim ligase berfungsi untuk mensintesis pembentukkan ikatan fosfodiester yang menghubungkan antar nukleotida sehingga diperoleh vektor rekombinan. Struktur vektor rekombinan dapat dilihat pada Gambar 16.

37 21 Gambar 16 Vektor rekombinan pj912-agα-araa Selanjutnya vektor rekombinan telah diintroduksikan kedalam E.coli DH5α dengan metode kejut panas (heat shock) dan telah ditumbuhkan dalam media seleksi LSLB agar yang mengandung antibiotik zeocin 25 μg/ml. Banyak faktor yang mempengaruhi efisiensi transformasi, diantaranya kondisi inkubasi, konsentrasi vektor rekombinan, kondisi relatif sel kompeten dan kehadiran DNA kontaminan (Classen et al. 2002). Dari hasil transformasi diperoleh sebanyak 25 koloni yang diduga membawa vektor rekombinan (Gambar 17). Gambar 17 Koloni hasil transformasi pada E. coli DH5α. Keterangan: A= pj912- AGα, B= pj912-agα-araa, C= sel kompeten E. coli DH5α pada medium dengan zeocin, D= sel kompeten E. coli DH5α pada medium tanpa zeocin Koloni E.coli yang diduga membawa vektor rekombinan telah diverifikasi dengan isolasi vektor rekombinan, PCR vektor rekombinan, analisis pemotongan menggunakan enzim restriksi dan analisis sekuen DNA. Terlebih dahulu vektor rekombinan telah diperbanyak di dalam sel E. coli DH5α dan kemudian diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Hasil isolasi vektor rekombinan pj912-agα-araa dapat dilihat pada Gambar 18.

38 22 Gambar 18 Hasil isolasi vektor rekombinan pj912-agα-araa. Keterangan: M= Marker 1 kb, 1 dan 2= vektor rekombinan pj912-agα-araa PCR vektor digunakan untuk memastikan keberadaan sisipan gen di dalam vektor pj912-agα. PCR vektor rekombinan dilakukan menggunakan pasangan primer AOX1-F dan AOX1-R (Gambar 19). Gambar 19 Skema amplifikasi PCR vektor rekombinan pj912-agα-araa menggunakan primer AOX-F dan AOX-R Hasil analisis pada gel agarosa menunjukkan dari 3 koloni yang diverifikasi diperoleh dua koloni yang positif mengandung vektor rekombinan dtunjukkan dengan diperolehnya pita DNA berukuran sekitar 2924 pb (Gambar 20). Tidak semua koloni yang diverifikasi mengandung vektor rekombinan, hal tersebut dapat disebabkan oleh beberapa faktor yang berkaitan dengan proses ligasi. Faktor efisiensi ligasi turut mempengaruhi keberhasilan insersi gen ke dalam vektor Proses ligasi akan memberikan hasil yang optimal apabila seluruh komponen yang terlibat dalam proses ligasi berada dalam kondisi yang optimum. Komponen ligasi yang penting adalah DNA vektor, DNA gen sisipan dan enzim ligase. Perbandingan antara DNA vektor dan DNA gen sisipan akan sangat menentukan keberhasilan proses ligasi. Perbandingan yang tidak tepat antara DNA vektor dengan DNA gen sisipan akan membuat komponen tersebut tidak akan mengalami ligasi yang diharapkan, yaitu antara DNA vektor dengan DNA gen sisipan. Konsentrasi enzim ligase dan waktu inkubasi juga mempengaruhi keberhasilan ligasi. Temperatur yang tidak tepat akan menyebabkan menurunnya aktivitas enzim sehingga proses ligasi tidak akan optimal. Demikian juga dengan konsentrasi enzim ligase. Selain itu, faktor efisiensi ligasi dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor seperti posisi situs restriksi, jenis situs restriksi dan urutannya, dan jenis enzim yang memotong situs restriksi (Dhesi, 2005). Berbagai jenis enzim restriksi telah diteliti untuk menentukan pengaruh konten nukleotida G-C dan /

39 atau panjang nukleotida yang menggantung yang mungkin menjadi faktor dalam ligasi oleh T4 DNA ligase. Bola (2005) menyatakan bahwa ujung kohesif yang kaya nukleotida G-C memiliki efisiensi ligasi lebih tinggi jika dibandingkan dengan ujung kohesif lainnya. Efisiensi ligasi ujung kohesif yang mengandung nukleotida A, T, G, C akan lebih tinggi jika memiliki ujung yang menggantung lebih panjang dibandingkan ujung kohesif dengan nukleotida yang menggantung sedikit. Ujung kohesif kaya nuleotida A-T akan memiliki efisiensi ligasi yang lebih rendah. 23 Gambar 20 Hasil amplifikasi vektor rekombinan pj912-agα-araa dengan menggunakan primer AOX-F dan AOX-R. Keterangan: M= Marker O gene ruler 1 kb plus, 1-3= sampel plasmid transforman, 4= pet- 21b-araA, dan 5= ddh 2 O Hasil analisis restriksi dengan digesti tunggal maupun digesti ganda menggunakan enzim rekstriksi SalI dan NcoI (Gambar 22) dilakukan untuk memastikan keberadaan sisipan gen araa pada vektor rekombinan. Hasil digesti tunggal menggunakan enzim SalI dan NcoI menunjukkan pita tunggal yang berukuran sekitar 6334 pb, dan hasil digesti ganda menggunakan kedua enzim tersebut menghasilkan dua pita yang berukuran masing-masing 3412 pb dan 2922 pb. Hal itu sesuai dengan ukuran plasmid rekombinan yang diharapkan (Gambar 21). Gambar 21 Skema pemotongan vektor rekombinan pj912-agα-araa dengan enzim restriksi SalI dan NcoI Lebih lanjut, hasil tersebut didukung oleh hasil analisis sekuensing yang menunjukkan gen target yang benar sesuai dengan sekuen pj912-agα-araa yang didesain (Lampiran 6). Dari hasil sekuensing, tidak ditemukan adanya mutasi pada vektor rekombinan. Penggunaan DNA polimerisasi yang memiliki akurasi tinggi dapat menghindari terjadinya mutasi pada proses replikasi. Ketelitian DNA

40 24 polymerase pada saat replikasi DNA didapatkan karena adanya proses pemeriksaan secara akurat setiap nukleotida yang disintesis. Gambar 22 Hasil analisis restriksi pj912-agα-araa. Keterangan: M= Marker O gene ruler 1 kb plus, 2= pj912-agα-araa dipotong dengan enzim SalI-NcoI, 3= pj912-agα-araa dipotong dengan enzim SalI, 3= pj912-agα-araa dipotong dengan enzim NcoI, dan 4= pj912-agαaraa tidak dipotong Introduksi P. pastoris dengan Vektor Rekombinan P. pastoris yang digunakan dalam proses transformasi ini adalah P. pastoris GS115 yang memiliki genotip his4 serta fenotip Mut +. Konstruksi plasmid rekombinan pj912-agα-araa telah berhasil diintroduksikan ke dalam genom P. pastoris GS115. Vektor rekombinan menyisip ke dalam genom P. pastoris melalui mekanisme rekombinasi homologus dengan memanfaatkan kesamaan sekuen P AOXI yang terdapat pada genom P. pastoris dan vektor pj912-agα (Cregg 2007). Proses integrasi diawali dengan dipotongnya vektor ekspresi menggunakan enzim SacI pada bagian promotor AOX1. Selanjutnya DNA vektor yang berbentuk linier menstimulasi terjadinya rekombinasi homologus di lokus yang terpotong melalui peristiwa pindah silang tunggal. Fragmen DNA linier yang dihasilkan mengandung cassette ekspresi dan gen penanda resistensi zeocin yang diapit oleh 5' dan 3' AOX1. Kondisi ini merangsang terjadinya pergantian gen pada AOX1 genom sehingga menyebabkan gen AOX1 digantikan oleh cassette ekspresi beserta gen penanda resistensi zeocin (Li et al. 2007). Oleh karena itu, sebelum proses transformasi dilakukan vektor rekombinan dipotong terlebih dahulu menggunakan enzim restriksi SacI (Gambar 23). Proses linierisasi vektor rekombinan merupakan salah satu hal penting dalam proses transformasi P. pastoris karena proses linierisasi vektor rekombinan dapat menstimulasi rekombinasi ketika vektor ditransformasikan ke dalam genom P. pastoris (Invitrogen 2001).

41 25 Gambar 23 Hasil analisis restriksi pj912-agα-araa dengan enzim SacI. M= marker O gene ruler 1 kb plus, 1= sampel vektor rekombinan dipotong dengan SacI, 2= vektor rekombinan yang tidak dipotong Vektor ekspresi pj912-agα dirancang untuk berintegrasi ke dalam genom P. pastoris sehingga memungkinkan ekspresi protein yang stabil, namun efisiensi transformasi akan menjadi sangat rendah. Efisiensi transformasi P.pastoris menjadi sangat rendah karena vektor tidak hanya masuk ke dalam sel inang, tetapi juga harus berintegrasi ke dalam genom sel inang. Efisiensi transformasi yang rendah biasanya terjadi karena situs integrasi yang tidak efisien, DNA sisipan yang sulit dan kondisi transformasi yang tidak optimal. Konsentrasi dan jumlah DNA, kepadatan sel kompeten, situs integrasi vektor dalam genom P. pastoris, dan kondisi elektroporasi seperti voltase, kapasitas dan resistan pada saat transformasi, mempengaruhi tingkat efisiensi transformasi pada P. pastoris (Wu dan Letchworth 2004). Gambar 24 Integrasi vektor reokombinan pada genom P. pastoris (Invitogen 2002) Transformasi ke dalam sel P. pastoris menggunakan metode elektroporasi. Prinsip metode elektroporasi adalah menggunakan kejutan listrik untuk memperbesar pori-pori membran sel sehingga meningkatkan permeabilitas membran. Sinyal listrik akan menginduksi pembesaran pori-pori membran sehingga molekul DNA dapat masuk ke dalam sel (Invitrogen, 2001). Setelah dielektroporasi kultur P. pastoris ditumbuhkan pada medium yang mengandung

42 26 antibiotik zeocin 100 μg/ml karena vektor ekspresi yang digunakan dirancang mengandung gen She ble dari Streptoalloteichus hindustanus yang merupakan gen penyandi resisten terhadap antibiotik zeocin. Mekanisme kerja dari zeocin dalam menyeleksi koloni-koloni yang mengandung vektor rekombinan adalah sebagai berikut: zeocin mengandung kelat tembaga (Cu) yang jika tidak digunakan berada dalam bentuk non aktif. Ketika antibiotik masuk ke dalam sel, kation tembaga direduksi dari Cu 2+ menjadi Cu + dan dipindahkan oleh senyawa sulfhydryl yang terdapat di dalam sel. Selama pemindahan tembaga zeocin menjadi aktif dan akan berikatan dengan DNA dan merusaknya, sehingga menyebabkan kematian sel (Invitrogen 2001). Pada penelitian ini diperoleh 107 koloni P. pastoris transforman dan tidak ada koloni non transforman yang dapat tumbuh pada medium mengandung zeocin 100 μg/ml (Gambar 25). Keseluruhan koloni transforman yang tumbuh merupakan hasil transformasi menggunakan 5 μg vektor rekombinan per reaksi transformasi sesuai dengan jumlah plasmid yang disarankan untuk memperoleh hasil yang baik. Dengan jumlah DNA 5-10 μg disebutkan dapat diperoleh sedikitnya sampai koloni transforman dengan kondisi transformasi yang optimal (Invitrogen 2008). Gambar 25 Sel P. pastoris hasil transformasi. Keterangan: A= P. pastoris GS115 dengan pj912-agα-araa pada media YPDS dengan zeocin 100 μg/ml. B= P. pastoris GS115 pada media YPDS tanpa zeocin. C= P. pastoris GS115 pada media YPDS dengan zeocin 100 μg/ml Seleksi Transforman P. pastoris Analisis gen araa pada genom diperlukan untuk membuktikan bahwa gen taret telah terintegrasi ke dalam genom P. pastoris. Selanjutnya dilakukan PCR koloni terhadap koloni transforman menggunakan primer spesifik gen target PPAI-F dan PPAI-R untuk memastikan keberadaan sisipan gen araa di dalam genom P. pastoris (Gambar 26). Hasil analisis pada gel agarosa menunjukkan bahwa 1 dari 3 koloni yang diverifikasi mengandung sisipan sesuai dengan ukuran gen target araa dengan pita DNA berukuran sekitar 1521 pb (Gambar 27). Sedangkan P. pastoris non transforman tidak menghasilkan pita DNA berukuran 1521 pb, hal itu disebabkan karena tidak ada vektor ekspresi yang diintegrasikan ke dalam genom. Tidak semua koloni transforman yang dianalisis menghasilkan pita DNA gen target, hal itu dapat disebabkan oleh terjadinya gene loss pada genom sel khamir transforman selama proses regenerasi sehingga membuat tidak

43 keseluruhan vektor rekombinan yang diintroduksikan terintegrasi ke dalam genom P. pastoris. Fenomena gene loss dapat terjadi ketika proses perbanyakan sel dan duplikasi genom (Lin et al. 2014). 27 Gambar 26 Skema amplifikasi PCR vektor rekombinan pj912-agα-araa menggunakan primer PPAI-F dan PPAI-R Gambar 27 Hasil PCR koloni P. pastoris transforman dengan menggunakan primer PPAI-F dan PPAI-R. Keterangan: M= Marker O gene ruler 1 kb plus, 1-3= Sampel koloni P. pastoris transforman, 4= Kontrol negatif, 5= Kontrol positif Ekspresi Protein Rekombinan Ekspresi protein rekombinan dilakukan menggunakan sistem ekspresi P. pastoris. P. pastoris memiliki kelebihan sebagai sistem ekspresi terutama kemudahan dalam hal manipulasi pada tingkat molekuler, modifikasi pasca translasi, pelipatan protein, dan sekresi protein secara ekstraseluler (Cereghino dan Cregg 2000). Proses produksi yang mudah, peralatan produksi yang relatif murah, dan kemudahan dalam proses scale up membuat sistem ekspresi P. pastoris lebih diminati untuk memproduksi protein rekombinan (Balamurugan et al. 2007). Proses scale up membuat sistem ekspresi P. pastoris dapat lebih besar dibandingkan sistem ekspresi E. coli (Vozza et al. 1996). Sistem ekspresi pada beberapa kasus dapat mengekspresikan protein rekombinan lebih tinggi dibandingkan sistem ekspresi khamir konvensional menggunakan S. cerevisiae (Fickers 2014).

44 28 Sistem ekspresi menggunakan khamir P. pastoris diawali dengan peningkatan biomassa khamir kemudian dilanjutkan dengan sistem induksi ekspresi L-AI. Peningkatan biomassa P. pastoris dilakukan pada media BMGY. Media BMGY mengandung gliserol yang merupakan sumber karbon. Gliserol bersifat represi terhadap kerja P AOX1 sehingga aliran karbon hanya akan digunakan untuk peningkatan biomassa sel (Cereghino dan Cregg 2000; Fickers 2014). Tahap selanjutnya adalah sistem induksi ekpresi protein L-AI pada media BMMY yang mengandung metanol sebagai sumber karbon. P. pastoris merupakan khamir metilotropik yang menggunakan metanol sebagai sumber karbon dan energi (Krainer et al. 2012). Ekspresi protein rekombinan dilakukan dengan menambahkan metanol pada media pertumbuhan. Penambahan metanol dimaksudkan untuk mengingkatkan hasil ekspresi protein rekombinan karena promotor yang digunakan untuk ekspresi protein rekombinan adalah alkohol oksidase 1 (P AOX1 ) yang akan tertekan ketika P. pastoris tumbuh dalam media yang mengandung glukosa atau gliserol, tapi akan terinduksi kuat pada media metanol (Cereghino et al. 2002). Namun, konsentrasi metanol yang terlalu tinggi bersifat toksik dan dapat menghambat pertumbuhan P. pastoris sedangkan konsentrasi metanol yang rendah tidak mampu menginisiasi proses transkripsi, sehingga penambahan mentanol ke dalam media ekspresi menentukan efisiensi produksi protein rekombinan (Poutou- Pinales et al. 2010). Protein yang telah diekspresikan dianalisis menggunakan teknik immunofluorescence dan SDS-PAGE. SDS-PAGE dapat memberikan informasi tentang ukuran (bobot molekul) dari protein dengan cara membandingkan pita yang dihasilkan dengan ukuran marker dalam satuan kilodalton (kda), sedangkan immunofluoresence dapat memberi informasi ekspresi protein rekombinan pada permukaan sel khamir. Sampel yang digunakan dalam analisis SDS-PAGE merupakan sampel protein yang telah diberi perlakuan tanpa dan diinduksi metanol. Sebelumnya P. pastoris yang telah mengekspresikan protein rekombinan diberi perlakukan penambahan enzim selulase untuk memisahkan protein rekombinan dengan debris sel P. pastoris. Protein rekombinan tertambat pada permukaan sel P. pastoris dengan bantuan protein permukaan α-agglutinin sebagai jangkar protein. α-agglutinin sebagai mannoprotein permukaan dapat melekat pada dinding sel melalui ikatan kovalen dengan polisakarida penyusun dinding sel yaitu β-1,6-glukan. Pada ujung C α-agglutinin terdapat modifikasi GPI dan terdapat banyak situs glikosilasi. GPI termodifikasi berikatan kovalen dengan β-1,6-glukan dan membantu menahan protein pada dinding sel (Gambar 28). Gambar 28 Struktur bagian permukaan sel P. pastoris rekombinan

45 29 Proses ekstraksi protein target yang berikatan dengan α-agglutinin dilakukan melalui reaksi enzimatik untuk mendegradasi rantai glukan pada dinding sel. Ctec2 merupakan selulase kompleks yang mengandung enzim selulase, β- glukosidase dan hemiselulase. Selulase kompleks ini akan memotong rantai glukan melalui mekanisme hidrolisis sehingga protein α-agglutinin yang berikatan dengan protein target dapat diekstraksi dari dinding sel P. pastoris (Gambar 29). Selanjutnya proses pemisahan dilakukan dengan cara sentrifugasi untuk memisahkan antara debris sel P. pastoris dengan supernatan yang mengandung protein rekombinan. Supernatan hasil ekstraksi kemudian di pekatkan menggunakan pelarut aseton dan diinkubasi pada suhu 20 o C. Kelarutan protein tergantung pada konstanta dielektrik larutan. Secara umum, molekul pelarut dengan konstanta elektrik yang besar, misalnya air dapat menstabilkan interaksi antara protein dengan molekul pelarutnya yaitu air sehingga protein larut. Namun, aseton yang merupakan pelarut organik yang memiliki konstanta dielektrik yang rendah dapat mencegah dispersi molekul protein dalam media. Dengan demikian, kelarutan protein dapat diturunkan dan presipitasi dapat diinduksi dengan menurunkan konstanta dielektrik efektif dari media. Penggunaan aseton memiliki kelebihan antara lain pelarut aseton relatif murah dan tersedia dalam bentuk murni (Simpson dan Beynon 2010). Gambar 29 Ekstraksi protein target dari dinding sel P. pastoris rekombinan dengan menggunakan enzim selulase Hasil visualisasi pita SDS-PAGE menunjukkan adanya pita protein berukuran sekitar 91 kda (Gambar 30), sedangkan protein native L-AI adalah 56.7 kda. Perbedaan bobot molekul tersebut disebabkan adanya penambahan fragmen tag His yang terletak pada ujung C-terminal serta fragmen tag Flag dan α-agglutinin pada bagian N-terminal araa. Fragmen tag His membantu proses deteksi dan purifikasi protein rekombinan. Fragmen tag Flag dapat membantu proses purifikasi karena mengandung situs potong enzim enterokinase. Fragmen α-aggllutinin berperan dalam pengikatan protein rekombinan pada permukaan sel khamir P. pastoris. Berat molekul protein rekombian sebesar 91.4 kda diperoleh melalui konversi asam amino menjadi berat molekul protein menggunakan program expasy. Nilai yang tidak jauh berbeda diperoleh jika perhitungan dilakukan secara manual dengan mengkalikan keseluruhan jumlah asam amino dari protein rekombinan dengan berat molekul asam amino rata-rata yaitu 110 Da

46 30 (Nelson dan Cox 2013). Berdasarkan perhitungan manual akan diperoleh protein rekombinan dengan berat molekul berkisar 91.6 kda. Gambar 30 Visualisasi SDS-PAGE supernatan protein rekombinan bebas sel. Keterangan: M=Marker protein, 1= Sampel ekstrak P. pastoris rekombinan tanpa induksi, 2= Sampel ekstrak P. pastoris rekombinan diinduksi metanol 1.0% Uji ekspresi protein rekombinan di permukaan sel khamir dengan teknik Immunofluorescene menggunakan antibodi spesifik FITC-conjugated rabbit polyclonal antibody to His6. Senyawa FITC (Fluorescein isothiocyanate) merupakan senyawa fluoresence yang difusikan dengan antibodi antihis yang akan berikatan dengan protein His yang ada dipermukaan sel khamir, dan senyawa FITC akan menghasilkan pendaran berwarna hijau dibawah paparan sinar UV. Dengan demikian sel yang menghasilkan pendaran berwarna hijau pada permukaan sel menunjukkan protein rekombinan yang membawa protein tag His terekspresi di permukaan sel dan sel yang tidak mengekspresikan protein tag His tidak akan menghasilkan pendaran berwarna hijau. Protein tag His yang berpendar jika berinteraksi dengan antibodi anti-his yang membawa senyawa FITC digunakan sebagai protein penanda ekspresi protein rekombinan karena hasilnya dapat diamati secara visual menggunakan mikroskop fluoresence. Pendaran yang dihasikan dapat menunjukkan ekspresi, lokalisasi, translokasi, interaksi antar protein, atau degradasi dari protein fusi (Chudakov et al. 2010). Hasil immunofluorescence ekspresi protein L-AI menunjukkan bahwa sel P. pastoris non rekombinan yang tidak mengekspresikan protein rekombinan tidak menghasilan pendaran berwarna hijau di bawah paparan sinar UV (Gambar 31 dan 31B). Sedangkan sel P. pastoris rekombinan yang mengekespresikan protein rekombinan meghasilkan pendaran berwarana hijau pada permukaan selnya (Gambar 31C dan 31D). Selain itu diperoleh juga sel P. pastoris rekombinan yang berpendar tidak hanya pada permukaannya melainkan pada bagian dalam sel juga menghasilkan pendaran berwarna hijau, hal itu dapat disebabkan oleh antibodi yang beriakatan dengan protein His lainnya yang ada di dalam sel (unspesific binding). Oleh karena itu dilakukan verifikasi lebih lanjut untuk menyakinkan bahwa sel yang berpendar merupakan sel rekombinan yang mengekspresikan protein target bukan hanya reaksi ikatan tidak spesifik antara antibodi dengan

47 protein lain pada sel. Analisis lebih lanjut menggunakan analisis manik magnet yang mengandung Ni Gambar 31 Analisis immunofluorescence menggunakan mikroskop fluorescence. Fase kontras (kiri). Fase fluoresence (kanan). A dan B= P. pastoris non rekombinan; C dan D= P. pastoris rekombinan Analisis ekspresi menggunakan bantuan Pure ProteomeTM Nickel Magnetic Beads dilakukan untuk memverifikasi uji immunofluorescence sebelumnya, karena uji ini lebih spesifik terhadap protein yang diekspresikan pada bagian permukaan sel khamir. Uji analisis menggunakan manik magnet yang dilapisi ion logam Ni 2+ didasarkan pada sifat afinitas dari protein tag dan ion logam. Teknik ini diaplikasikan juga dalam proses purifikasi protein yang disebut sebagai Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). IMAC merupakan teknik pemisahan protein menggunakan senyawa pengkelat yang terikat secara kovalen pada zat padat pendukung kromatografi dan zat padat ini dapat mengikat ion. Prinsip teknik ini adalah interaksi reversibel antara beberapa rantai samping asam amino dan immobilized ion metal. Gambar 32 Struktur kimia Histidin

48 32 Dalam penelitian ini protein rekombinan L-AI difusikan dengan protein tag His pada bagian C-terminal. Histidin memiliki rantai samping berupa cincin imidazole (Gambar 32). Keberadaan tag His dapat memfasilitasi proses pemurnian protein berdasarkan afinitas selektif antara polihistidin tersebut terhadap adsorben yang dilengkapi pengkelat logam seperti Ni 2+. Ni 2+ dianggap sebagai ion logam yang memiliki afinitas paling kuat terhadap protein tag His. Ikatan yang terbentuk antara protein tag His dengan ion logam nikel adalah ikatan kovalen koordinasi, dimana ion Ni 2+ akan memberikan elektronnya terhadap gugus N yang terdapat pada cincin imidazole di protein tag His sehingga akan terjadi ikatan kovalen koordinasi diantara ion nikel dan protein His (Gambar 33). Pada protein histidin, situs aktif berada pada bagian cincin imidazole. Cincin imidazole bersifat nukleofilik (cenderung bermuatan negatif), sehingga akan berinteraksi dengan ion logam nikel yang bermuatan positif. Gambar 33 Skema pengikatan gugus N cincin imidazole pada protein His Tag dengan ion logam Ni 2+ yang menempel pada manik magnet Interaksi antara residu histidin dengan ion logam bersifat reversibel dan protein yang terikat dapat dielusi menggunakan larutan imidazole atau dengan menurunkan ph larutan. Protein tag His memiliki afinitas yang tinggi terhadap Ni 2+, akibatnya protein yang mengandung tag His akan secara selektif terikat kepada media yang mengandung ion logam Ni 2+. Sehingga sel yang mengekspresikan protein tag His di permukaan sel akan melekat pada manik magnet yang terlapis ion Ni 2+. Penggunaan manik magnet juga dimaksudkan untuk mengumpulkan dan memisahkan antara sel rekombinan yang mengekspresikan protein dengan yang tidak mengekpresikan protein rekombinan. Kekuatan mengikat antara protein dan ion logam dipengaruhi oleh beberapa faktor, termasuk struktur dan karakteristik protein target, sifat dari tag protein afinitas, sifat-sifat ion logam, ph, dan komposisi bufer binding. Analisis dilakukan dengan mencampurkan sel P. pastoris rekombinan dan non rekombinan dengan manik magnet yang dilapisi ion logam Ni 2+ di bagian permukaannya dan selanjutnya di analisis kembali menggunakan immunofluorescence. Pada gambar 34A dan 34B terlihat bahwa manik magnet tidak menempel satu sama lain dan tidak ada sel P. pastoris yang melekat pada permukaan manik magnet lalu ketika dianalisis menggunakan immunofluorescence tidak menghasikan pendaran berwarna hijau. Hal tersebut karena sel P. pastoris tersebut tidak mengekspresikan protein rekombinan L-AI

49 yang berfusi dengan protein tag His sehingga tidak akan terjadi ikatan kovalen koordinasi antara sel P. pastoris dengan manik magnet. Sel yang tidak menempel akan terbawa pada proses pencucian menggunakan bufer binding. Berbeda dengan gambar 34C dan 34D yang memperlihatkan adanya sel P. pastoris yang melekat pada permukaan manik magnet dan banyak manik magnet yang menempel menjadi satu serta menghasilkan pendaran berwarna hijau dibawah paparan sinar UV. Sel P. pastoris rekombinan dapat menempel pada manik magnet karena adanya gaya tarik menarik antara protein tag His yang ada di permukaan sel dan ion logam Ni 2+ pada permukaan manik magnet sehingga membentuk ikatan kovalen koordinasi. Sedangkan manik magnet yang menggumpal dan menempel satu sama lain terjadi karena sel P. pastoris yang mengekspresikan protein tag His pada pemukaan selnya dapat menempel pada satu atau lebih manik magnet yang mengandung Ni 2+. Selanjutnya pendaran berwarna hijau yang dihasilkan oleh sel yang menempel pada permukaan manik magnet dikarenakan protein tag His berikatan dengan antibodi spesifik FITC-conjugated rabbit polyclonal antibody to His6 dan membuat senyawa FITC yang menempel di bagian permukaan sel berpendar jika terpapar sinar UV. Hasil tersebut menyakinkan bahwa sel tersebut benar mengekspresikan protein rekombinan pada bagian permukaan sel P. pastoris. 33 Gambar 34 Analisis mikroskopis interaksi antara sel, manik magnet dan antibodi fluoresence pada fase kontras (kiri) dan pada fase fluoresence (kanan). Keterangan: A-B= sel P. pastoris non-rekombinan, dan C- D= P. pastoris rekombinan

50 34 5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Vektor rekombinan pj912-agα-araa telah berhasil dikonstruksi dan berhasil ditransformasi dan terintegrasi ke dalam genom P. pastoris. Protein rekombinan berhasil diekspresikan oleh sel P. pastoris GS115 yang ditunjukkan dengan adanya pita protein target berukuran 91 kda pada analisis SDS-PAGE, adanya pendaran berwarna hijau di permukaan sel pada analisis immunofluoresence, serta keberadaan sel P. pastoris rekombinan yang menempel pada analisis menggunakan manik magnet yang mengandung Ni 2+. Protein L-AI berhasil diekspresikan pada permukaan sel khamir P. pastoris GS115 dengan bantuan jangkar protein permukaan α-agglutinin. Saran Analisis lebih lanjut mengenai konstruksi vektor rekombinan pj912-agαaraa perlu dilakukan, seperti uji karakterisasi dan optimalisasi terhadap protein yang dihasilkan. Serta eksplorasi lebih lanjut mengenai protein-protein lain yang dapat diekspresikan pada permukaan sel khamir menggunakan konstruksi yang ada.

51 35 DAFTAR PUSTAKA Ananphongmanee V, Srisala J, Sritunyalucksana K, BoonchirdC Yeast surface display of two protein previously shown to be protective against white spot syndrome virus (WSSV) in shrimp. PLoS One. 10: e Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (Eds.) Short protocols in molecular biology. 5th Ed. Vol. 2. John Wiley & Sons, Inc. New York, USA. ISBN: Balamurugan V, Reddy GR, Suryanarayana VVS P. pastoris: a notable heterologous expression system for the production of foreign proteinsvaccines. Indian J Biotechnol. 6: Beadle JR, Sauder JP, dan Wajada TJ Process for manufacturing tagatosa. US patent Becker S, Schmoldt HU, Adams TM, Wilhelm S, Kolmar H Ultra-highthroughput screening based on cell-surface display and fluorescenceactivated cell sorting for the identification of novel biocatalysts. Curr Opin Biotechnol. 15: Berlec A, Zadravec P, Jevnikar Z dan Strukelj B Identification of candidate carrier protein for surface display on Lactoococcus lactis by theoretical and experimental analyse of the surface proteome. Applied and Environment Microbiology. 77: Bertelsen H, Andersen H, Tvede M Fermentation of D-tagatosa by human intestinal bacteria and dairy lactic acid bacteria. Microb Ecol Health Dis. 13: Boder ET, Wittrup KD Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 15: Bola G Evaluating the role of G,C-nucleotides and length of overhangs in T4 DNA ligase efficiency. JEMI. 8: 1-7. Bortone N, Fidaleo M Immobilization of the recombinant (His)6-tagged L- arabinose isomerase from Thermotoga maritima on epoxy and cupperchelate epoxy supports. FOOD BIOPROD PROCESS. 95: Buemann B, Toubro S, Astrup A. 1999a. Human gastrointestinal tolerance to D- tagatosa. Regul Toxicol Pharmacol. 29: S71 S77. Buemann B, Toubro S, Raben A, Astrup A. 1999b. Human tolerance to a single, high dose of D-tagatosa. Regul Toxicol Pharmacol. 29: S66-S70. Buemann B, Toubro S, Raben A, Blundell J, Astrup A The acute effect of D-tagatosa on food intake in human subjects. Br J Nutr. 84: Bushell ME, Rowe M, Avignone-Rossa CA, Wardell JN Cyclic fed-batch culture for production of human serum albumin in Pichia pastoris. Biotechnol Bioeng. 82: Cereghino GP, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 13: Cereghino JL dan Cregg JM Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol. 24: Cheetam PS, Wootton AN Bioconversion of D-galactose to D-tagatosa. Enzyme Microb Technol. 15:

52 36 Cheng L, Mu W, dan Jiang B Thermostable L-arabinosa isomerase from Bacillus stearothermophillus IAM for D-tagatosa production: gene cloning, purification and characterization. J Sci Food Agric. 90: Cheng L, Mu W, Zhang T, Jiang B An L-arabinosa isomerase from Acidothermus cellulolytics ATCC 43068: cloning, expression, purification, and characterization. Appl Microbiol Biotechnol. 86: Chiswell DJ, McCafferty J Phage antibodies: will new coliclonal antibodies replace monoclonal antibodies?. Trends Biotechnol. 10: Cho B, Kim JH, Jeon HB, Kim KS A new efficient and practical synthesis of 2-deoxy-L-ribose. Tetrahedron. 61: Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90: Cid VJ, Duran A, Rey FD, Snyde MP, Nombela C, Sanchez M Molecular basis of cell integrity and morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev. 59: Couderec R, Baretti J Oxidation of Methanol by the Yeast, Pichia pastoris. Purification and Properties of the Alcohol Oxidase. Agric Biol Chem. 44: Cregg JM, Tschopp JF, Stillman C, Siegel R, Akong M, Craig WS, Buckholz RG, Madden KR, Kellaris PA, Davis GR, Smiley BL, Cruze J, Torregrossa R, Velicelebi G, Thill GP High-Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia pastoris. Nat Biotech. 5: Cregg JM Editor. Pichia protocol. Second edition. New Jersey. Dai DM. Ji C, Wang X, Zhi X, Shao H, Xu L, Yan Y Cell surface display of Thermomyces lanuginosus lipase in Pichia pastoris and its characterization. Wei Sheng Wu Xue Bao. 52: Daly R, Hearn MTW Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18: Dhesi S Investigation of the relationship between terminal sequence variation and the ligation efficiency of T4 DNA ligase on blunt-ended DNA. JEMI. 8: Donner TW, Wilber JF, Ostrowski D D-Tagatosa, a novel hexose: acute effects on carbohydrate tolerance in subjects with and without type 2 diabetes. Diabetes Obes Metab. 1: Eckart MR, Bussineau CM Quality and authenticity of heterologous proteins synthesized in yeast. Curr Opin Biotechnol. 7: Fickers P Pichia pastoris: a workhorse for recombinant protein production. Curr Res Microbiol Biotechnol. 2: Fitriani D, Saksono B Cloning of araa gene encoding L-arabinosa isomerase from marine Geobacillus stearothermophilus isolated from Tanjung Api, Poso, Indonesia. Hayati Journal of Bioscience. 17: Fleet GH, Manners DJ The enzyme degradation of an alkalisoluble glucan from the cell walls of Saccharomyces cerevisiae. J Gen Microbiol. 98:

53 Fleet GH The Yeast. In: Rose AH, Harrison JS, Eds. Yeast Organelles. 2nd ed. Academic Press: USA. 4: Francisco JA, Stathopoulos C, Warren RA, Kilburn DG, dan Georgiou G Specific adhesion and hydrolysis of cellulose by intact Escherichia coli expressing surface anchored cellulase or cellulose binding domains. Biotechnology (NY). 11: Georgiou G, Stathopoulos C, Daugherty PS, Nayak AR, Iverson BL, Curtiss III R Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat Biotechnol. 15: Hardwick KG, Boothroyd JC, Rudner AD, Pelham HRB Genes that allow yeast cells to grow in the absence of the HDEL receptor. EMBO J. 11: Hirst EL, Hough L, dan Jones JKN Composition of the gum of Stericulia setigera; occurrence of D-Tagatosa in nature. Nature. 163 (4135): 177. Horisberger M, Vonlanthen M Localization of mannan and chitinon thin sections of budding yeasts with gold markers. Arch Microbiol. 115: 1-7. Ibrahim OO, Spradlin JE Process for manufacturing D-tagatosa. US Patent Invitrogen EasySelectTM Pichia Expression Kit. A Manual Methods for Expression of recombinant proteins Using ppicz and ppiczα in Pichia pastoris. Version G. Invitrogen pgapzα A, B, and C pgapzα A, B, and C Pichia expression vectors for constitutive expression and purification of recombinant protein. Invitrogen ppiczα A,B, and C Pichia expression vectors for selection on zeocin and purification of secreted recombinant protein. Version F. Ishida Y, Kamiya T, Itoh H, Kimura Y, Izumori K Cloning and characterization of the D-tagatosa 3-epimerase gene from Pseudomonas cichorii ST-24. J Ferment Bioeng. 83: Itoh H, Okaya H, Khan AR, Tajima S, Hayakawa S, Izumori K Purification and characterization of D-tagatosa 3-epimerase from Pseudomonas sp. ST- 24. Biosci Biotechnol Biochem. 58: Izumori K, Miyoshi T, Tokuda S, Yamabe K Production of D-tagatosa from ducitol by Arthrobacter globiformis. Appl Environ Microbiol. 46: Izumori K, Tsuzaki K Production of D-tagatosa from D-galactitol by Mycobacterium smegmatis. J Ferment Technol. 66: Jahic M, Veide A, Charoenrat T, Teeri T, Enfors SO Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris. Biotechnol Prog. 22: Jiang ZB, Song HT, Gupta N, Ma LX, Wu ZB Cell surface display of functionally active lipases from Yarrowia lipolytica in Pichia pastoris. Protein. Expr. Purif. 56: Jørgensen F, Hancen OC, Stougaard P Enzymatic conversion of D- galactose to D-tagatosa: heterologous expression and characterization of Thermostable L-arabinosa isomerase from Thermoanaerobacter mathranii. Appl Microbiol Biotechnol. 64:

54 38 Jung ES, Kim HJ, Oh DK Tagatosa production by immobilized recombinant Escherichia coli cells containing Geobacillus stearothermophilus L-arabinosa isomerase mutant in a packed-bed bioreactor. Biotechnol Prog. 21: Karabinos JV Psicose, sorbose and tagatosa. Adv Carbohydrate. Chem. 7: Khasa YP, Conrad S, Sengul M, Plautz S, Meagher MM, Tnan M Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast. 28: Kim BC, Lee YH, Lee HS, Lee DW, Choe EA, Pyun YR Cloning, expression and characterization of L-arabinosa isomerase from Thermotoga neapolitana: bioconversion of D-galactose to D-tagatosa using the enzyme. FEMS Microbiol Lett. 212: Kim HJ, Hyun EK, Kim YS, Lee YJ, Oh DK Characterization of an Agrobacterium tumefaciens D-psicose-3-epimerase that converts D-fructose to D-psicose. Appl Environ Microbiol. 72: Kim HJ, Oh DK Purification and characterization of an L-arabinosa isomerase from an isolated strain of Geobacillus thermodenitrificans producing D-tagatosa. J Biotechnol. 120: Kim JH, Prabhu P, Jeya M, Tiwari MK, Moon HJ, Singh RK, Lee JK Characterization of an L-arabinosa isomerase from Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol. 85: Kim JW, Kim YW, Roh HJ, Kim HY, Cha JH, Park KH, Park CS Production of tagatosa by a recombinant thermostable L-arabinosa isomerase from Thermus. sp. IM6501. Biotechnol Lett. 25: Kim P Current studies on biological tagatosa production using L-arabinosa isomerase: a review and future perspective. Appl Microbiol Biotechnol. 65: Kirk RE, Othmer DF Encyclopedia of chemical technologu,4 th ed. The Interscience Encyclopedia Inc., New York. Ko KC, Lee B, Cheong DE, Han Y, Choi JH, Song JJ Bacterial cell surface display of a multifunctional cellulolytic enzyme screened from a bovine rumen metagenomic resource. J. Microbiol. Biotechnol. 25: Kondo A, Ueda M Yeast cell-surface display-applications of molecular display. Appl Microbiol Biotechnol. 64: Krainer FW, Dietzsch C, Hajek T, Herwig C, Spadiut O, Glieder A Recombinant protein expression in Pichia pastoris strains with an engineered methanol utilization pathway. Microbial Cell Factories. 11: 22. Kuroda K, Ueda M Cell surface engineering of yeast for application in white biotechnology. Biotechnol Lett. 33: 1-9. Lærke HN, Jensen BB D-Tagatosa has low small intestinal digestibility but high large intestinal fermentability in pigs. J Nutr. 129: Lee CY, Lee SJ, Jung KH, Katoh S & Lee EK High dissolved oxygen tension enhances heterologous protein expression by recombinant Pichia pastoris. Process Biochem. 38: Lee DW, Choe EA, Kim SB, Eom SH, Hong YH, Lee SJ, Lee HS, Lee DY, Pyun YR. 2005a. Distinct metal dependence for catalytic and structural functions in the L-arabinosa isomerases from the mesophilic Bacillus halodurans and

55 the thermophilic Geobacillus stearothermophilus. Arch Biochem Biophys. 434: Lee DW, Jang HJ, Choe EA, Kim BC, Lee SJ, Kim SB, Hong YH, Pyun YR Characterization of a thermostable L-arabinosa (D-galactose) isomerase from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima. Appl Environ Microbiol. 70: Lee SJ, Lee DW, Choe EA, Hong YH, Kim SB, Kim BC, Pyun YR. 2005b. Characterization of a thermoacidophilic L-arabinosa isomerase from Alicyclobacillus acidocaldarius: role of Lys-269 in ph optimum. Appl Environ Microbiol. 71: Levin GV, Zehner LR, Saunders JP, Beadle JR Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics, and potential health benefits. Am J Clin Nutr. 62: S1161-S1168. Levin GV Tagatosa, the new GRAS sweetener and health product. J Med Food. 5: Li W, Shi H, Ding H, Wang L, Zhang Y, Li X, Wang F Cell surface display and characterization of Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris using Sed1p as an anchor protein. Curr Microbiol. 71: Li Y, Zhu Y, Liu A, Sun Y Identification and characterization of a novel L- arabinosa isomerase from Anoxybacillus flavithermus useful in D-tagatosa production. Extremophiles. 15: Lin Y, Cheng Y, Jin J, Jin X, Jiang H, Yan H, Cheng B Genome Duplication and Gene Loss Affect the Evolution of Heat Shock Transcription Factor Genes in Legumes. PLoS ONE. 9(7):e Lipke PN, Ovalle R Cell Wall Architecture in Yeast: New Structure and New Challenges. J Bacteriol. 180(15): Lipke PN, Wojciechowicz D, Kurjan J AG1 is the structural gene for the Saccharomyces cerevisiae -agglutinin, a cell surface glycoprotein involved in cell-cell interactions during mating. Mol Cell Biol. 9: Little M, Fuchs P, Breitling F, Dubel S Bacterial surface presentation of proteins and peptides: An alternative to phage technology?. Trends Biotechnol. 11: 3-5. Liu S, Wiegel J, Gherardini FC Purification and cloning of a thermostable xylose (glucose) isomerization with an acidic ph optimum from Thermoanaerobacterium strain JW/SLYS 489. J. Bacteriol. 178: Liu Z, Inokuma K, Ho SH, dee Haan R, Hasunuma T, van Zyl WH, Kondo A Combined cell-surface displayand secretion-based strategies for production of cellulosic ethanol with Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Biofuels. 8: Lu Y, Levin GV, dan Donner TW Tagatosa, a new antidiabetic and obesity control drug. Diabetes Obes Metab. 10: Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22: Manners DJ, Masson AJ, Patterson JC The structure of a (1,3)D-glucan from yeast cell walls. Biochem J. 135:

56 40 Manzo RM, de Sousa M, Fenoglio CL, Gonçalves LRB, Mammarella EJ Chemical improvement of chitosan-modified beads for the immobilization of Enterococcus faecium DBFIQ E36 L-arabinose isomerase through multipoint covalent attachment approach. J Ind Microbiol Biotechnol. 42: Manzoni M, Rollini M Bioconversion of D-galactitol to tagatosa by acetic acid bacteria. Process Biochem. 36: Mei W, Wang L, Zang Y, Zheng Z, Ouyang J Characterization of an L- arabinose isomerase from Bacillus coagulans NL01 and its application for D-Tagatosa production. BMC Biotechnology. 16: Mendoza MR, Olano A, dan Villamiel M Chemical indicators of heat treatment in fortified and special milks. J. Agric. Food Chem. 53: Mergler M, Wolf K, Zimmermann M Development of a bisphenol A- adsorbing yeast by surface display of the Kluyveromyces yellow enzyme on Pichia pastoris. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: Michon C, Langella P, Eijsink VGH, Mathiesen G, Chatel JM Review: Display of recombinant protein at the surface of lactic acid bacteria: strategies and application. Microb Cell Fact. 15: Mohamad NR, Marzuki NHC, Buang NA, Huyop F, Wahab RA An overview of technologies for immobilization of enzymes and surface analysis techniques for immobilizied enzymes. Biotechnol. Biotechnol. Equip. 29: Moura MVH, de Silva GP, Machado ACO, Torres FAG, Freire DMG, Almeida RV Displaying Lipase B from Candida antartica in Pichia pastoris using the yeast surface display approach: prospection of a new ancor and characterization of the whole cell biocatalyst. PLoS One. 10: e Muniruzzanman S, Tokunaga H, Izumori K Isolation of Enterobacter agglomerans strain 221e from soil, a potent D-tagatosa producer from galactitol. J Ferment Bioeng. 78: Nakayama Y, Yoshida T, Shibasaki S, Ueda M Cell-wall digesting enzyme-productive bacterium. JP Nelson DL, Cox MM CourseSmart International E-Book for Principles of Biochemistry. New York: Palgrave Macmillan. Ogata K, Nishikawa H, Ohsugi M A yeast capable of utilizing methanol. Agric Biol Chem. 33: Oh DK, Roh HJ, Kim SY, Noh BS Optimization of culture conditions for D-tagatosa production from D-galactose by Enterobacter agglomerans. Kor J Appl Microbiol Biotechnol. 26: Oh DK Tagatosa: properties, application and biotechnological processes. Appl Microbiol Biotechnol. 76: 1-8. Pal Y, Khushoo A, Mukherjee K Process optimization of constitutive human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (hgm-csf) expression in Pichia pastoris fed-batch culture. Appl Microbiol Biotechnol. 69: Pan XX, Xu L, Zhang Y, Xiao X, Wang XF, Liu Y, Zhang HJ, Yan YJ Efficient display of active Geotrichum sp. lipase on Pichia pastoris cell wall

57 and its application as a whole-cell biocatalyst to enrich EPA and DHA in fish oil. J. Agric. Food Chem. 60: Patel MJ, Patel AT, Akhani R, Dedania S, Patel DH Bioproduction of D- tagatosa from D-galactose using Phosphoglucose isomerase from Pseudomonas aeruginosa PAO1. Appl Biochem Biotechnol. 179: Potvin G, Ahmad A, Zhang Z Bioprocess engineering aspects of heterologous protein production in Pichia pastoris: A review. Biochem Eng J. 64: Poutou-Pinales RA, Cordoba-Ruiz HA, Barrera-Avellaneda LA, Delgado-Boada JM Carbon source feeding strategies for recombinant protein expression in Pichia pastoris and Pichia methanolica. African J Biotechnol. 9(15): Rhimi M, Bejar S Cloning, purification and biochemical characterization of metallic-ions independent and thermoactive L-arabinosa isomerase from the Bacillus stearothermophilus US100 strain. Biochim Biophys Acta. 1760: Roh HJ, Kim P, Park YC, Choi JH Bioconversion of D-galactose into D- tagatosa by expression of L-arabinosa isomerase. Biotechnol Appl Biochem. 31: 1-4. Rollini M, Manzoni M Bioconversion of D-galactitol to tagatosa and dehydrogenase activity induction in Gluconobacter oxydans. Process Biochem. 40: Roy A, Lu CF, Marykwas DL, Lipke PN, Kurjan J The AGA1product is involved in cell surface attachment of the Saccharomyces cerevisiae cell adhesion glycoprotein a-agglutinin. Mol Cell Biol. 11: Ryu SA, Kim CS, Kim HJ, Baek DH, Oh DK Continous D-tagatosa production by immobilized thermostable L-arabinosa isomerase in a packed-bed bioreactor. Biotechnol prog. 19: Sambrook J & Russel DW Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Ed., Could Spring Harbour Laboratory Press, USA. Schreuder M, Brekelmans S, Van Den Ende H, Klis FM Targeting of a heterologous protein to the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 9: Schreuder MP, Mooren ATA, Yoschka HY, Verrips T dan Klis FM Immobilizing protein on the surface of yeast. Tibtech. 14: Scott JK, Smith GP Searching for peptide ligands with an epitope library. Science. 249(4967): Sedlak M dan Ho NWY Expression of E. coli arabad operon encoding enzymes for metabolizing L-arabinosa in Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb Technol. 28(1): Seri K, Sanai K, Negishi S, Akino T Prophylactic and remedial preparation for diseases attendant on hyperglycemia, and wholesome food. European Patent Shibasaki S, Maeda H, Ueda M Molecular display technology using yeast Arming technology-. Analytical sciences. 25: Shimonishi T, Okumura Y, Izumori K Production of D-tagatosa from galactitol by Klebsiella pneumoniae strain 40b. J Ferment Bioeng. 78:

58 42 Simpson DM, Beynon RJ Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. J. Proteome Res. 9(1): Skytte UP Tagatosa. Di dalam: Mitchell H, editor. Sweeteners and Sugar Alternatives in Food Technology. Oxford: Blackwell Publishing. hlm Smith MR, Khera E, Wen F Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54: Soetart W, Vandamme J Industrial biotechnology sustainable growth and economic success. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. Su GD, Xhang X, dan Lin Y Surface display of active lipase in Pichia pastoris using Sed1 as an anchor protein. Biotechnol. Lett. 32: Tan Y, Tian T, Liu W, Zhu Z, Yang CJ Advance in phage display for bioanalysis. Biotechnol J. 11: Tanaka A, Kondo A Minireview: Cell-surface display of enzymes by the yeast Saccharomyces cerevisiae for synthetic biology. FEMS Yeast Res. 15: 1-9. Tanaka T, Yamada R, Ogino C, Kondo A Recent developments in yeast cell surface display toward extended applications in biotechnology. Appl Microbiol. Biotechnol. 95: Tanino T, Fukuda H, Kondo A Construction of a Pichia pastoris cellsurface display system using Flo1p anchor system. Biotechnol. Prog. 22: Troyono E, Martinez-Castro I, dan Olano A Kinetics of galactose and tagatosa formation during heat-treatment of milk. Food Chem. 45: Tsai DY, Tsai YJ, Yen CH, Ouyang CY, Yeh YC Bacterial surface display of metal binding peptides as whole-cell biocatalysts for 4-nitroaniline reduction. RSC Adv. 5: Ueda M dan Tanaka A. 2000a. Genetic immobilization of proteins on the yeast cell surface. Biotechnol. Adv. 18(2): Ueda M dan Tanaka A. 2000b. Cell surface engineering of yeast: construction of arming yeast with biocatalyst. J. Biosci. Bioeng. 90(2): Van der Vaart JM, Caro LHP, Chapman JW, Klis FM, Verrips CT Identification of three mannoproteins in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 177: Vozza LA, Wittwer L, Higgins DR, Purcell TJ, Bergseid M Production of a recombinant bovine enterokinase catalystic subunit in the methylotropic yeast Pichia pastris. Biotechnology. 14: Wang Q, Li L, Chen M, Qi Q, Wang PG Construction of a Novel Pichia pastoris Cell-Surface Display System Based on the Cell Wall Protein Pir1. Curr. Microbiol. 56: Watari J, Takata Y, Ogawa M, Sahara H, Koshino S, Onnela ML, Airaksinen U, Jaatinen R, Penttilä M, dan Keränen S Molecular cloning and analysis of the yeast flocculation gene FLO1. Yeast. 10(2): Wegner GH Emerging application of the methylotropic yeast. FEMS Microbil. Rev. 7: Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H Global prevalence of diabetes. Epidemiology Health Services Psychosocial Research. 5:

59 Won H, Lee SH, Lee KJ, Park J, Kim S, Kwon MH, dan Kim YS Construction and characterization of a pseudo-immune human antibody library using yeast surface display. Biochem Biophy Res Commun. 346: Wu CH, Liu IJ, Lu RM, Wu HC Advancement and application of peptide phage display technology in biomedical science. J Biomed Sci. 23: 8. Wu S, Letchworth GJ High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetat and dithiothreitol. BioTechniques. 36: Xu Z, Qing Y, Li S, Feng X, Xu H, dan Ouyang P A novel L-arabinosa isomerase from Lactobacillus fermentum CGMCC2921 for d-tagatosa production: Gene cloning, purification and characterization. J. Mol. Catal. B: Enzym. 70: 1 7. Yoon SH, Kim P, Oh DK Properties of L-arabinosa isomerase from Escherichia colias biocatalyst for tagatosa production. World J Microbiol Biotechnol. 19: Yoshida H, Yamada M, Nishitani T, Takada G, Izumori K, Kamitori S. (2007) Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of D- tagatosa 3-epimerase from Pseudomonas cichorii. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 63: Yue LX, Chi ZM, Wang L, Liu J, Madzak C, Li J, Wang XH Construction of a new plasmid for surface display on cells of Yarrowia lipolytica. J Microbiol Methods 72: Zehner LR, Lee R D-Tagatosa as a low-calorie carbohydrate sugar and bulking agent. European patent Zhang AL, Luo JX, Zhang TY, Pan YW, Tan YH, Fu CY & Tu FZ Recent advances on the GAP promoter derived expression system of Pichia pastoris. Mol Biol Rep. 36: Zhang YW, Jeya M, Lee JK Enhaced activity and stability of L-arabinosa isomerase by immobilization on aminopropyl glass. Appl Microbiol Biotechnol, in press. 87(6): Zhu KL, Chi ZM, Li J, Zhang FL, Li MJ, Yasoda HN, Wu LF The surface display of haemolysin fromvibrio harveyion yeast cells and their potential applications as live vaccine in marine fish. Vaccine. 24:

60 44 LAMPIRAN

61 45 Lampiran 1 Sekuen DNA dan asam amino dari Indo-GSAI 1 ATGATGCTGTCATTACGTCCTTATGAATTTTGGTTTGTAACGGGAAGCCAGCACTTGTAC 1 M M L S L R P Y E F W F V T G S Q H L Y 61 GGAGAAGAAGCATTAAGGCAAGTTGAAGAGCATTCAATGATGATTGTCAATGAGCTGAAT 21 G E E A L R Q V E E H S M M I V N E L N 121 CAAGATTCAGTGTTCCCGTTCCCACTTGTTTTCAAATCAGTTGTCACAACACCAGAGGAA 41 Q D S V F P F F L V F K S V V T T P E E 181 ATTCGGCGCGTTTGCCTTGAGGCGAATGCGAGCGAACAATGCGCTGGGGTCATCACTTGG 61 I R R V C L E A N A S E Q C A G V I T W 241 ATGCATACATTCTCGCCAGCGAAGATGTGGATTGGCGGCCTTTTGGAGCTGCGAAAACCG 81 M H T F S P A K M W I G G L L E L R K P 301 TTATTGCATCTTCACACTCAATTTAACCGTGATATTCCGTGGGACAGCATCGATATGGAC 101 L L H L H T Q F N R D I P W D S I D M D 361 TTTATGAACTTAAACCAATCGGCTCACGGTGACCGGGAATACGGATTTATCGGCGCGAGA 121 F M N L N Q S A H G D R E Y G F I G A R 421 ATGGGCGTGGCCCGGAAAGTGGTGGTCGGGCACTGGGAAGACCCAGAAGTCCGCGAGCGG 141 M G V A R K V V V G H W E D P E V R E R 481 CTGGCGAAATGGATGCGGACGGCTGTCGCGTTTGCGGAAAGCCGCAACCTAAAAGTGGCT 161 L A K W M R T A V A F A E S R N L K V A 541 CGTTTTGGCGACAACATGCGTGAAGTGGCTGTGACGGAAGGGGACAAAGTCGGAGCGCAA 181 R F G D N M R E V A V T E G D K V G A Q 601 ATTCAATTCGGCTGGTCGGTCAGCGGCTATGGCATCGGGGATTTGGTGCAATACATCCGC 201 I Q F G W S V S G Y G I G D L V Q Y I R 661 GATGTTTCTGAACAAAAAGTGAACGAGTTGCTCGATGAATACGAGGAGCTGTACGACATT 221 D V S E Q K V N E L L D E Y E E L Y D I 721 GTACCCGCCGGCCGCCAAGAAGGGCCCGTTCGCGAATCAATTCGTGAACAGGCGCGGATT 241 V P A G R Q E G P V R E S I R E Q A R I 781 GAACTCGGGCTGAAAGCCTTTTTGCAGGATGGGAACTTTACCGCTTTCACGACGACGTTC 261 E L G L K A F L Q D G N F T A F T T T F 841 GAGGACTTGCATGGGATGAAGCAGCTCCCGGGACTTGCCGTTCAGCGACTCATGGCGGAA 281 E D L H G M K Q L P G L A V Q R L M A E 901 GGCTACGGCTTTGGCGGCGAAGGCGACTGGAAAACAGCCGCCCTCGTCCGGTTGATGAAA 301 G Y G F G G E G D W K T A A L V R L M K 961 GTCATGGCCGACGGCAAAGGGACGTCGTTCATGGAAGAYTACACGTATCACTTCGAGCCG 321 V M A D G K G T S F M E D Y T Y H F E P 1021 GGCAACGAACTGATTCTCGGCGCTCATATGCTCGAAGTATGTCCGACGATCGCGGCAACC 341 G N E L I L G A H M L E V C P T I A A T 1141 AAACCAAGAATCGAAGTTCATCCGCTTTCCATCGGCGGAAAAGAAGATCCGGCCCGTCTT 361 K P R I E V H P L S I G G K E D P A R L 1201 GTGTTTGACGGCGGCGAGGGTGCGGCGGTCAACGCGTCATTGATCGACTTAGGGCACCGT 381 V F D G G E G A A V N A S L I D L G H R 1261 TTCCGACTCATCGTCAATGAAGTCGATGCGGTGAAACCGGAACACGACATGCCGAAATTA 401 F R L I V N E V D A V K P E H D M P K L 1321 CCAGTCGCCCGCATTTTATGGAAGCCTCGCCCGTCGCTCCGCGACTCCGCTGAAGCATGG 421 P V A R I L W K P R P S L R D S A E A W 1281 ATTTTAGCTGGCGGCGCCCACCATACGTGCTTCTCATTTGCGGTTACAACAGAACAGCTG 441 I L A G G A H H T C F S F A V T T E Q L 1341 CAAGACTTTGCGGAAATGGCAGGGATTGAATGTGTCGTGATCAATGAACATACGTCCGTC 461 Q D F A E M A G I E C V V I N E H T S V 1401 CCCTCATTCAAGAACGAACTAAGATGGAATGAAGTATTTTGGCGGGGGCGGTAA 481 P S F K N E L R W N E V F W R G R *

62 46 Lampiran 2 Sekuen DNA vektor ekspresi pj912-agα (DNA 2.0) 1 CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTTCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC 61 ACCACTTCAA GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG 121 TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC 181 CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC 241 GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCT ATGAGAAAGC GCCACGCTTC 301 CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA 361 CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC 421 TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG 481 CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT 541 TTCCTGCGGT ACCCAGATCC AATTCCCGCT TTGACTGCCT GAAATCTCCA TCGCCTACAA 601 TGATGACATT TGGATTTGGT TGACTCATGT TGGTATTGTG AAATAGACGC AGATCGGGAA 661 CACTGAAAAA TACACAGTTA TTATTCATTT AAATAACATC CAAAGACGAA AGGTTGAATG 721 AAACCTTTTT GCCATCCGAC ATCCACAGGT CCATTCTCAC ACATAAGTGC CAAACGCAAC 781 AGGAGGGGAT ACACTAGCAG CAGACCGTTG CAAACGCAGG ACCTCCACTC CTCTTCTCCT 841 CAACACCCAC TTTTGCCATC GAAAAACCAG CCCAGTTATT GGGCTTGATT GGAGCTCGCT 901 CATTCCAATT CCTTCTATTA GGCTACTAAC ACCATGACTT TATTAGCCTG TCTATCCTGG 961 CCCCCCTGGC GAGGTTCATG TTTGTTTATT TCCGAATGCA ACAAGCTCCG CATTACACCC 1021 GAACATCACT CCAGATGAGG GCTTTCTGAG TGTGGGGTCA AATAGTTTCA TGTTCCCCAA 1081 ATGGCCCAAA ACTGACAGTT TAAACGCTGT CTTGGAACCT AATATGACAA AAGCGTGATC 1141 TCATCCAAGA TGAACTAAGT TTGGTTCGTT GAAATGCTAA CGGCCAGTTG GTCAAAAAGA 1201 AACTTCCAAA AGTCGGCATA CCGTTTGTCT TGTTTGGTAT TGATTGACGA ATGCTCAAAA 1261 ATAATCTCAT TAATGCTTAG CGCAGTCTCT CTATCGCTTC TGAACCCCGG TGCACCTGTG 1321 CCGAAACGCA AATGGGGAAA CACCCGCTTT TTGGATGATT ATGCATTGTC TCCACATTGT 1381 ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTA 1441 ACTGTTCTAA CCCCTACTTG ACAGCAATAT ATAAACAGAA GGAAGCTGCC CTGTCTTAAA 1501 CCTTTTTTTT TATCATCATT ATTAGCTTAC TTTCATAATT GCGACTGGTT CCAATTGACA 1561 AGCTTTTGAT TTTAACGACT TTTAACGACA ACTTGAGAAG ATCAAAAAAC AACTAATTAT 1621 TGAAAGAATT CCGAAACGAT GAGATTCCCA TCTATTTTCA CCGCTGTCTT GTTCGCTGCC 1681 TCCTCTGCAT TGGCTGCCCC TGTTAACACT ACCACTGAAG ACGAGACTGC TCAAATTCCA 1741 GCTGAAGCAG TTATCGGTTA CTCTGACCTT GAGGGTGATT TCGACGTCGC TGTTTTGCCT 1801 TTCTCTAACT CCACTAACAA CGGTTTGTTG TTCATTAACA CCACTATCGC TTCCATTGCT 1861 GCTAAGGAAG AGGGTGTCTC TCTCGAGAAA AGAGAGGCCG AAGCTGCCGG CGTCGACATG 1921 GTTTCTAAAG GTGAGGAGTT GATTAAGGAA AACATGCATA TGAAGTTATA CATGGAGGGT 1981 ACCGTCAATA ATCATCACTT TAAGTGTACT TCAGAAGGAG AAGGTAAGCC TTATGAAGGT 2041 ACTCAGACTA TGAGAATCAA GGTTGTTGAA GGTGGACCCT TACCATTTGC TTTTGACATC 2101 TTGGCAACTT CCTTCATGTA CGGTAGCAGG ACATTCATTA ATCACACCCA AGGTATCCCA 2161 GACTTTTTCA AACAATCTTT CCCAGAGGGT TTTACTTGGG AAAGAGTTAC GACATATGAG 2221 GACGGCGGAG TGTTGACTGC TACTCAAGAC ACATCGCTGC AAGATGGTTG TTTGATATAC 2281 AACGTGAAAA TTCGAGGTGT GAATTTCCCT AGTAATGGAC CAGTGATGCA GAAGAAAACA 2341 CTGGGTTGGG AGGCTAACAC GGAAATGTTG TATCCTGCTG ACGGCGGTCT TGAGGGACGT 2401 ACTGATATGG CCCTGAAACT TGTAGGAGGT GGTCATTTGA TTTGTAACTT TAAGACAACC 2461 TATAGAAGCA AAAAGCCTGC TAAAAATCTG AAGATGCCCG GTGTTTACTA TGTCGATCAT 2521 AGGTTGGAAC GTATCAAAGA GGCAGATAAA GAGACTTATG TTGAACAGCA CGAAGTTGCT 2581 GTAGCAAGAT ACTGCGATTT GCCATCCAAA CTCGGACATA AGTTGAATGG AATGGATGAG 2641 CTATACAAGA GTACTTCCGG AGGTGATTAT AAGGACGATG ACGATAAAAC CGGTAGCGCT 2701 AAGTCGAGCT TCATCTCCAC TACAACCACT GACTTGACTT CTATAAACAC GAGTGCCTAC 2761 TCAACAGGTT CAATCAGCAC TGTTGAAACT GGAAACAGAA CTACTTCCGA GGTCATATCA 2821 CATGTAGTGA CTACTTCTAC TAAGTTATCT CCAACAGCTA CAACCTCGTT GACGATTGCT 2881 CAGACATCAA TCTACTCCAC AGATTCCAAT ATCACAGTCG GAACTGATAT TCACACTACA 2941 AGTGAGGTGA TTTCCGATGT TGAGACAATT TCGAGAGAGA CTGCTAGCAC TGTAGTGGCA 3001 GCCCCGACGT CCACAACTGG TTGGACAGGT GCTATGAATA CTTATATCAG TCAATTCACC 3061 TCTAGTTCAT TCGCCACGAT TAATTCTACT CCTATTATCT CTTCAAGTGC TGTCTTTGAA 3121 ACATCAGACG CTAGCATTGT TAACGTTCAT ACTGAGAATA TCACTAACAC GGCAGCTGTG 3181 CCTTCTGAGG AACCAACTTT TGTTAATGCA ACACGTAATT CTCTTAACTC ATTCTGTTCC 3241 TCGAAACAAC CTTCCTCTCC ATCGTCCTAT ACATCCAGCC CCTTGGTTTC CAGTCTGTCT 3301 GTGTCAAAGA CACTTTTGTC AACCTCCTTC ACCCCATCTG TACCTACTTC CAACACTTAC 3361 ATCAAAACGA AAAATACAGG ATATTTCGAA CACACTGCTC TAACAACCTC TAGCGTCGGA 3421 TTGAATAGTT TTTCAGAAAC CGCAGTTTCC TCTCAAGGTA CAAAAATAGA CACCTTTCTG 3481 GTTTCATCCC TAATCGCATA CCCATCCTCC GCATCAGGCT CGCAATTGTC CGGTATCCAA 3541 CAGAATTTTA CATCTACATC TCTGATGATT TCAACTTACG AAGGTAAAGC TTCCATTTTC 3601 TTCAGCGCAG AACTCGGTTC CATTATCTTT TTGTTACTTA GTTACCTGTT ATTTTGAGGG 3661 GCGGCCGCTC AAGAGGATGT CAGAATGCCA TTTGCCTGAG AGATGCAGGC TTCATTTTTG 3721 ATACTTTTTT ATTTGTAACC TATATAGTAT AGGATTTTTT TTGTCATTTT GTTTCTTCTC

63 3781 GTACGAGCTT GCTCCTGATC AGCCTATCTC GCAGCAGATG AATATCTTGT GGTAGGGGTT 3841 TGGGAAAATC ATTCGAGTTT GATGTTTTTC TTGGTATTTC CCACTCCTCT TCAGAGTACA 3901 GAAGATTAAG TGAAACCTTC GTTTGTGCGG ATCCTTCAGT AATGTCTTGT TTCTTTTGTT 3961 GCAGTGGTGA GCCATTTTGA CTTCGTGAAA GTTTCTTTAG AATAGTTGTT TCCAGAGGCC 4021 AAACATTCCA CCCGTAGTAA AGTGCAAGCG TAGGAAGACC AAGACTGGCA TAAATCAGGT 4081 ATAAGTGTCG AGCACTGGCA GGTGATCTTC TGAAAGTTTC TACTAGCAGA TAAGATCCAG 4141 TAGTCATGCA TATGGCAACA ATGTACCGTG TGGATCTAAG AACGCGTCCT ACTAACCTTC 4201 GCATTCGTTG GTCCAGTTTG TTGTTATCGA TCAACGTGAC AAGGTTGTCG ATTCCGCGTA 4261 AGCATGCATA CCCAAGGACG CCTGTTGCAA TTCCAAGTGA GCCAGTTCCA ACAATCTTTG 4321 TAATATTAGA GCACTTCATT GTGTTGCGCT TGAAAGTAAA ATGCGAACAA ATTAAGAGAT 4381 AATCTCGAAA CCGCGACTTC AAACGCCAAT ATGATGTGCG GCACACAATA AGCGTTCATA 4441 TCCGCTGGGT GACTTTCTCG CTTTAAAAAA TTATCCGAAA AAATTTTCTA GAGTGTTGTT 4501 ACTTTATACT TCCGGCTCGT ATAATACGAC AAGGTGTAAG GAGGACTAAA CCATGGCTAA 4561 ACTCACCTCT GCTGTTCCAG TCCTGACTGC TCGTGATGTT GCTGGTGCTG TTGAGTTCTG 4621 GACTGATAGA CTCGGTTTCT CCCGTGACTT CGTAGAGGAC GACTTTGCCG GTGTTGTACG 4681 TGACGACGTT ACCCTGTTCA TCTCCGCAGT TCAGGACCAG GTTGTGCCAG ACAACACTCT 4741 GGCATGGGTA TGGGTTCGTG GTCTGGACGA ACTGTACGCT GAGTGGTCTG AGGTCGTGTC 4801 TACCAACTTC CGTGATGCAT CTGGTCCAGC TATGACCGAG ATCGGTGAAC AGCCCTGGGG 4861 TCGTGAGTTT GCACTGCGTG ATCCAGCTGG TAACTGCGTG CATTTCGTCG CAGAAGAGCA 4921 GGACTAACAA TTGACACCTT ACGATTATTT AGAGAGTATT TATTAGTTTT ATTGTATGTA 4981 TACGGATGTT TTATTATCTA TTTATGCCCT TATATTCTGT AACTATCCAA AAGTCCTATC 5041 TTATCAAGCC AGCAATCTAT GTCCGCGAAC GTCAACTAAA AATAAGCTTT TTATGCTCTT 5101 CTCTCTTTTT TTCCCTTCGG TATAATTATA CCTTGCATCC ACAGATTCTC CTGCCAAATT 5161 TTGCATAATC CTTTACAACA TGGCTATATG GGAGCACTTA GCGCCCTCCA AAACCCATAT 5221 TGCCTACGCA TGTATAGGTG TTTTTTCCAC AATATTTTCT CTGTGCTCTC TTTTTATTAA 5281 AGAGAAGCTC TATATCGGAG AAGCTTCTGT GGCCGTTATA TTCGGCCTTA TCGTGGGACC 5341 ACATTGCCTG AATTGGTTTG CCCCGGAAGA TTGGGGAAAC TTGGATCTGA TTACCTTAGC 5401 TGCAGGTACC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT 5461 TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT 5521 TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAA Keterangan: Sekuen pada posisi (huruf berwarna coklat; awal) : promotor AOX1 Sekuen pada posisi (huruf berwarna coklat; akhir) : terminator AOX1 Sekuen pada posisi (huruf berwarna hijau): ZeoR Posisi situs restriksi yang dipilih untuk keperluan cloning dalam sekuen DNA sumber vektor pj912-agα (diblok kuning): SalI pada posisi 1912; Kpn2I pada posisi 2656 Posisi situs restriksi yang dipilih untuk keperluan transformasi ke khamir P. pastoris (diblok hijau): SacI pada posisi

64 48 Lampiran 3 Elektroforesis gel agarosa (Ausubel et al. 2002) Komposisi larutan stok running buffer tris acetic EDTA (TAE) 50 (1L) (Ausubel et al. 2005): Komposisi Tris base Asam asetat glasial Na 2 EDTA.2H 2 O H 2 O 242 g 57.1 ml 37.2 g hingga 1 L Jumlah Komposisi 1% gel agarosa (100 ml): Komposisi Agarosa Larutan buffer TAE 1 1 g 100 ml Jumlah Perbandingan sampel DNA : Loading dye = 5 : 1 Proses elektroforesis dijalankan pada tegangan konstan 70 V selama 75 menit. Pewarnaan geldilakukan menggunakan larutan EtBr 0.5 μg/ml dan didokumentasikan menggunakan gel doc.

65 49 Lampiran 4 Komposisi larutan dan media yang digunakan beserta cara pembuatannya Media dan Larutan Buffer TAE 50x, ph 8.5 LSLB ( Low Salt Luria Bertani) YPD (Yeast Peptone Dextrose) YPDS (Yeast Peptone Dextrose Sorbitol) Komposisi dan cara pembuatan Sebanyak 242 g Tris-basa, 57.1 ml asam asetat glasial dan g Na2EDTA dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 1000 ml. Larutan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan1 atm selama 15 menit. Untuk membuat 1 buffer TAE (running elektroforesis DNA), 20 ml 50 buffer TAE diencerkan dengan 990 ml akuades steril. Sebanyak 1 g tripton, 0.5 g ekstrak yeast, dan 0.5 g NaCl dilarutkan ke dalam 100 ml akuades. Sebanyak 1.7 g bacto agar ditambahkan ke dalam media jika ingin membuat media padat. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan1 atm selama 15 menit. Media disimpan pada suhu 4 o C. Sebanyak 1 g ekstrak yeast dan 2 g NaCl dilarutkan ke dalam 90 ml akuades. Sebanyak 2 g bacto agar ditambahkan ke dalam media jika ingin membuat media padat. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan1 atm selama 15 menit. Media ditambahkan dengan 10 ml 20% D- glukosa steril (20 gram D-glukosa dilarutkan dengan 100 ml akuades dan disterilkan dengan filter) ketika media akan digunakan. Sebanyak 1 g ekstrak yeast, 2 g NaCl dan g sorbitol dilarutkan ke dalam 90 ml akuades. Sebanyak 1.7 g bacto agar ditambahkan ke dalam media jika ingin membuat media padat. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Media ditambahkan dengan 10 ml 20% D-glukosa steril (20 g D-glukosa dilarutkan dengan 100 ml akuades dan disterilkan dengan filter) ketika media akan digunakan. 1 M Sorbitol Sorbitol sebanyak g dilarutkan di dalam 100 ml akuades dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm selama 15 menit. BMGY (Buffered Glycerolcomplex Medium) dan BMMY (Buffered Sebanyak 1 g ekstrak yeast dan 2 g pepton dilarutkan dalam 70 ml akuades dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm

66 50 Methanol- Medium) complex selama 15 menit. Ketika media akan digunakan, media ditambahkan dengan 10 ml 1 M buffer kalium fosfat (ph 6.0), 10 ml 13.4 % (b/v) )YNB, 0.2 ml 0.02 % (b/v) biotin dan 10 ml 10 % (v/v) gliserol. Untuk media BMMY, gliserol diganti dengan 10 ml 50 % (v/v) metanol. 13,4% YNB (yeast nitrogen base) 1 M Buffer Kalium fosfat, ph 6.0 Sebanyak 10 g amonium sulfat dan 3.4 g yeast nitrogen base tanpa amonium sulfat dan tanpa asam amino dilarutkan dengan 100 ml akuades steril dan disterilkan dengan filter. Media disimpan pada suhu 4 o C. Sebanyak 10 g amonium sulfat dan 3.4 g yeast nitrogen base tanpa amonium sulfat dan tanpa asam amino dilarutkan dengan 100 ml akuades steril dan disterilkan dengan filter. Media disimpan pada suhu 4 o C % (b/v) Biotin Sebanyak 20 mg biotin dilarutkan ke dalam 100 ml akuades steril. Media disterilkan dengan menggunakan filter. Media disimpan pada suhu 4 o C. 10 % (v/v) Gliserol Sebanyak 10 ml gliserol dilarutkan 100 ml akuades. Gliserol disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm selama 15 menit dan disimpan pada suhu ruang. 10 % (b/v) SDS Sebanyak 10 g SDS dilarutkan dalam 100 ml akuades dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm selama 15 menit. 5x Buffer elektrorunning Buffer A (buffer lisis sel P. pastoris) 100 mm PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) Bufer elektrotransfer Sebanyak 15.5 g Tris base (128 mm), 72 g glisin (959 mm) dan 5 g SDS dilarutkan dalam 1 L akuades Buffer ini terdiri dari 20 mm Tris-HCl, ph 7.5, 200 mm NaCl, 5 mm MgCl 2. Sebanyak g PMSF dilarutkan dengan 2 ml etanol absolut Sebanyak 3.03 g Tris Base (25 mm) dan 14.4 g glisin (192 mm) dicampurkan dengan 200 ml metanol. Larutan tersebut ditambahkan akuades hingga volume 1 L.

67 51 TBS (Tris buffer saline) Sebanyak 100 ml 1 M Tris-Cl ph 7.5 (100 mm) dicampurkan dengan 100 ml 1.5 M NaCl (150 mm) dan ditambahkan akuades steril hingga 1 L. 1 M Tris-Cl ph 7.5 Sebanyak g Tris-basa dilarutkan dalam 30 ml akuades dan ditambahkan 3 HCl hingga mencapai ph 7.5. larutan ditambahkan akuades hingga mencapai volume 100 ml dan disterikan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 1 atm selama 15 menit 1,5 M NaCl Sebanyak g NaCl dilarutkan dengan 150 ml akuades dan disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atm selama 15 menit.

68 52 Lampiran 5 Komposisi gel poliakrilamid Bahan Volume (μl) Gel pemisah (15%) Gel penahan (8%) Akuadestilata M Tris-HCl, ph M Tris-HCl, ph % SDS % Akrilamid % Amonium persulfat TEMED

69 53 Lampiran 6 Hasil analisis sekuensing DNA dari pj912-agα-araa Primer SeqPPAI-F

70 54

71 55 Primer SeqPPAI-R

72 56