KERAGAMAN BAKTERI PEMFIKSASI NITROGEN PADA SAWAH DATARAN RENDAH BERDASARKAN GEN nifh MASRUKHIN

Transkripsi

1 KERAGAMAN BAKTERI PEMFIKSASI NITROGEN PADA SAWAH DATARAN RENDAH BERDASARKAN GEN nifh MASRUKHIN SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

2

3 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Keragaman Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Sawah Dataran Rendah Berdasarkan Gen nifh adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2016 Masrukhin NIM G

4 RINGKASAN MASRUKHIN. Keragaman Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Sawah Dataran Rendah berdasarkan Gen nifh. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan NISA RACHMANIA MUBARIK. Pupuk hayati merupakan pupuk yang mengandung mikroorganisme hidup yang mampu mengkolonisasi rhizosfer tanaman dan dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman dengan cara meningkatkan asupan maupun ketersediaan hara bagi tanaman. Berbagai macam bakteri yang digunakan dalam konsorsium bakterinya antara lain mikrob pemfiksasi N2, pelarut unsur P dan K, pereduksi nitrous oksida (N2O) dan pengoksidasi metan (CH4). Berdasarkan penelitian sebelumnya, penggunaan pupuk hayati yang menggandung konsorsium bakteri metanotrof dan bakteri pereduksi N2O dapat meningkatkan pertumbuhan dan produktivitas padi yang ditunjukkan dengan peningkatan tinggi, bobot kering, banyaknya bulir, dan jumlah anakan padi. Penelitian ini diawali dengan aplikasi pupuk hayati yang terdiri atas konsorsium bakteri metanotrof Methylocystis rosea BGM1, M. parvus BGM3, Methylococcus capsulatus BGM9, Methylobacter SKM14 dan bakteri pereduksi N2O Ochrobactrum anthropi BL2. Lahan sawah dibagi menjadi dua perlakuan yaitu perlakuan pupuk hayati (20% NPK + pupuk hayati) dan kontrol (100% NPK). Pada penelitian ini analisis keragaman bakteri dilakukan dengan pendekatan metagenomik, yakni dengan teknik Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE). Sampel tanah dari tiap perlakuan diambil pada 0 hari setelah tanam (0HST), 60 HST dan 120 HST. Total genom diekstraksi dari sampel tanah tersebut dan dlakukan amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan gen spesifik nifh dan 16S rrna. nifh merupakan gen pengkode enzim dinitrogenase reduktase (Fe protein) yang bersifat conserved sehingga umum digunakan sebagai gen spesifik untuk menganalisis keragaman mikrob pemfiksasi nitrogen. Hasil amplikon nifh maupun 16S rrna kemudian dilakukan elektroforesis dengan menggunakan teknik DGGE. Berdasarkan hasi penelitian, secara umum perlakuan kontrol memiliki keragaman bakteri yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan pupuk hayati yang ditunjukkan dengan banyaknya jumlah pita DGGE. Tingginya keragaman bakteri pada kontrol diduga karena penggunaan pupuk kimia (NPK) yang membuat tanah lebih kaya nutrisi dibandingkan pada perlakuan pupuk hayati. Berdasarkan analisis pengelompokan (clustering analysis) menggunakan gen nifh secara umum didapatkan terdapat 2 cluster yaitu P0, P60, K120 dan K0, K60, P120. Terpisahnya 2 cluster tersebut disebabkan adanya perbedaan keragaman bakteri pamfiksasi nitrogen yang disebabkan oleh kebutuhan nitrogen tanaman dan ketersediaanya. Adapun berdasarkan 16S rrna secara umum P60 berada 1 cluster dengan K60, P0, K0 dan P120, K120. Pengelompokan tersebut diduga disebabkan oleh ketersediaan nutrisi pada tanah yang salah berasal dari eksudat akar. Sekresi eksudat akar tersbut dipengaruhi oleh fase pertumbuhan tanaman. Sebanyak 9 pita DNA nifh yang berbeda dari hasil DGGE berhasil diamplifikasi ulang dan dilakukan pembacaan sekuen (sequencing). Analisis filogenetik berdasarkan BLAST-N menunjukkan mayoritas bakteri pemfiksasi

5 nitrogen yang didapatkan berkerabat dekat dengan uncultured bacterium. Namun terdapat 3 pita yang terdeteksi sebagai bakteri Sphingomonas sp., Ideonella dechloratans dan Magnetospirillum sp. Adapun pada DGGE dengan menggunakan gen 16S rrna didapatkan 20 pita DNA yang berhasil diamplifikasi ulang. Hasil analisis filogenetik gen 16S rrna menunjukkan terdapat 5 filum bakteri pada lahan sawah, yaitu Proteobacteria, Clostridia, Bacteroidetes, Chlorofexi, dan Gemmatimonadetes. Pada filum Proteobacteria, terdapat 2 kelas bakteri yang berbeda yaitu Alphaproteobacteria dan Gammaproteobacteria. Alphaproteobacteria menjadi kelompok bakteri yang paling dominan ditemukan, diikuti Gammaproteobacteria, Chlorofexi, Clostridia, Gemmatimonadetes dan Bacteroides. Sekuen gen nifh hasil DGGE dikonfirmasi kembali menggunakan BLAST-X, hasil dari BLAST-X menunjukkan semua sekuen merupakan pengkode enzim dinitrogenase reduktase (Fe protein) Kata kunci: Pupuk hayati, fiksasi nitrogen, metagenomik, DGGE, gen nifh.

6 SUMMARY MASRUKHIN. Diversity of Nitrogen- Fixing Bacteria in Lowland Paddy Field based on nifh Gene. Supervised by IMAN RUSMANA and NISA RACHMANIA MUBARIK. Biofertilizer is a fetilizer contain living microorganism which able to colonize rhizosphere of the plant and has ability to promote plant growth by increasing nutrients uptake of the plant and nutrients availability in the soil. Some bacteria which commonly used as consortium of biofertilizer are nitrogen fixing bacteria, phosphate and pottasium solubilizer bacteria, N2O reducing bacteria and methanotrophic bacteria. According to previous research the application of biofertilizer which contain consortium of methanotrophic bacteria and N2O reducing bacteria was able to promote the plant growth and productivity. This research was started by the application of biofetilizer which contain consortium of methanotrophic bacteria Methylocystis rosea BGM1, M. parvus BGM3, Methylococcus capsulatus BGM9, Methylobacter SKM14 and nitrous oxide (N2O) reducing bacteria Ochrobactrum anthropi BL2. The field was divided into 2 treatments i.e biofertilizer application (20% NPK + biofertilizer) and control (100% NPK). This research using Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE) as one of metagenomic approach to analyze the microbial diversity. Soil sample was taken from each treatment at 0 day after planting (0 DAP), 60 DAP, and 120 DAP. Total genome was extracted from soil and amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) by using nifh and 16S rrna gene. nifh is conserved gene which encode dinitrogenase reductase (Fe protein). It was commonly used as molecular marker to analyze the diversity of nitrogen fixing bacteria. The PCR product then electrophorized using DGGE. According to the result, generally control has higher bacterial diversity than biofertilizer treatment, it showed by higher number of DGGE bands. High number of DGGE bands was caused by the application 100% dose of chemical fertilizer (NPK) which enrich the soil and support the growth of bacteria. According to clustering analysis by using nifh gene, generally there were 2 cluster i.e P0, P60, K120 and K0, K60, P120. Two main cluster were caused by the difference of nitrogen fixing bacterial diversity which affected by nitrogen requirements of the plants. According to 16S rrna generally P60 was in a cluster with K60, P0 with K0 and P120 with K120. The clustering was affected by nutrient availability in the soil which one of them is root exudates. Root exudates secretion was affected by plant growth stage. Nine different nifh bands were excised from the DGGE gel and used as templates for PCR amplification. The PCR products were sequenced. Phylogenetic analysis of the sequence showed that most of the DGGE bands were closely related to uncultured bacterium however there were 3 bands which were identified as Sphingomonas sp., Ideonella dechloratans and Magnetospirillum sp. There were 20 different DNA bands in DGGE of 16S rrna. Phylogenetic analysis showed 5 different phyla in soil bacteria i.e Proteobacteria, Clostridia, Bacteroidetes, Chlorofexi dan Gemmatimonadetes. There are two class of Proteobacteria were detected in this analysis i.e Alphaproteobacteria and Gammaproteobacteria. Alpha

7 proteobacteria was the most abundant soil bacteria which detected in paddy field, followed by Gamaproteobacteria, Chlorofexi, Clostridia, Gemmatimonadetes, and Bacteroides respectively. nifh sequence from DGGE bands then analyzed in BLAST-X to confirm that the sequence is encoding dinitrogenase reductase enzyme. BLAST-X result showed that all of nifh sequence from DGGE bands encoded dinitrogenase reductase enzyme (Fe protein). Keywords: Biofertilizer, nitrogen fixation, metagenomic, DGGE, nifh gene.

8 Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

9 KERAGAMAN BAKTERI PEMFIKSASI NITROGEN PADA SAWAH DATARAN RENDAH BERDASARKAN GEN nifh MASRUKHIN Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Mikrobiologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

10 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Hamim, MSi

11

12 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayahnya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini. Sholawat serta salam semoga tersampaikan kepada Nabi Muhammad SAW. Penelitian yang berjudul Keragaman Bakteri Pemfiksasi Nitrogen pada Sawah Dataran Rendah Berdasarkan Gen nifh dilaksanakan pada bulan September Juli 2016 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, IPB. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku komisi pembimbing atas arahan dan bimbingannya selama proses penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Dr. Ir. Hamim, M.Si selaku penguji luar komisi dan Dr. Rika Indri Astuti selaku perwakilan Program Studi Mikrobiologi atas diskusi dan saran yang diberikan. Selain itu penulis mengucapkan terima kasih kepada Lembaga Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) selaku lembaga pemberi beasiswa untuk program magister. Ungkapan terima kasih kepada orang tua tercinta dan seluruh anggota keluarga atas limpahan kasih sayang, doa dan dukungan yang tak pernah berhenti. Kepada rekan-rekan mikrobiologi 2014, IR Crew, seluruh personel Laboratorium Mikrobiogi dan rekan- rekan Awardee LPDP IPB, penulis mengucapkan terima kasih atas kerjasama, dukungan serta berbagai saran yang diberikan. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat bagi pembacanya. Bogor, September 2016 Masrukhin

13 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 2 Tujuan Penelitian 2 Manfaat Penelitian 2 Ruang Lingkup Penelitian 3 2 TINJAUAN PUSTAKA 4 Fiksasi Nitrogen 4 Diazotrof 4 Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE) 5 3 METODE 6 Waktu dan Tempat Penelitian 6 Bahan dan Metode 7 Sampel Tanah dan Perlakuan Sawah 7 Ekstraksi DNA 7 Amplifikasi Gen nifh dan Gen 16S rrna 7 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) 8 Elusi DNA dan Sekuensing Amplikon Gen nifh 8 Analisis Filogenetik dan Pengelompokan Keragaman Bakteri 9 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 10 Hasil 10 Pembahasan 20 5 SIMPULAN DAN SARAN 24 Simpulan 24 Saran 24 DAFTAR PUSTAKA 25 LAMPIRAN 29 RIWAYAT HIDUP 36 vi vi vi

14 DAFTAR TABEL 1 Referensi isolat yang digunakan Hasil kuantifikasi DNA menggunakan TianAmp Soil DNA Kit Hasil BLAST-N dari sekuen gen nifh Hasil BLAST-X dari sekuen nifh Hasil BLAST-N dari 16S rrna DAFTAR GAMBAR 1 Reaksi fiksasi nitrogen Diagram alir metode penelitian Hasil amplifikasi PCR gen nifh dan 16S rrna Profil DGGE gen nifh Profil DGGE 16S rrna Hasil amplifikasi ulang gen nifh Hasil amplifikasi ulang gen 16S rrna Pohon filogenetik gen nifh Pohon filogenetik gen 16S rrna DAFTAR LAMPIRAN 1 Protokol TianAmp Soil DNA kit Sekuen nifh yang digunakan untuk analisis filogenetik Sekuen 16S rrna yang digunakan untuk analisis filogenetik pensejajaran asam amino nifh... 35

15 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Pupuk hayati merupakan pupuk yang mengandung mikroorganisme hidup yang mampu mengkolonisasi rhizosfer atau bagian internal tanaman dan dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman dengan cara meningkatkan asupan maupun ketersediaan hara bagi tanaman (Vessey 2003). Aplikasi pupuk hayati telah banyak dilakukan di Indonesia. Konsorsium mikrob yang digunakan formulasinya juga bervariasi, misalnya mikrob pemfiksasi N2, pelarut unsur P dan K (Wu et al. 2004). Selain itu berdasarkan penelitian sebelumnya konsorsium mikrob pada pupuk hayati juga dapat mengandung bakteri pereduksi nitrous oksida (N2O) dan pengoksidasi metan (CH4) (Muttaqin 2012; Hadianta et al., 2014; Pingak et al., 2014; Sukmawati et al., 2015). Nitrogen merupakan hara esensial dalam menjaga kesuburan tanah (Wartiainen et al. 2007). Pada pertumbuhan tanaman nitrogen menjadi unsur yang sangat penting karena menjadi komponen penyusun sel tanaman seperti asam amino, asam nukleat dan klorofil. Salah satu proses terbentuknya N2 di alam adalah memlalui mekanisme yang disebut sebagai fiksasi nitrogen biologi (Biological nitrogen fixation). Fiksasi N2 secara biologi menyumbang kurang lebih 70% dari semua nitrogen yang difiksasi di bumi. Pada lahan pertanian padi secara umum ratarata fiksasi nitrogen mencapai 5 Tg per tahunnya, dan umumnya dilakukan oleh simbiosis cyanobacteria- Azolla (Smil 1999; Herridge et al. 2008). Organisme yang mampu memfiksasi nitrogen (gas N2) dan mengkonversinya kedalam bentuk amonia disebut diazotrof (Postgate 1998). Diazotrof memanfaatkan nitrogen gas N2 di atmosfer sebagai satu-satunya sumber nitrogen karena organisme tersebut tidak memerlukan asupan nitrogen lain dari habitatnya (Bottomley dan Myrold 2007). Secara umum bakteri pemfiksasi nitrogen terbagi menjadi dua, yaitu bakteri pemfiksasi nitrogen yang bersimbiosis dan yang hidup bebas (free living). Selain bakteri (eubakteria), beberapa jenis arkea metanogen juga mampu melakukan fiksasi nitrogen (White 2007). Penelitian mengenai aplikasi mikrob pemfiksasi nitrogen sebagai pupuk hayati telah banyak dilakukan (Kennedy et al. 2004). Gen nifh merupakan gen yang mengodekan enzim nitrogenase yang berperan dalam mengubah nitrogen bebas yang difiksasi menjadi bentuk amonium. Pada bakteri pemfiksasi nitrogen, enzim nitrogenase tersusun atas dua subunit, yaitu dinitrogenase dan nitrogenase reduktase. Gen nifh merupakan gen yang umum digunakan dan terbukti akurat sebagai penanda spesifik bagi bakteri pemfiksasi nitrogen, khususnya pada bakteri tanah (Dedysh et al. 2004). Berdasarkan gen tersebut keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen dapat dianalisis melalui pendekatan molekuler. Salah satu teknik analisis keragaman komunitas bakteri ialah dengan metode DGGE (Denaturing Gel Gradient Electrophoresis). Menurut Crosby dan Criddle (2003), DGGE dapat membedakan sekuen suatu spesies berdasarkan perbedaan melting temperature (Tm) pada DNA. Melting termperature pada sekuen DNA dipengaruhi oleh kandungan basa G-C dalam DNA (Muyzer et al. 1993).

16 2 Berdasarkan penelitian sebelumnya, penggunaan pupuk hayati yang mengandung konsorsium bakteri metanotrof dan pereduksi N2O dapat meningkatkan pertumbuhan dan produktivitas padi yang ditunjukkan tingginya bobot kering, banyaknya jumlah bulir dan anakan padi (Hadianta et al.2014; Pingak et al. 2014; Sukmawati et al. 2015). Inokulasi mikrob maupun pemberian benih yang telah terkolonisasi mikrob dapat berpengaruh pada mikrob indigenus tanah, yang mengarah pada perubahan struktural dari komunitas mikrob tersebut (Trabelsi dan Mhamdi 2013). Namun menurut Lerner et al. (2006) inokulasi Azospirillum brasiliense menunjukkan tidak adanya perubahan yang menonjol terhadap komunitas mikrob indigenus pada lahan jagung. Sawah merupakan habitat dari banyak mikrob pemfiksasi nitrogen. namun keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen di Indonesia umumnya dianalisis berdasarkan metode kultivasi konvensional. Penelitian sebelumnya pada sawah dataran tinggi, analisis keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen menunjukkan hasil yang beragam antara perlakuan pupuk hayati dan kontrol (nonpupuk hayati). Pada tanah dengan perlakuan kontrol (nonpupuk hayati), keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen lebih tinggi dibandingkan perlakuan pupuk hayati, hal tersebut ditunjukkan dengan jumlah pita DGGE yang lebih banyak (Hadianta et al. 2014). Perumusan Masalah Keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada sawah dataran rendah dengan aplikasi pupuk hayati di lapangan, dapat mempengaruhi produktivitas padi. Namun, keragaman bakteri yang kompleks hingga sekarang tidak semuanya dapat ditumbuhkan pada media buatan di laboratorium. Salah satu pendekatan yang dapat digunakan untuk menganalisis keragaman secara langsung yaitu pendekatan molekuler dengan teknik DGGE (denaturing gel gradient electrophoresis). DGGE dapat digunakan untuk menjawab dan mempelajari keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada lahan sawah. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk menganalisis keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen (diazotrof) pada lahan pertanian dataran rendah dengan metode Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE) berdasarkan gen spesifik nifh Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait keragaman komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen di lahan sawah, khsususnya pada lahan sawah dataran rendah daerah Pelabuhan Ratu- Sukabumi. Penelitian ini juga diharapkan apat menjadi salah satu acuan terkait analisis komunitas bakteri dengan metode DGGE menggunakan gen fungsional tertentu.

17 3 Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup penelitian ini meliputi: 1. Isolasi total DNA genom pada sampel tanah dari lahan sawah. 2. Ampifikasi PCR dengan primer gen spesifik nifh dan 16S rrna. 3. Elektroforesis amplikon nifh dan 16S rrna dengan menggunakan DGGE. 4. Analisis filogenetik dari amplikon nifh dan 16S rrna yang telah disekuensing.

18 4 2 TINJAUAN PUSTAKA Fiksasi Nitrogen Secara umum proses fiksasi nitrogen terjadi melalui tiga cara, yaitu yang pertama terjadi secara alami denga bantuan kilat. Kedua, fiksasi nitrogen melalui proses Haber-Bosch yang umum dilakukan pada industri pupuk. Adapun yang ketiga adalah proses fiksasi yang terjadi secara biologis (Biological nitrogen fixation) yang dilakukan oleh mikroorganisme pemfiksasi nitrogen (diazotrof). Organisme tersebut dapat hidup sebagai simbion maupun hidup bebas (free-living) (Caton 2007). Proses fiksasi nitrogen (Biological nitrogen fixation) dimediasi oleh kompleks enzim nitrogenase. Kompleks enzim tersebut tersusun atas dua protein, yaitu dinitrogenase dan dinitrogenase reduktase (Bottomley dan Myrold 2007). Enzim dinitrogenase terdiri atas protein Fe-Mo sedangkan enzim dinitrogenase reduktase terdiri atas protein Fe (Sugitha dan Kumar 2009), (Gambar 1). Kompleks enzim nitrogenase dikodekan oleh operon nif. Gen nifh spesifik mengkodekan protein dinitrogenase reduktase, nifd mengkodekan subunit α protein nitrogenase dan nifk mengkodekan subunit β dari protein MoFe pada dinitrogenase (Bottomley dan Myrold 2007). Gambar 1 Reaksi fiksasi nitrogen (White 2007) Pendekatan untuk menganalisis kergaman mikrob pemfiksasi nitrogen pada suatu lingkungan tertentu adalah dengan menggunakan gen spesifik pengkode kompleks enzim nitrogenase, baik nifd, nifh maupun nifk. Menurut penelitian Dedysh et al. (2004) gen nifh lazim digunakan sebagai gen spesifik untuk analisis keragaman komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen (diazotrof), selain itu gen nifh memiliki keragaman yang lebih tinggi dibandingkan dengan gen nifd, sehingga pustaka gen nifh lebih banyak dibandingkan dengan nifd. Diazotrof Diazotrof adalah mikroorganisme baik bakteri maupun arkea, yang mampu memfiksasi nitrogen bebas dalam bentuk gas N2 di atmosfer dan mengubahnya menjadi bentuk amonia (Postgate 1998). Fiksasi nitrogen secara biologis terjadi pada tiga kelompok mikroorganisme, pertama kelompok bakteri rhizosfer simbion yang membentuk nodul akar. Umumnya bakteri tersebut bersimbiosis dengan tanaman Legum, misalnya Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium, dan Azorhizobium. Kedua kelompok bakteri simbion pada tanaman non legum, bakteri tersebut tidak membentuk nodul akar, contohnya bakteri Azospirillum lipoferum yang umum ditemukan bersimbiosis dengan rumput-rumput di daerah tropis.

19 Adapun yang ketiga yaitu kelompok bakteri pemfiksasi nitrogen yang hidup bebas. Bakteri tersebut tidak bersimbiosis dengan tanaman apapun, contohnya bakteri Azotobacter, Clostridium, dan spesises tertentu dari Desulfovibrio. Selain bakteri, terdapat beberapa jenis arkea metanogen juga mampu melakukan fiksasi nitrogen (White 2007). Menurut Carini et al. (2003) beberapa genus bakteri metanotrof (pengoksidasi metan) dapat mengekspresikan enzim nitrogenase, sehingga mampu memfiksasi nitrogen sebagai sumber N, misalnya pada genus Methylococcus. Selain itu menurut Auman et al. (2001) genus Methylomonas dan bakteri Methylobacter marinus juga memiliki kompleks gen penyandi nitrogenase, sehingga mengindikasikan adanya kemampuan fiksasi nitrogen. Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE) Analisis komunitas diazotrof pada suatu lingkungan dapat dilakukan dengan pendekatan metagenomik, dimana tidak diperlukan isolasi bakteri dari sampel lingkungan tersebut. Menurut Chen dan Pachter (2005) metagenomik merupakan aplikasi dari teknik genomik, untuk analisis komunitas mikrob pada suatu sampel secara langsung, tanpa harus melakukan isolasi dan kultivasi di laboratorium. Hal tersebut mengacu pada asumsi bahwa mikrob yang bersifat unculturable (tidak bisa dikulturkan) lebih banyak dari mikrob yang bersifat culturable (dapat dikulturkan). Berkembangnya berbagai teknik metagenomik memberikan suatu terobosan baru dalam melakukan analisis keragaman komunitas mikrob pada suatu sampel lingkungan. Hal tersebut sangat membantu dalam studi biodiversitas. Beberapa teknik molekuler yang digunakan untuk menganalisis keragaman antara lain, Denaturing Gel Gradient Electrophoresis (DGGE), Fluorescent in-situ Hybridization (FISH), Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA), Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP), Length Heterogenecity PCR (LH-PCR), Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP) dan Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (RISA) (Rastogi dan Sani 2011). DGGE merupakan elektroforesis gel poliakrilamid dengan memanfaatkan gradien konsentrasi linear dari denaturan. Prinsip pemisahan DNA pada elektroforesis DGGE adalah berdasarkan suhu denaturasi (melting point/ Tm). Denaturan yang digunakan umumnya adalah campuran urea dan formamide. Gradien konsensentrasi denatruan berfungsi meningkatkan suhu denaturasi saat elektroforesis. Sampel yang dielektroforesis merupakan DNA dari sampel lingkungan yang telah diampifikasi PCR dengan primer spesifik (misalnya gen nifh, untuk bakteri pemfiksasi nitrogen). Suhu denaturasi (melting point) pada DNA dipengaruhi oleh rasio GC dan AT, sehingga semakin banyak kandungan GC maka semakin tinggi suhu yang diperlukan untuk mendenaturasinya (Muyzer et al. 1993). Menurut Muyzer dan Smalla (1998) keterbatasan penggunaan DGGE yaitu kemampuan pemisahan DNA yang cukup rendah, DGGE mampu bekerja optimal ketika memisahkan fragmen DNA dengan panjang sampai 500bp. Analisis keragaman diazotrof dengan menggunakan DGGE umumnya menggunakan penanda spesifik, gen nifh. Gen nifh memiliki keragaman yang tinggi dibanding gen nifd, selain itu pustaka gen dari gen nifh lebih banyak dibandingkan gen nifd (Dedysh et al. 2004). 5

20 6 3 METODE Kerangka penelitian ini terdiri atas beberapa aktivitas pokok yaitu pengambilan sampel tanah, ekstraksi DNA genom, amplifikasi PCR gen nifh dan 16S rrna, analisis DGGE dan analisis filogenetik (Gambar 2). Pemberian perlakuana sawah (100% NPK dan 20% NPK + pupuk hayati) Pengambilan sampel tanah Ekstaksi DNA dengan soil DNA extraction kit Amplifikasi gen nifh dengan primer PolF- GC/ AQER Amplifikasi gen 16s rrna dengan primer P338F-GC/ P518R Elektroforesis amplikon nifh/ 16s rrna Denaturing gel gradient electrophoresis (DGGE) Pemotongan DNA dari gel poliakrilamid (elusi DNA) Interpretasi hasil DGGE dengan software CLIQS 1D Sekuensing Analisis pengelompokan (Clustering analysis) Analisis filogenetik Gambar 2 Diagram alir metode penelitian Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlansung dari April April 2016.

21 7 Bahan dan Metode Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri metanotrof Methylocystis rosea BGM 1, Methylocystis parvus BGM 3, Methylococcus capsulatus BGM 9, Methylobacter sp. SKM 14 dan bakteri pereduksi N2O Ochrobactrum anthropi BL2 (Tabel 1). Adapun bibit yang digunakan ialah padi varietas IR64. Tabel 1 Referensi isolat yang digunakan Kode isolat Sumber Spesies Referensi BGM1 Sawah Bogor Methylocystis rosea Hapsari (2008); Astuti (2009) BGM3 Sawah Bogor Methylocystis parvus Hapsari (2008); Astuti (2009) BGM 9 Sawah Bogor Methylococcus capsulatus Hapsari (2008); Astuti (2009) SKM14 Sawah di Sukabumi Methylobacter sp Hapsari (2008); Astuti (2009) BL2 Sawah Bogor Ochrobactrum anthropi Setyaningsih (2010) Sampel Tanah dan Perlakuan Sawah Sampel tanah diambil dari lahan sawah di daerah Citarik, Pelabuhan Ratu- Jawa Barat (± 53 mdpl). Pengambilan sampel dimulai pada bulan Januari- Maret Terdapat dua petak lahan sawah dengan perlakuan pupuk hayati 50 kg/ha NPK + pupuk hayati (20% dosis), dan perlakuan kontrol 100% NPK (15:15:15) dengan dosis 250 kg/ha sesuai anjuran (Permentan 2007). Pengambilan sampel dilakukan secara acak pada lima plot yang dianggap mewakili dengan menggunakan soil core sampler. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak 3 kali yaitu pada awal penanaman (0 Hari setelah tanam/ HST), pertengahan (60 HST), dan setelah pemanenan (120 HST). Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan dengan kit ekstraksi DNA sampel tanah, TianAmp Soil DNA Kit (Tiangen Biotech, Beijing, CN). Prosedur yang digunakan sesuai dengan manual yang disediakan oleh produsen (Lampiran 1). Amplifikasi Gen nifh dan Gen 16S rrna DNA yang telah dikuantifikasi kemudian diamplifikasi dengan PCR T1- Thermocycler (Biometra, Goettingen, DE). Amplifikasi dilakukan dengan primer gen nifh yang dihibridisasi dengan GC clamps pada ujung 5. Sekuen primer forward PolF (5 -TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3 ) dan reverse AQER (5 - G ACGATGTAGATYTCCTG-3 ) (Poly et al. 2001). Sekuen GC-clamp yang digunakan berdasarkan penelitian Rosado et al. (1998). (5 -GCCCGCCGC- GCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG- 3). PCR mix (25 µl)

22 8 mengandung 1.5 µl primer forward dan 1.5 µl primer reverse dengan konsentrasi 10 pmol µl GoTaq Green Mastermix 2x (Promega, Madison, USA), 3 µl DNA template (~100 ng) dan 6.5 µl nuclease free water (NFW). Adapun kondisi PCR yang digunakan berdasarkan modifikasi dari Poly et al. (2001). Suhu pra-denaturasi 95 C, 60 detik, denaturasi 95 C, 30 detik, annealing 50 C, 60 detik, elongasi 72 C 60 detik, dan pasca-elongasi 72 C selama 5 menit. Amplifikasi 16S rrna dilakukan dengan primer P338F-GC (5 - CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3 ) dan P518R (5 -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ) (Overeas et al. 1997). PCR mix yang digunakan sama dengan amplifikasi gen nifh. Suhu annealing yang digunakan yaitu 58 C selama 30 detik. Hasil amplifikasi kemudian divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. DNA yang telah dielektroforesis kemudian diwarnai dengan ethidium bromide 0.1 %, direndam selama 15 menit, kemudian divisualisasi dengan G:BOX Gel Documentation (Syngene, Frederick, USA). Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Elektroforesis DGGE dilakukan dengan alat D Code Universal Mutation Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, US). Sebanyak 25 µl DNA template (20 µl amplikon PCR + 5 µl loading dye) dimigrasikan pada gel poliakrilamid 8%. Poliakrilamid 8% dibuat dari Akrilamid- Bis akrilamid (37:5). Komposisi denaturan yang digunakan yaitu urea dan formamida, gradien denaturan yang digunakan ialah 35-65%. Denaturan 100% dibuat dengan campuran 7 M urea dan 40% (v/v) formamida. Proses elektroforesis dilakukan pada suhu 60 C, tegangan 150 V selama 5.5 jam. Gel Poliakrilamid kemudian diwarnai dengan pewarna ethidium bromida (EtBr) 0.1 % selama 15 menit. Visualisasi dilakukan dengan menggunakan G:BOX Gel Documentation (Syngene, Frederick, USA). Hasil foto gel doc kemudian dianalisis dengan perangkat lunak CLIQS 1D (Total Lab, GB) untuk analisis lanjutan. Setelah didokumentasikan, pita DNA yang muncul kemudian dipotong dan dimasukkan ke dalam 100 µl Nuclease Free Water steril untuk kemudian dielusi. Elusi DNA dan Sekuensing Amplikon Gen nifh Potongan gel yang mengandung pita DNA dielusi, kemudian diamplifikasi kembali dengan DNA tersebut sebagai template. Sebanyak ~50 ng DNA diamplifikasi dengan menggunakan pasangan primer PolF/AQER (nifh) dan P338F/518R (16S rrna) tanpa GC clamps. Kondisi PCRdan mastermix yang digunakan sama dengan sebelumnya. DNA yang berhasil diamplifikasi kemudian dikirimkan ke Laboratorium penyedia jasa sequencing, guna dilakukan pembacaan sekuen DNA.

23 9 Analisis Filogenetik dan Pengelompokan Keragaman Bakteri DNA hasil sekuensing dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak ChromasPro (Technelysium, AU) untuk dilakukan proses penggabungan (assembly) dan trimming. Sekuens kemudian dibandingkan dengan database gene bank dengan menggunakan perangkat lunak Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide (BLAST-N) (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Sekuen homolog yang didapatkan kemudian disejajarkan menggunakan perangkat lunak MEGA 6.0 (Tamura et al. 2013) dengan metode bootstrap (nilai bootstrap 1000 X). Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan metode Neighbour Joining. Analisis pengelompokan (Clustering) dilakukan berdasarkan profil DGGE yang telah diinterpretasi dengan menggunakan perangkat lunak CLIQS 1D (Total Lab).

24 10 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Ekstraksi dan Amplifikasi DNA Ekstraksi DNA menggunakan TianAmp Soil DNA Kit (Tiangen Biotech, Beijing, CN), konsentrasi DNA yang dihasilkan beragam antara 17-23,5 (ng/µl) (Tabel 2). Nilai kemurnian DNA yang didapatkan rendah, umumnya nilai kemurnian DNA yang baik yakni memiliki nilai A260/280 berkisar antara , dan nilai A260/230 lebih dari 2.0. Tabel 2 Hasil kuantifikasi DNA menggunakan TianAmp Soil DNA Kit. No Kode sampel Konsentrasi DNA (ng/µl) A260/280 A260/230 1 P 0 HST 17,5 6,57 0,05 2 K 0 HST 18 5,36 0,06 3 P 60 HST 19,8 4,58 0,06 4 K 60 HST 17,4 5,71 0,05 5 P 120 HST 22,6 3,56 0,07 6 K 120 HST 23,5 3,08 0,07 Keterangan: P0: Perlakuan pupuk hayati 0 HST, K0: kontrol 0 HST, P60: perlakuan 60 HST, K60: kontrol 60 HST, P120: perlakuan 120 HST, K120: kontrol 120 HST). DGGE= denaturing gel gradient electrophoresis; HST= hari setelah tanam. Amplifikasi gen nifh dilakukan dengan menggunakan pasangan primer PolF- GC/ AQER. Sebanyak 6 sampel berhasil diamplifikasi dan menghasilkan pita tunggal dengan panjang amplikon ±343 bp (Gambar 3a). Adapun untuk 16S rrna, amplifikasi dilakukan dengan pasangan primer P338F-GC/ P518R dengan panjang amplikon ±180 bp (Gambar 3b) M P0 K0 P60 K60 P120 K120 M P0 K0 P60 K60 P120 K bp 300 bp 200 bp 100 bp ±343 bp 500 bp 300 bp 200 bp 100 bp ±180 bp (a) (b) Gambar 3 Hasil amplifikasi PCR (a) gen nifh (b) 16S rrna (M: penanda berat molekul DNA, P0: Perlakuan pupuk hayati 0 HST, K0: kontrol 0 HST, P60: perlakuan 60 HST, K60: kontrol 60 HST, P120: perlakuan 120 HST, K120: kontrol 120 HST, HST: hari setelah tanam).

25 Profil DGGE Secara umum penggunaan DGGE dapat memisahkan banyak pita DNA baik nifh maupun 16S rrna. Masing- masing pita yang terpisah menunjukkan perbedaan spesies bakteri tanah. Analisis DGGE gen nifh pada 6 sampel tanah menghasilkan pita DGGE yang cukup beragam. Terdapat 9 pita DGGE nifh yang selalu muncul pada tiap waktu pengambilan sampel (Gambar 4a). Sembilan pita tersebut kemudian dilakukan PCR ulang guna dianalisis sekuen DNAnya. 11 (a) P0 P60 K120 K0 K60 P120 (b) Gambar 4 (a) Profil DGGE gen nifh dari sampel tanah sawah (kiri). Interpretasi hasil DGGE berdasarkan perangkat lunak CLIQS 1D (kanan). Pita no. 1-9 dipotong untuk analisis selanjutnya. (b) Dendrogram hasil analisis pengelompokan (Clustering) keragaman bakter pemfiksasi nitrogen berdasarkan gen nifh (P0: Perlakuan pupuk hayati 0 HST, K0: kontrol 0 HST, P60: perlakuan 60 HST, K60: kontrol 60 HST, P120: perlakuan 120 HST, K120: kontrol 120 HST). DGGE= denaturing gel gradient electrophoresis; HST= hari setelah tanam.

26 12 Analisis pengelompokan disajikan dalam bentuk dendogram (Gambar 4b). Data tersebut berdasarkan perbedaan keragaman bakteri pada tiap waktu pengambilan sampel (P0, K0, P60, K60, P120 dan K120). Dendogram tersebut menggambarkan pola keramgan bakteri berdasrkan waktu pertumbuhan padi. P0, P60, K60 dan K120, dan K0, K60 dan P120 berada pada 2 cluster yang berbeda. Secara umum 0 HST merupakan fase vegetatif padi, 60 HST merupakan awal fase genereatif dan 120 HST merupakan fase pematangan. Adapun hasil DGGE dari gen16s RNA diperoleh pita DGGE yang lebih beragam dibandingkan DGGE gen nifh. 16S rrna digunakan untuk menganalisa total bakteri yang ada pada tanah sawah. Pasangan primer yang digunakan yakni P338F/P518R menghasilkan amplikon sebesar 180 bp. Berdasarkan profil DGGE 16S rrna, berhasil didapatkan 20 pita berbeda yang kemudian dilakukan PCR kembali dan analisa sekuens (Gambar 5a). Analisis pengelompokan (clustering) berdasarkan 16S rrna menunjukkan keragaman total bakteri pada tiap waktu pengambilan sampel memiliki kemiripan, yakni P120- K120, P60- K60 dan P0- K0 (Gambar 5b). Ketersediaan nutrisi pada fase tersebut menyebabkan adanya perbedaan tingkat keragaman bakteri. Misalnya pada P0- K0, pada awal penanaman kedua petak lahan memiliki keragaman bakteri yang tidak jauh berbeda. Pada P6- K60, fase tersebut merupakan akhir fase vegetatif (reproduktif awal), kebutuhan nutrisi tanaman sangat tinggi, selain itu banyak disekresikan eksudat akar yang merupakan nutrisi bagi bakteri tanah. Adapun P120- K120 merupakan fase pematangan, pada fase ini kebutuhan nitrogen tanaman semakin menurun dan eksudat akar yang dihasilkan juga semakin menurun. (a)

27 13 P60 K60 P0 K0 P120 K120 (b) Gambar 5 (a) Profil DGGE 16S rrna dari sampel tanah sawah (kiri). Interpretasi hasil DGGE dengan perangkat lunak CLIQS 1D (kanan). 20 pita dipotong untuk dilakukan analisa sekuens. (b) Analisis pengelompokan (Clustering) keragaman bakteri berdasarkan 16s rrna (P0: Perlakuan pupuk hayati 0 HST, K0: kontrol 0 HST, P60: perlakuan 60 HST, K60: kontrol 60 HST, P120: perlakuan 120 HST, K120: kontrol 120 HST). DGGE= denaturing gel gradient electrophoresis; HST= hari setelah tanam. Analisis BLAST dan Filogenetik Pita DGGE yang dipotong kemudian dilakukan elusi guna digunakan sebgai templat pada proses re-pcr dengan primer non GC clamp. Sebanyak 9 pita DGGE nifh dan 20 pita DGGE 16S rrna digunakan dalam analisis selanjutnya. Hasil re- PCR didapatkan pita tunggal dengan target amplikon sesuai dengan PCR sebelum DGGE yakni 347 bp untuk gen nifh (Gambar 4) dan 180 bp untuk 16S rrna (Gambar 5). M 500 bp 400 bp ± 343 bp 300 bp 200 bp 100 bp Gambar 6 Hasil amplifikasi ulang gen nifh dengan primer PolF/ AQER (non GC) (M: penanda berat molekul DNA)

28 14 M 300 bp 200 bp 100 bp ± 180 bp Gambar 7 Hasil amplifikasi ulang gen 16S rrna dengan primer P338F/ P518R (non GC) (M: penanda berat molekul DNA) Analisis lanjutan yang dilakukan yaitu analisis sekuen menggunakan perangkat lunak Chromas Pro. Sekuen yang telah dianalisis kemudian dibandingkan dengan database yang terdapat pada Genebank melalui perangkat BLAST-N (Basic Local Alignment Tools- Nucleotide). Hasil yang didapatkan yaitu 9 pita DGGE mayoritas teridentifikasi sebagai uncultured bacterium. Namun terdapat 3 pita DGGE yang teridentifikasi sebagai Pelomonas saccahophila (pita 1) dengan persentase kesamaan 92%, Sphingomonas sp. (pita 2) dengan persentase kesamaan 91% dan Magnetospirillum sp. BB-1 (pita 8) dengan persentase (Tabel 3). Tabel 3 Hasil BLAST-N dari sekuen gen nifh Pita Deskripsi Query cover E- value Identitas No. Akses 1 Pelomonas saccharophila nifh gene for iron protein of nitrogenase, partial cds, strain IAM % 2,00E % AB Sphingomonas sp. BR12260 (nifh) gene, partial cds 78% 4,00E-82 91% FJ Uncultured bacterium nifh gene for nitrogenase iron protein, partial cds, clone SB06 92% 6,00E-80 89% AB Uncultured bacterium clone N320 dinitrogenase reductase gene, partial cds 43% 1,00E-17 81% KR Uncultured bacterium clone P dinitrogenase reductase (nifh) gene, partial cds 99% 6,00E-80 85% JX Uncultured nitrogen-fixing bacterium clone N060 dinitrogenase reductase (nifh) gene, partial cds 99% 3,00E-91 83% DQ

29 15 Pita Lanjutan Tabel 3 Deskripsi 7 Ideonella dechloratans nitrogenase Fe protein (nifh) gene, partial cds 8 Magnetospirillum sp. BB-1 nitrogenase (nifh) gene, complete cds 9 Uncultured soil bacterium clone CY8-35 nitrogenase iron protein (nifh) gene, partial cds Query cover E- value Identitas No. Akses 99% 2,00E % EU % 1,00E % KP % 1,00E % GU Selain BLAST-N, sekuen DNA nifh dikonfirmasi kembali menggunakan BLAST-X. Perangkat lunak BLAST- X digunakan guna membandingkan sekuen DNA hasil DGGE dengan database protein yang ada pada Genebank. Berdasarkan hasil BLAST-X diketahui secara umum sekuen DNA hasil DGGE merupakan pengkode protein dinitrogenase reduktase (Fe- protein) (Tabel 4). Sesuai dengan analisis menggunakan BLAST-N, hasil yang didapatkan pada BLAST-X mayoritas sekuen nifh merupakan uncultured bacterium. Nilai persentase kesamaan yang didapatkan sangat bervariasi yakni 67%- 100%. Analisis pensejajaran (alignment) berdasarkan asam amino dilakukan guna mengetahui bagian yang bersifat conserved antara pita DNA gen nifh hasil DGGE dengan hasil yang didapatkan pada Genebank. Sekuen yang digunakan merupakan sekuen nukeleotida hasil BLAST-N yang kemudian ditranslasikan. Hasil pensejajaran menunjukkan adanya daerah yang memiliki kesamaan sekuen asam amino antara pita DNA nifh hasil DGGE dengan database dari Genebank (Lampiran 4). Hasil pensejajaran tersebut kemudian dikonfirmasi pada Conserved Domain Database ( (Bauer et al. 2015). Guna mengetahui domain yang bersifar conserved tersebut. Tabel 4 Hasil BLAST-X dari sekuen nifh Pita Deskripsi Query cover E value Identitas No. Akses 1 dinitrogenase reductase [uncultured nitrogen-fixing bacterium] 99% 6,00E-45 67% AAU nitrogenase iron protein [uncultured bacterium] 80% 1,00E-39 86% AFP dinitrogenase reductase [uncultured bacterium] 53% 8,00E-22 94% AGR dinitrogenase reductase [uncultured prokaryote] 27% 4,6 78% ADD nitrogenase iron protein [uncultured bacterium] 99% 5,00E-55 96% ACI

30 16 Pita Lanjutan Tabel 4 Deskripsi 6 dinitrogenase reductase [uncultured nitrogen-fixing bacterium] 7 nitrogenase reductase [Sphaerotilus natans] 8 nitrogenase iron protein, dinitrogenase reductase [Magnetospirillum sp. XM- 1] 9 dinitrogenase reductase [temperate forest soil bacterium AC06] Query cover E value Identitas No. Akses 99% 9,00E-71 94% ABD % 4,00E % WP_ % 1,00E-33 98% CUW % 1,00E-74 98% AAL Analisis filogenetik menggunakan perangkat lunak Mega 6.0 (Tamura et al. 2013), dengan metode neighbour joining, penentuan jenis pohon dilakukan berdasarkan nilai BIC (Bayesian Information Criterion) yang paling rendah. Gambar 8 Pohon filogenetik gen nifh (neighbour joining tree) menggunakan Tamura- 3 parameter model (Bootstrap 1000x) Berdasarkan analisis filogenetik tersebut terdapat 3 pita DNA yang teridentifikasi pada jenis bakteri tertentu yaitu pita 2 yang diduga sebagai Sphingomonas sp., pita 7 yang teridentifikasi sebagai Ideonella dechloratans dan pita ke-8 yang teridentifikasi sebagai Magnetospirillum sp. Nilai bootstrap support yang terdapat pada pita ke-7 dan ke-8 di atas 50, sehingga tingkat kemiripannya tinggi. Adapun nilai bootstrap support pada pita ke 2 di bawah 50 (tidak ditampilkan).

31 Selain gen nifh digunakan juga 16S rrna guna mengetahui total komunitas bakteri tanah pada lahan padi. Analisis sekuen DNA dilakukan terhadap 20 pita berbeda dari hasil DGGE. Hasil BLAST-N menunjukkan berbagai jenis bakteri yang berkerabat dekat. Tingkat kesamaan yang didapatkan juga bervariasi dengan query coverage yang cukup tinggi (Tabel 5). Tabel 5 Hasil BLAST-N dari 16S rrna Pita Deskripsi 1 Uncultured bacterium isolate DGGE gel band A28 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2 Uncultured Methylocystis sp. isolate DGGE gel band b1-1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 3 Thioploca ingrica partial 16S rrna gene and ITS1, isolate DEN002 4 Uncultured gamma proteobacterium clone P-B262 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 5 Shigella sp. FC13 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 6 Uncultured Bacteroidetes bacterium clone 1HP1-L22 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 7 Clostridium sp. enrichment culture isolate DGGE gel band Mn-40.2-IRE24-Co 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 8 Uncultured Bacteroidetes bacterium clone Paddy S ribosomal RNA gene, partial sequence 9 Uncultured Chloroflexi bacterium clone BTM22 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 10 Uncultured Chloroflexi bacterium clone RUGL S ribosomal RNA gene, partial sequence Query cover E- value Identitas No. Akses 17 99% 3,00E-48 91% GQ % 2,00E-31 88% GU % 1,00E-87 98% FR % 5,00E-85 98% JN % 2,00E % KU % 8,00E-18 77% EU % 5,00E-39 86% KR % 9,00E-36 94% JF % 4,00E-72 97% KF % 5,00E-38 92% GQ

32 18 Lanjutan Tabel 5 Pita Deskripsi 11 Uncultured Chloroflexi bacterium clone 222BC 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 12 Phaeospirillum sp. JA815 partial 16S rrna gene, strain JA Uncultured alpha proteobacterium clone GASP- 16KB-350-F08 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 14 Magnetospirillum sp. enrichment culture clone Van20 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 15 Azospirillum brasilense strain UENF S ribosomal RNA gene, partial sequence 16 Azospirillum oryzae strain UENF S ribosomal RNA gene, partial sequence 17 Uncultured bacterium clone SPA-6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 18 Uncultured Gemmatimonadetes bacterium clone S S ribosomal RNA gene, partial sequence 19 Uncultured bacterium isolate DGGE gel band 61 16S ribosomal RNA gene, partial 20 Uncultured Rhizobiales bacterium clone CNY_ S ribosomal RNA gene, partial sequence Query cover E- value Identitas No. Akses 100% 3,00E-67 95% EU % 2,00E-49 97% HG % 3,00E-68 95% EU % 8,00E % HQ % 9,00E % KU % 8,00E % KU % 6,00E-38 88% JQ % 6,00E-71 95% KF % 7,00E-43 89% JF % 9,00E-29 85% JQ Secara umum persentase kesamaan sekuen hasil DGGE dengan target pada database Genebank yaitu %. Sebanyak 13 sekuen DGGE memiliki kesamaan dengan uncultured bacterium sedangkan 7 sekuen yang lain memiliki kesamaan dengan Shigella sp., Clostridium sp., Magnetospirillum sp. Azospirillum brasilense, Azospirillum oryzae, Thioploca ingrica dan Phaeospirillum sp. (Tabel 5). Adapun analisis filogenetik berdasarkan gen pengkode 16S rrna didapatkan hasil pengelompokan jenis bakteri berdasarkan filumnya. Pohon filogenetik dikonstruksi dengan neighbour joining tree model Jukes Cantor model

33 dengan bootstrap 1000x. Mayoritas bakteri yang teramplifikasi merupakan filum Proteobacteria, Chlorofexi, Gemmatimonadetes, Clostridia, dan Bacteroidetes (Gambar 9). Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, merupakan 2 subfilum yang muncul pada hasil DGGE dari tanah sawah. Selain itu Alphaproteobacteria menjadi kelompok yang paling banyak muncul pada tanah sawah. 19 Gambar 9 Pohon filogenetik (neighbour joining tree) 16S rrna menggunakan Jukes-Cantor model dengan bootstrap 1000x.

34 20 Pembahasan Ekstraksi DNA dan Amplifikasi DNA nifh dan 16 s rrna Ekstrasi DNA menggunakan TianAmp Soil DNA kit (Tiangen Biotech, Beijing, CN) menghasilkan produk total DNA dengan kemurnian yang rendah, DNA maupun RNA murni memiliki nilai A260/A80 berkisar dan nilai A260/230 lebih dari 2.0 (Yeates et al. 1998; Sambrook dan Russell 2001). A280 merupakan panjang gelombang untuk untuk protein, A260 untuk DNA dan A230 untuk phenol, maupun humic acid. Nilai A260/280 pada ekstrak DNA lahan sawah melebihi 3.0 (Tabel 2) yang mengindikasikan adanya kontaminan pada hasil ekstrak DNA. Kontaminasi asam humat (humic acid) pada tanah dapat mengganggu proses kuantifikasi DNA, karena asam humat juga terbaca baik pada A230 nm maupun A260 nm (Yeates et al. 1998). Selain itu nilai A260/A30 sangat rendah yaitu , nilai tersebut menunjukkan adanya molekul- molekul asam humat atau yang semacamnya (Humic acid-like) yang terdeteksi pada serapan panjang gelombang A230. Amplifikasi DNA gen nifh menggunakan pasangan primer PolF/AQER menghasilkan target 343 bp. Gen nifh merupakan gen yang umum dalam analisis komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen (diazotrof), selain itu gen nifh memiliki keragaman yang lebih tinggi dibandingkan dengan gen nifd, sehingga pustaka gen nifh lebih banyak dibandingkan dengan nifd (Dedysh et al. 2004). Menurut Diallo et al. (2004) diazotrof aktif yang ada pada tanah umumnya sedikit, sehingga untuk analisis diazotrof menggunakan gen nifh disarankan menggunakan pendekatan nested PCR dibandingkan direct PCR Adapun primer yang digunakan untuk mengamplifikasi 16S rrna yaitu P338F/ P518R (Ovreas et al. 1997). Primer ini mengamplifikasi region V3 pada 16S rrna. 16S rrna memiliki 9 region (V1- V9). Secara umum region V2 dan V3 merupakan region yang paling tepat untuk membedakan berbagai jenis bakteri pada tingkat genus. Region V2 memiliki panjang basa 106 nukleotida sedangkan V3 memiliki panjang 65 nukleotida (Chakravorty et al. 2007). Pada penelitian ini digunakan region V3 karena region V3 lebih dapat membedakan berbagai jenis bakteri dibandingkan region V2. Pada pengujian terhadap 110 spesies bakteri region V3 menghasilkan single nucleotide polimorphism (SNIPs) yang lebih banyak dibandingkan V2. Selain itu region V3 yang lebih pendek lebih cocok digunakan dalam analisis menggunakan real time PCR (Chakravorty et al. 2006; 2007). Profil DGGE dan Analisis Filogenetik nifh Profil DGGE (Gambar 4) menunjukkan keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada tiap- tiap fase pertumbuhan padi. Menurut Zhan dan Sun (2011) fase pertumbuhan padi, eksudat akar dan perubahan iklim dapat mempengaruhi suksesi komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen. Berdasarkan dendogram analisis pengelompokan (clustering) diketahui pola keramgan bakteri berdasrkan waktu pertumbuhan padi. P0, P60, dan K120, dan K0, K60 dan P120 berada pada 2 cluster yang berbeda. Secara umum 0 HST merupakan fase vegetatif padi, 60 HST merupakan awal fase genereatif dan 120 HST merupakan fase pematangan. P0- P60 berada pada 1 cluster mengindikasikan kemiripan tingkat keragman bakteri pada fase vegetatif. Kebutuhan nitrogen pada fase tersebut (fase vegetatif) merupakan

35 yang paling tinggi. Menurut Ramanathan dan Krishnamoorthy (1973) kebutuhan nitrogen tanaman paling tinggi yaitu pada fase vegetatif, fase semai dan yang paling rendah yaitu pada fase pematangan. Jika dilihat pada pita DGGE (gambar 3a) P0 dan P60 memiliki pita DGGE lebih sedikit dibandingkan pada P120, diduga hal tersebut dipengaruhi oleh dua faktor, yaitu adanya 20% dosis pupuk NPK yang dapat dimanfaatkan tanaman sehingga keragaman bakteri pada P0 dan P60 lebih rendah. Selain itu aktivitas fiksasi N yang lebih tinggi meskipun keragaman bakterinya lebih rendah. Adapun K120 menjadi 1 kelompok dengan P0 dan P60 disebabkan karena terdapat kemiripan pita DGGE yang hanya muncul pada K120, P0 dan P60. Hal tersebut diduga disebabkan pada fase pematangan nitrogen dari pupuk kimia yang diaplikasikan pada perlakuan kontrol sudah mulai habis, sehingga beberapa bakteri pemfksasi nitrogen dapat tumbuh lebih banyak (pita DGGE muncul pada K120) dan melakukan aktivitas fiksasi nitrogen. K60- P120 berada dalam 1 cluster, pada fase terdapat beberapa jenis bakteri yang hanya muncul pada kedua perlakuan. Selain itu K0 beraada 1 cluster dengan K60- P120, karena pada K0 terdapat keragaman bakteri paling tinggi (ditunjukkan dari banyaknya pita DGGE) yang disebabkan oleh tingginya nutrisi pada tanah karena aplikasi 100% dosis pupuk kimia. Menurut Prakamhang (2009) fase pertumbuhan padi dapat mempengaruhi komunitas bakteri pemfiksasi nitrogen, pada fase semai keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen lebih rendah dibandingkan dengan fase vegetatif, kemudian ketika memasuki fase reproduktif keragaman bakteri kembali menurun. Penelitian sebelumnya oleh Sukmawati et al. (2015) perlakuan pupuk hayati meningkatkan pertumbuhan dan produktivitas padi. Namun pada penelitian ini secara umum keragaman bakteri pada perlakuan tersebut lebih rendah dibandingkan kontrol, sehingga diduga keragaman bakteri yang tinggi pada perlakuan kontrol tidak selaras dengan aktivitas fiksasi nitrogennya (tidak semua bakteri aktif memfiksasi nitrogen). Guna mengetahui tingkat aktivitas bakteri pemfiksasi nitrogen diperlukan analisis berdasarkan mrna dari gen nifh. Hasil BLAST-N pada gen nifh menunjukkan mayoritas sekuen yang didapatkan berkerabat dekat dengan uncultured bacterum (Tabel 3) dengan nilai kesamaan 81-95%. Penggunaan BLAST-N bertujuan untuk membandingkan sekuen DNA nifh hasil DGGE dengan gen nifh yang ada pada database Genebank. Selain BLAST-N digunakan juga BLAST-X yang berguna untuk mengkonfirmasi apakah sekuen DNA hasil DGGE merupakan gen pengkode enzim dinitrogenase reductase (Fe-protein). Hasil BLAST-X (Tabel 4) menunjukkan semua sekuen DNA hasil DGGE merupakan sekuen gen nifh pengkode enzim nitrogenase reduktase. Adanya perbedaan Hasil BLAST-X dan BLAST-N disebabkan oleh perbedaan database yang digunakan pada Genebank, BLAST-X menggunakan database asam amino, sedangkan BLAST-N menggunaakan database nukleotida, sehingga hasil yang didapatkan tidaklah sama persis antara kedua analisis tersebut. Selain BLAST-X hasil juga dilakukan pensejajaran berdasarkan asam amino. Pensejajaran dilakukan guna mengetahui daerah yang memiliki kesamaan antara sekuen nifh hasi DGGE dengan sekuen asam amino nifh dari Genebank (berdasarkan hasil BLAST-N yang ditranslasikan) (Lampiran 4). Berdsarkan hasil konfirmasi menggunakan Corserved Domain Database (Bauer et al. 2015). Sekuen asam amino nifh yang memiliki kesamaan tersbeut merupakan domain P-loop 21