VARIASI GENETIK ROTAN BERDASARKAN PENANDA DNA BARCODE matk, rbcl dan ITS PADA PANGKALAN DATA GENBANK MIRANTI ARUM PUTRI

Transkripsi

1 VARIASI GENETIK ROTAN BERDASARKAN PENANDA DNA BARCODE matk, rbcl dan ITS PADA PANGKALAN DATA GENBANK MIRANTI ARUM PUTRI DEPARTEMEN SILVIKULTUR FAKULTAS KEHUTANAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

2

3 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Variasi Genetik Rotan Berdasarkan Penanda DNA Barcode matk, rbcl dan ITS Pada Pangkalan Data GenBank adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Juli 2015 Miranti Arum Putri NIM E

4 ABSTRAK MIRANTI ARUM PUTRI. Variasi Genetik Rotan Berdasarkan Penanda DNA Barcode matk, rbcl dan ITS Pada Pangkalan Data GenBank. Dibimbing oleh ISKANDAR Z. SIREGAR. Identifikasi jenis rotan biasa dilakukan dengan melihat karakteristik morfologi. Seiring dengan berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, mulai diterapkan ilmu biomolekuler sebagai alat pelengkap identifikasi jenis, salah satunya adalah DNA barcoding. Pada tanaman kehutanan keduanya masih jarang diterapkan sebagai komplementer karena keterbatasan data molekuler. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis struktur genetik tanaman rotan berdasarkan tiga penanda yang ada pada pangkalan data genetik (NCBI) yaitu matk, rbcl dan ITS. Pengolahan data dilakukan menggunakan perangkat lunak MEGA dan DnaSP. Dari hasil analisis diketahui bahwa penanda ITS memiliki sekuens yang lebih panjang yaitu diatas 500 bp dan GC content (%) paling besar yaitu 63.1%. Konstruksi filogenetik yang dilakukan belum menunjukkan penanda yang paling akurat dalam mendiskriminasi spesies karena spesies yang berbeda masih dikelompokkan dalam satu clade. Analisis variasi nukleotida dilakukan untuk mengetahui lebih lanjut penanda yang mendekati akurat untuk membedakan spesies. Secara keseluruhan belum dapat dipastikan penanda yang paling baik untuk mendiskriminasi tanaman rotan. Kata kunci: analisis molekuler, DNA Barcode, penanda genetik, rotan. ABSTRACT MIRANTI ARUM PUTRI. Genetic Variation of Rattan Based DNA Barcode Marker matk, rbcl and ITS On Database GenBank. Supervised by ISKANDAR Z. SIREGAR. Species identification of rattan is usually done by assessing morphological characteristics. Along with the development of science and technology, biomolecular science began to be applied as a complementary tool identification, one of which is DNA barcoding technique. In the forestry both are still rarely applied as complementary to each other because of limited molecular data. This study was aimed to analyze the genetic structure of various rattan by three DNA Barcode markers that are available in the genetic database (NCBI), namely matk, rbcl and ITS. Data processing was performed using software MEGA and DnaSP. The results showed that markers of ITS have a longer sequence that is above 500 bp and higher GC content (%) 63.1% compared to the others. Constructed phylogeny trees do not show the most accurate marker in discriminating species because different species are still grouped into one clade. Nucleotide variation analysis was conducted to determine more accurate marker based on genetic variation approach to differentiate Calamus and non-calamus. However, uncertainty in discriminating species was still observed. Keywords: DNA Barcode, genetic markers, moleculer analysis, rattan.

5 VARIASI GENETIK ROTAN BERDASARKAN PENANDA DNA BARCODE matk, rbcl dan ITS PADA PANGKALAN DATA GENBANK MIRANTI ARUM PUTRI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kehutanan pada Departemen Silvikultur DEPARTEMEN SILVIKULTUR FAKULTAS KEHUTANAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

6

7

8 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia- Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2015 ini ialah DNA BARCODING dengan judul Variasi Genetik Rotan Berdasarkan Penanda DNA Barcode matk, rbcl dan ITS Pada Pangkalan Data GenBank. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Iskandar Z. Siregar MForSc selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada staff dan para peneliti di Laboratorium Silvikultur Bagian Genetika Kehutanan yang telah memberi saran dan membantu dalam pelaksanaan penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada angkatan Departemen Silvikultur tahun 2010, teman-teman Fakultas Kehutanan 47, senior dan junior di Fakultas Kehutanan atas dukungannya dan kepada ayah, ibu, seluruh keluarga dan saudara Prehadi atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Juli 2015 Miranti Arum Putri

9 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL vi DAFTAR GAMBAR vi DAFTAR LAMPIRAN vi PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Tujuan Penelitian 2 Manfaat Penelitian 2 METODE 3 Alat 3 Bahan 3 Prosedur Analisis Data 3 HASIL DAN PEMBAHASAN 4 Struktur Genetik 4 Identifikasi efisiensi penanda menggunakan BLAST 6 Hubungan filogenetik 6 Variasi nukleotida 10 SIMPULAN DAN SARAN 11 Simpulan 11 Saran 11 DAFTAR PUSTAKA 11 LAMPIRAN 13 RIWAYAT HIDUP 51

10 DAFTAR TABEL 1 Panjang sekuens basa (bp) pada ketiga penanda genetik 5 2 Persentase GC content (%) pada ketiga penanda genetik 5 3 Identifikasi efisiensi tiga penanda menggunakan BLAST 6 4 Variasi nukleotida genus Calamus dan Non Calamus pada ketiga penanda 10 DAFTAR GAMBAR 1 Konstruksi filogenetik berdasarkan lokus matk 7 2 Konstruksi filogenetik berdasarkan lokus rbcl 8 3 Konstruksi filogenetik berdasarkan lokus ITS 9 DAFTAR LAMPIRAN 1 Hasil pengurutan basa nukleotida (sequencing) rotan pada penanda matk 13 2 Hasil pengurutan basa nukleotida (sequencing) rotan pada penanda rbcl 26 3 Hasil pengurutan basa nukleotida (sequencing) rotan pada penanda ITS 41

11 PENDAHULUAN Latar Belakang Rotan termasuk ke dalam family Palmae yang tumbuh memanjat dan banyak tersebar di beberapa daerah beriklim tropis sampai sub tropis seperti Afrika, India, Srilanka, kaki pegunungan Himalaya, China bagian Selatan, Malaysia, Indonesia, Pasifik bagian Barat sampai Fiji. Rotan yang ditemukan di seluruh dunia tersebut digolongkan berdasarkan marga, saat ini terdapat 15 marga rotan. Keanekaragaman jenis rotan di Indonesia sendiri mencapai sekitar 306 jenis dimana terdapat 40 jenis rotan yang bernilai ekonomi penting. Beberapa jenis rotan banyak dijumpai tumbuh liar di hutan Indonesia ataupun dibudidayakan oleh manusia untuk kepentingan ekonomi (Dransfield dan Manokaran 1993). Rotan yang umum dijumpai di Indonesia yaitu berasal dari marga Calamus, Calospatha, Ceratolobus, Daemonorops, Korthalsia, Myrialepis, Plectocomia dan Plectocomiopsis. Identifikasi jenis rotan biasanya dilakukan dengan melihat karakteristik morfologi berupa jumlah batang per rumpun, sistem perakaran, bentuk alat pemanjat, bentuk perkembangan dari daun, bunga dan buah (Dransfield dan Manokaran 1993). Terdapat kelemahan tersendiri dalam mengidentifikasi jenis rotan melalui visual karakteristik morfologi yaitu diperlukan ahli taksonomi atau sumberdaya manusia yang berpengalaman karena terdapat beberapa jenis rotan yang memiliki karakteristik morfologi yang sama sehingga apabila identifikasi dilakukan oleh pemula, hasil identifikasi cenderung subjektif. Seiring dengan berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, mulai dikenal ilmu biomolekuler untuk makhluk hidup, salah satunya yang banyak dikembangkan adalah DNA barcoding. DNA Barcoding adalah penggunaan region DNA standar berukuran pendek, sebagai penanda untuk identifikasi spesies yang cepat dan akurat (Valentini 2009). Teknik DNA barcoding dapat mengidentifikasi dan membedakan suatu organisme mulai tahap spesies hingga sub spesies. Keunggulan teknik DNA barcoding yaitu dapat digunakan untuk identifikasi dan karakterisasi berbagai spesies yang tidak dapat dibedakan secara morfologi (Tudge 2000). Teknik DNA barcoding dapat digunakan utuk identifikasi suatu organisme walaupun DNA dari organisme tersebut tidak dalam bentuk murni atau utuh, bahkan DNA yang sudah mengalami degradasi dan proses pengolahan pun dapat digunakan untuk analisis DNA barcoding (Hajibabaei et al. 2006). Pengenalan berbagai tanaman dapat dilakukan dengan hanya mengambil sedikit bagian saja dari tubuh tanaman, tanpa harus mengamati morfologinya. Cara ini dianggap cukup sederhana karena tidak diperlukan banyak spesimen dari lapang, akan tetapi dibutuhkan keterampilan pada saat melakukan analisis di laboratorium. Analisis rotan secara genetik dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler. Penanda molekuler merupakan fragmen sekuen DNA yang berhubungan dengan bagian genom pembawa gen yang bertanggung jawab terhadap suatu karakter tertentu (Bagali et al 2010). Penanda molekuler bekerja dengan cara memberi tanda pada bagian sekuen DNA yang mengalami polimorfisme atau bentuk lain dari individu yang berlainan. Perbedaan tersebut meliputi insersi, delesi, translokasi, duplikasi dan mutasi titik. Penanda molekuler

12 2 ini bersifat stabil, dapat terdeteksi pada semua jaringan tanpa dipengaruhi oleh status pertumbuhan, diferensisai, perkembangan maupun sistem pertahanan sel (Mondini et al 2009). Menurut Yu et al (2011), kesulitan dalam memilih gen spesifik untuk digunakan sebagai DNA barcoding tanaman disebabkan oleh ketidaksempurnaan dari setiap gen pada tanaman, baik kloroplas, mitokondria atau inti genom. Gen yang terdapat pada mitokondria tanaman perkembangannya lambat, sehingga tidak efektif untuk membedakan antar spesies tanaman yang berbeda. CBOL (Consortium Barcode of Life) dari kelompok kerja tanaman merekomendasikan pemakaian gen pada kloroplast yaitu ribulosa-1, 5-bifosfat karboksilase oksigenase subunit besar (rbcl) dan maturase K (matk) sebagai barcode standar pada tanaman (CBOL 2009). Penanda genetik yang biasa digunakan peneliti untuk tanaman adalah marka rbcl (ribulose 1,5-biphospate carboxylase large subunit), matk (megakaryocyte-associated tyrosine kinase) dan ITS (internal transcribed spacer). Sejauh ini sudah tersedia database tanaman rotan yang terdapat di GenBank, khususnya penanda rbcl, matk maupun ITS yang berfungsi sebagai DNA Barcode. Walaupun demikian masih terdapat masalah dari ketiga penanda tersebut yaitu belum diketahui jenis penanda yang paling baik dan tepat untuk mendiskrimasi suatu spesies. Penelitian ini mencakup kegiatan koleksi dan pengolahan seluruh data genetik rotan yang ada pada GenBank ( Data genetik tersebut akan diolah untuk mendapatkan suatu pohon filogeni berdasarkan masing-masing penanda sehingga dapat dilakukan analisis penanda yang baik untuk mendiskriminasi spesies. Tujuan Penelitian Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk: 1. Mengeksplorasi ketersediaan DNA Barcode (matk, rbcl dan ITS) untuk tanaman rotan pada pangkalan data GenBank. 2. Menganalisis variasi genetik berdasarkan ragam parameter pada masing-masing penanda tersebut untuk diskriminasi spesies. Manfaat Penelitian Manfaat dilakukannya penelitian ini adalah: 1. Memberikan informasi tentang ketersediaan data sekuens rotan yang terdapat pada pangkalan data GenBank. 2. Memberikan informasi mengenai penanda yang baik untuk diskriminasi spesies rotan.

13 3 METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilakukan pada Bulan Januari-April Analisis dan pengolahan data dilakukan di Laboratorium Silvikultur, Bagian Genetika Hutan, Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa perangkat lunak MEGA (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) 6.0 dan DnaSP (DNA Sequence Polymorphism) (Tamura et al. 2011). Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini berupa koleksi data genetik rotan (matk, rbcl dan ITS) yang berada pada pangkalan data GenBank Internasional ( Data yang diambil adalah data rotan dari genus Calamus, Ceratolobus, Daemonorops, Korthalsia, Myrialepis dan Plectocomia. Data sekuens masing-masing penanda terlampir pada Lampiran 1, 2 dan 3. Prosedur Analisis Data Struktur Genetik Analisis dilakukan pada data tanaman rotan yang didapatkan dari database GenBank. Data yang digali (data mining) merupakan data hasil DNA barcoding tiga penanda genetik yang dapat digunakan pada tanaman yaitu matk, rbcl dan ITS. Data yang didapatkan diolah menggunakan program MEGA (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) 6.0. Program MEGA memiliki tools yang mampu bekerja dalam pembacaan urutan DNA, analisis statistik DNA baik urutan basa nukleotida atau protein dan penjajaran urutan satu sampel dengan sampel lainnya menggunakan ClustalW (Kumar et al. 2008). Terlebih dahulu dilakukan alignment atau penyejajaran seluruh sekuens basa untuk dapat memudahkan dilakukan trim atau pemotongan basa yang tidak diperlukan. Kemudian sekuens basa dianalisis panjang basa (bp) dan juga komposisi nukleotidanya menggunakan tools > analysis models > compute nucleotide composition pada perangkat lunak MEGA 6.0.

14 4 Identifikasi efisiensi penanda menggunakan BLAST Identifikasi efisiensi penanda dilakukan untuk mengetahui keakuratan suatu penanda dalam membedakan spesies. Analisis ini dilakukan dengan menggunakan tools yang terdapat pada pangkalan data NCBI (National Center for Biodtechnology Information) yaitu BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) dengan memasukkan data sekuens setiap spesies ke dalam kolom yang terdapat pada laman web BLAST yang kemudian akan terverifikasi persen kekerabatan suatu spesies. Hubungan filogenetik Rekonstruksi filogenetik mampu menganalisa jarak gen melalui variasi DNA dengan metode Neighbor Joining Tree yang mampu memperhitungkan jarak kedekatan yang ditunjukkan dengan nilai bootstrap (Ward et al. 2008). Analisis dilakukan menggunakan program MEGA 6.0 dengan menggunakan tools > analysis phylogeny > construct/test Neighbor Joining Tree(s). Variasi nukleotida genus Calamus dan Non Calamus Analisis ini dilakukan untuk mengetahui keragaman pada masing-masing penanda agar dapat diketahui penanda yang baik untuk diskriminasi spesies. Program yang digunakan adalah DnaSP 5 (DNA Sequence Polymorphism). HASIL DAN PEMBAHASAN Struktur Genetik Hasil analisis data genetik penanda molekuler matk, rbcl dan ITS pada database GenBank, didapatkan sebanyak 43 spesies dari 89 individu pada lokus matk, 50 spesies dari 95 individu pada lokus rbcl dan 24 spesies dari 58 individu pada lokus ITS. Sekuens basa tiap individu kemudian dikelompokkan berdasarkan spesies terlebih dahulu, kemudian dikelompokkan lagi berdasarkan masingmasing genus untuk memudahkan analisis pada software. Data tersebut diolah menggunakan aplikasi perangkat lunak MEGA (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) 6.0, dengan terlebih dahulu dilakukan alignment untuk menyejajarkan urutan basa semua individu dan untuk memudahkan dilakukan trim yaitu pemotongan atau penghapusan basa. Proses alignment dan trim menghasilkan urutan rantai basa nukleotida ratarata pada lokus matk sebesar bp, bp pada lokus RbcL dan bp pada lokus ITS. Data panjang sekuens basa yang didapat dari hasil pengolahan program MEGA 6.0 kemudian dibuat ke dalam Microsoft excel dan dibuat tabel. Data panjang sekuens basa ketiga penanda disajikan pada Tabel 1.

15 5 Tabel 1 Panjang sekuens basa (bp) pada ketiga penanda genetik matk rbcl ITS No. Genus n bp n bp n bp 1 Calamus Ceratolobus Daemonorops Korthalsia Myrialepis Plectocomia Rata-rata Keterangan: n = jumlah sekuens bp= base pair atau jumlah pasang basa Tabel 1 menunjukkan pada penanda matk tidak terdapat data genus Daemonorops dan Myrialepis. Penanda matk memiliki rata-rata panjang sekuens lebih kecil dibanding kedua penanda lainnya. Panjang basa pada rbcl keseluruhan tidak berbeda secara signifikan, ini disebabkan pada masing-masing genus hanya terdapat satu sekuens individu sehingga rata-rata sekuens genus sama dengan panjang sekuens individu tersebut. Penanda ITS memiliki rata-rata panjang sekuens basa paling besar diantara penanda lainnya yaitu di atas 500 bp. Panjang sekuens ini berkorelasi dengan komposisi basa nukleotida pada sekuens basa. GC content atau komposisi basa guanine (G) dan cytocyn (C) berpengaruh terhadap sekuens basa. Ikatan pada basa G+C lebih kuat dibanding ikatan pada basa A+T (adenine+thymyn). Ikatan pada basa GC adalah tiga ikatan hidrogen sedangkan pada AT adalah dua ikatan hidrogen, sehingga kemungkinan terjadinya pelepasan basa pada GC lebih kecil dibanding pada AT karena ikatannya lebih kuat. Semakin banyak persentase GC content maka sekuens basa semakin panjang karena kemungkinan terjadinya stop kodon yang menyebabkan translasi basa terhenti pun semakin kecil (Oliver 1996). Persentase GC content pada ketiga penanda ditampilkan pada Tabel 2. Tabel 2 Persentase GC content (%) pada ketiga penanda genetik GC Content (%) No. Genus Rata-rata matk rbcl ITS 1 Calamus Ceratolobus Daemonorops Korthalsia Myrialepis Plectocomia Rata-rata

16 6 Identifikasi efisiensi penanda menggunakan BLAST Keakuratan identifikasi spesies dapat diketahui salah satunya dengan metode BLAST (Basic Local Alignment Search Tools). Data sekuens basa yang didapat kemudian diinput ke dalam toolbox pada laman web BLAST dan akhirnya akan muncul spesies yang memiliki kekerabatan dengan spesies yang dimaksud. Data kekerabatan masing-masing genus dihasilkan dalam bentuk presentase. Semakin tinggi presentasenya atau mendekati 100% maka kekerabatannya semakin dekat, sedangkan semakin rendah presentasenya berarti kekerabatan semakin jauh atau berbeda sama sekali. Data hasil BLAST ketiga penanda disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Identifikasi efisiensi tiga penanda menggunakan BLAST Nama Tingkatan Ketepatan Identifikasi (%) taksa matk rbcl ITS Calamus Spesies Genus Ceratolobus Spesies Genus Daemonorops Spesies Genus Korthalsia Spesies Genus Myrialepis Spesies Genus Plectocomia Spesies Genus Tabel 3 menunjukkan tingkat keakuratan masing-masing penanda matk, rbcl dan ITS dalam membedakan spesies. Penanda ITS terlihat memiliki hasil yang bervariasi untuk masing-masing genus sedangkan pada penanda matk dan rbcl tingkat keakuratan hampir 100%. Data yang didapat pada penanda matk dan rbcl belum dapat dikatakan akurat sepenuhnya karena ketika melakukan BLAST banyak individu yang kekerabatannya 100% meskipun tertulis spesies yang berbeda, ini disebabkan kemungkinan terjadinya kesalahan pada saat identifikasi morfologi sehingga data spesies yang diinput kurang tepat. Selain itu karena jumlah spesies pada ITS lebih bervariasi dibanding matk dan rbcl menyebabkan nilai rata-rata keakuratan penanda pun bervariasi. Hubungan Filogenetik Analisis filogeni hasil penjajaran urutan nukleotida dilakukan dengan menggunakan metode Kimura-2-parameter yaitu metode yang menggunakan parameter transisi dan transversi untuk menghitung persentase besarnya perbedaan jarak genetik antar sampel (Nei dan Kumar 2000). Metode yang

17 digunakan adalah Neighbor Joining (NJ) dengan nilai bootstrap sebesar 1000x karena metode ini efektif untuk melakukan perhitungan tingkat kesamaan dalam identifikasi spesies melalui kekerabatan (Ward et al. 2008). 7 Gambar 1 Konstruksi filogenetik berdasarkan lokus matk Gambar 1 menggambarkan hubungan kekerabatan spesies rotan pada lokus matk. Sekuens atau urutan basa dapat diketahui spesiesnya melalui percabangan yang membentuk kelompok atau clade. Terdapat nilai bootstrap skala 1-100% untuk mengetahui tingkat akurasi percabangan filogeni. Semakin tinggi nilai bootstrap maka tingkat akurasi dan ketetapan posisi percabangan pohon filogeni semakin tinggi. Spesies outgroup diperlukan dalam konstruksi filogeni sebagai pembanding dalam menentukan spesies. Spesies outgroup diperoleh dari GenBank dengan taksa yang tidak terlalu jauh atau terlalu dekat. Pembanding ditujukan agar filogenetik yang terbentuk jelas dan kuat untuk mengklasifikasikan suatu kekerabatan antar individu dan spesies.

18 8 Gambar 1 menggambarkan hasil terbentuknya 29 kelompok besar atau clade pada rotan berdasarakan lokus matk serta 1 clade dari spesies outgroup yang diambil dari genus Bambusa. Akan tetapi dari konstruksi filogeni yang terlihat, matk belum bisa membedakan spesies yang berbeda dengan baik, terbukti dengan banyaknya spesies yang berbeda yang dikelompokkan menjadi satu clade. Contohnya pada clade berwarna biru di kanan atas, Calamus aruensis, C. erectus, C. hookerianus, C. rhabdocladus, C. tetradactylus dan C. yunnanensis berada dalam satu clade meskipun semuanya merupakan spesies yang berbeda. Gambar 2 Konstruksi filogenetik berdasarkan lokus rbcl Gambar 2 menggambarkan hubungan kekerabatan spesies rotan pada lokus rbcl. Konstruksi filogenetik yang terbentuk menghasilkan 12 clade rotan serta 1 spesies outgroup. Seperti pada penanda matk, pada penanda rbcl pun masih terdapat beberapa spesies yang dianggap mirip dengan spesies yang lainnya. Hal ini ditunjukkan dari clade berwarna coklat di bagian kanan, dimana Calamus guruba, C. henryanus, C. karinensis, C. erectus, C. rhabdocladus, C. brandisii, C. hookerianus, C. khasianus, C. moti, C. peregrinus, C. baratangensis, C. stoloniferus, C. travancoricus, C. tenuis, C. karnatakensis, Korthalsia debilis,

19 Myrialepis paradoxa, Plectocomia himalayana dan Plectocomia elongate dikelompokkan menjadi satu clade. Penanda rbcl pun belum dapat mendiskriminasi spesies dengan baik. 9 Gambar 3 Konstruksi filogenetik berdasarkan lokus ITS Gambar 3 menunjukkan hubungan kekerabatan spesies rotan pada lokus ITS. Terbentuk 11 clade rotan dan 1 spesies outgroup. Seperti kedua penanda lainnya, pada penanda ITS pun masih ada spesies berbeda yang dikelompokkan ke dalam satu clade. Daemonorops manii, D. rarispinosa, D. kurziana, D. jenkinsiana, D. aurea dikelompokkan ke dalam satu clade berwarna coklat bagian bawah pada Gambar 3. Ketiga gambar tersebut menunjukkan penanda yang digunakan masih belum cukup akurat dalam membedakan jenis karena spesies yang berbeda masih dikelompokkan menjadi satu clade yang berarti tidak ada perbedaan genetik antar spesies tersebut. Kemungkinan lainnya adalah adanya kesalahan pada saat

20 10 identifikasi secara morfologi masing-masing spesies sehingga kemungkinan spesies yang sebenarnya adalah sama dianggap spesies yang berbeda. Variasi nukleotida genus Calamus dan Non Calamus pada ketiga penanda Variasi nukleotida dianalisis untuk mengetahui akurasi penanda dalam membedakan spesies dengan melihat perubahan struktur genetik yang terjadi pada sekuens. Parameter yang dapat dianalisis untuk mengetahui variasi nukleotida diantaranya adalah jumlah site yang tersegregasi (S), jumlah insersi-delesi (indel), jumlah haplotype (H), haplotype diversity (Hd) dan nucleotide diversity (π). Analisis ini dilakukan dengan menggunakan software DnaSP 5 (Librado dan Rozas 2009). Hasil analisis disajikan pada Tabel 4 untuk jenis Calamus dan Non Calamus. Tabel 4 Variasi nukleotida genus Calamus dan Non Calamus pada ketiga penanda Lokus Spesies L/Ls (bp) n S Indel H Hd πt πs πa cpdna matk Calamus / Non Calamus 514 / rbcl Calamus / Non Calamus 514 / ndna ITS Calamus / Non / Calamus Keterangan: L/LS= panjang sekuens dengan gaps/jumlah silent site tanpa gaps; N= jumlah sekuens;s= jumlah segregating site; Indel= jumlah terjadinya insersi-delesi; H= jumlah haplotype; Hd= haplotype diversity; π t= beda jumlah nukleotida per total site dengan koreksi Jukes and Cantor (JC 1969) ; π s= beda jumlah nukleotida per silent site dengan koreksi Jukes and Cantor (JC 1969) ; π a= beda jumlah nukleotida per nonsynonymous site dengan koreksi Jukes and Cantor (JC 1969). Tabel 4 menunjukkan bahwa pada ketiga penanda terjadi segregasi dan ditemukan indel. Segregasi yang terbesar ditemukan pada penanda lokus ITS sebesar 323 pada genus Calamus dan 348 pada Non Calamus. Nilai nucleotide diversity atau keragaman nukleotida yang disimbolkan dengan π t terbesar ditemukan juga pada lokus ITS yaitu untuk genus Calamus dan 0,55069 untuk genus Non Calamus. Sedangkan pada penanda matk dan rbcl nilai π t kurang dari 0,1 yang berarti penanda tersebut menganggap kekerabatan antar spesies dekat atau mirip. Baik atau tidaknya penanda dapat dilihat dari nilai terjadinya indel (insersi-delesi), karena nilai indel menunjukkan ada atau tidaknya mutasi yang terjadi pada basa. Nilai indel yang terkecil adalah 0,4 dan terbesar adalah 10,1, keduanya ditemukan pada lokus ITS. Ini menunjukkan bahwa penanda ITS mampu membedakan spesies lebih baik dibanding kedua penanda lainnya karena nilai indelnya kecil dalam satu genus Calamus, sedangkan nilai indel yang besar pada genus Non Calamus disebabkan karena dalam kelompok

21 tersebut terdapat berbagai macam spesies yang berasal dari genus berbeda. Data tersebut diatas menunjukkan bahwa penanda ITS memiliki potensi untuk mendiskriminasi spesies lebih baik dibanding kedua penanda lainnya. 11 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Data GenBank berupa sekuens dari 6 genus tanaman rotan menunjukkan lokus ITS memiliki sekuens yang lebih banyak dan lebih panjang dibanding lokus matk dan rbcl. Panjang sekuens dari yang terpanjang hingga terpendek berturutturut adalah bp pada ITS, bp pada rbcl dan bp pada matk. Nilai persentase GC content dari mulai terbesar hingga terkecil adalah 63.1% pada ITS, 58.6% pada matk dan 43.9% pada rbcl. Berdasarkan hasil pohon filogenetik, ketiga penanda masih belum akurat dalam membedakan spesies karena spesies yang berbeda masih dikelompokkan ke dalam satu clade. Dari hasil analisis variasi nukleotida diketahui bahwa penanda ITS merupakan penanda yang memperlihatkan parameter genetik yang lebih bervariasi dibanding kedua penanda lainnya. Saran Dari ketiga penanda genetik tersebut masih belum dapat dipastikan yang paling baik untuk membedakan spesies, maka dari itu perlu eksplorasi lebih lanjut terhadap ketiga penanda tersebut. Data yang terdapat pada GenBank kurang bervariasi, hanya terpusat pada beberapa spesies saja. Penelitian lebih lanjut terhadap rotan yang terdapat di Indonesia dapat dilakukan agar database pada GenBank lebih bervariasi dan bisa dijadikan referensi selanjutnya. DAFTAR PUSTAKA Bagali PG, Prabhu PDAH, Raghaedra K, Hittalmani S, Vadivelu JS Application of Molecular Markers in Plant Tissue Culture. Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 18 (1): CBOL-Plant Working Group A DNA barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci USA. 106: Dransfield J, Manokaran N Plant resources of South-East Asia 6: Rattans. Wageningen, the Netherlands, Pudoc. Hajibabaei M et al A minimalist barcode can identify a specimen whose DNA is degraded. J Compilation Blackwell Publishing. 6: Jukes TH, Cantor CR Evolution of protein molecules In: Munro HN (ed) Mammalian protein metabolism. Academic Press, New York, pp Kumar S, Nei M, Dudley J, Tamura K MEGA: a biologistcentrisc software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Brief Bioinform. 9: Librado P, Rozas J DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA Polymorphism data. Bioinformatics 25:

22 12 Mondini L, Noorani A, Pagnotta MA Review: Assessing Plant Genetic Diversity by Molecular Tools. Diversity 1: DOI : /d Nei M, Kumar S Molecular Evolution and Phylogenetics. New York: Oxford University Press. Oliver JL, Marin A A Relationship Between GC Content and Coding- Sequence Length. J Mol Evol 43: Tamura K., Nei M., and Kumar S Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101: Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S Mega 5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood, Evolutionary Distance and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol Evol.24: Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution30: Tudge C The Variety Of Life. New York: Oxford University Press. Valentini A, Pompanon F, Taberlet P DNA Barcoding for Ecologists. Trends in Ecology and Evolution (24)2: Ward RD, Holmes BH, White WT, Last PR DNA barcoding Australasian chondrichtyans: results and possible use in conservation. Mar. Freshwater Res. 59, Yu J, Xue JH, Zhou SL New universal matk primer for dna barcoding angiosperms. Journal of Systematics and Evolution. 49 (3):

23 13 Lampiran 1 Hasil pengurutan basa nukleotida (sequencing) rotan pada penanda matk #Calamus yunnanensis var. intermedius gi #Calamus yunnanensis var. intermedius gi #Calamus yunnanensis var. intermedius gi #Calamus yunnanensis var. densiflorus gi #Calamus yunnanensis var. densiflorus gi #Calamus yunnanensis gi

24 14 #Calamus yunnanensis gi #Calamus yunnanensis gi #Calamus yunnanensis gi #Calamus yunnanensis gi #Calamus viminalis var. fasciculatus gi CACCATAATTTTTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT ACAGGATCCATATAGACCAATTATCAAAATGTTCTTTCTATTTTCTAGGTTATCTTTCA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCTATTAGTAAGC #Calamus viminalis var. fasciculatus gi CACCATAATTTTTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT ACAGGATCCATATAGACCAATTATCAAAATGTTCTTTCTATTTTCTAGGTTATCTTTCA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCTATTAGTAAGC #Calamus viminalis var. fasciculatus gi CACCATAATTTTTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT

25 ACAGGATCCATATAGACCAATTATCAAAATGTTCTTTCTATTTTCTAGGTTATCTTTCA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCTATTAGTAAGC #Calamus viminalis gi Cambodia CACCATAATTTTTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT ACAGGATCCATATAGACCAATTATCAAAATGTTCTTTCTATTTTCTAGGTTATCTTTCA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCTATTAGTAAGC #Calamus viminalis gi CACCATAATTTTTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT ACAGGATCCATATAGACCAATTATCAAAATGTTCTTTCTATTTTCTAGGTTATCTTTCA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCTATTAGTAAGC #Calamus viminalis gi CACCATAATTTTTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT ACAGGATTCATATAGACCAATTATCAAAATGTTCTTTCTATTTTCTAGGTTATCTTTCA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCAGGGCACCCTATTAGTAAGC #Calamus vattayila gi AGTGTATTAATAAATCTTTCGACGGTAAGGAATCAAATGCTAGAGAATTTATTTCTAA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCTATTAGTAAGC #Calamus unifarius gi CACCATAATTTTTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT ACAGGATCCATATAGACCAATTATCAAAATGTTCTTTCTATTTTCTAGGTTATCTTTCA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCTATTAGTAAGC #Calamus travancoricus gi ATGGAAATGTCACCTTGTAAATTTCTGGCAATATCATTTTAACTTTTGGTCTCAACCGT 15

26 16 #Calamus thwaitesii gi #Calamus tetradactylus gi Cambodia #Calamus tetradactylus gi Cambodia #Calamus tetradactylus gi TCGATATCAAGGAAAAGCAATTCTGGTTTCAAAGGGAGCTCATCTTCTGATGAAGAA #Calamus tenuis gi #Calamus stoloniferus gi

27 #Calamus sp. KYUM-2014 gi Cambodia CACCATAATTTTTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT ACAGGATCCATATAGACCAATTATCAAAATGTTCTTTCTATTTTCTAGGTTATCTTTCA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCTATTAGTAAGC #Calamus sp. KYUM-2014 gi Cambodia #Calamus salicifolius gi Cambodia #Calamus rotang gi #Calamus rhabdocladus gi #Calamus rhabdocladus gi #Calamus rhabdocladus gi

28 18 #Calamus platyacanthus var. longicarpus gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus platyacanthus var. longicarpus gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus peregrinus gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGTATCCTTTCATGCATTATGT ATGGAAATGTCACCTTGTCAATTTCTGGCAATATAATTTTCACTTTTGGTCTCAACCGT #Calamus palustris gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGGCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT #Calamus nambariensis var. xishuangbannaensis gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus nambariensis var. xishuangbannaensis gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC

29 #Calamus nambariensis var. xishuangbannaensis gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus nambariensis var. xishuangbannaensis gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus nambariensis var. xishuangbannaensis gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus nambariensis var. menglongensis gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus nambariensis var. menglongensis gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus nambariensis var. menglongensis gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus nambariensis var. alpinus gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT 19

30 20 ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus nambariensis var. alpinus gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus nambariensis var. alpinus gi CACCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATTCTTTCATGCATTATGT ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus metzianus gi #Calamus longisetus gi #Calamus lakshmanae gi #Calamus khasianus gi

31 #Calamus karnatakensis gi #Calamus karinensis gi TCGATATCAAGGAAAAGCAATTATGGTTTCAAAGGGGGCTCATCTTCTGATGAAGAA #Calamus karinensis gi TCGATATCAAGGAAAAGCAATTATGGTTTCAAAGGGGGCTCATCTTCTGATGAAGAA #Calamus karinensis gi TCGATATCAAGGAAAAGCAATTATGGTTTCAAAGGGGGCTCATCTTCTGATGAAGAA #Calamus hookerianus gi #Calamus henryanus gi #Calamus henryanus gi

32 22 #Calamus guruba var. elipsoideus gi #Calamus guruba var. elipsoideus gi #Calamus guruba var. elipsoideus gi #Calamus guruba gi #Calamus guruba gi AGTGTATTAATAAATCTTTCGACGGTAAAGAATCAAATGCTAGAGAATTCATTTCTAA #Calamus guruba gi ATGGAAATGTCACCTTGTCAATTTCTGGCAATATCATTTTAACTTTTGGTCTCAACCGT

33 #Calamus gracilis gi TGGATACTGTTACTAAAAAATTCGATACCAGAGTCCCCGTTATTCCTCTTATTGAATCA TTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus gracilis gi TGGATACTGTTACTAAAAAATTCGATACCAGAGTCCCCGTTATTCCTCTTATTGAATCA TTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus gracilis gi TGGATACTGTTACTAAAAAATTCGATACCAGAGTCCCCGTTATTCCTCTTATTGAATCA TTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCCATTAGTAAGCC #Calamus erectus gi #Calamus erectus gi #Calamus erectus gi #Calamus dransfieldii gi

34 24 #Calamus delessertianus gi #Calamus castaneus gi #Calamus caryotoides gi Australia AGTGTATTAATAAATCTTTCGACGGTAAGGAATCAAATGTTAGAGAATTCATTTCTAA #Calamus brandisii gi #Calamus bonianus gi CACCATAATTATTTTCAGAAGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT #Calamus bonianus gi CACCATAATTATTTTCAGAAGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT

35 #Calamus bonianus gi CACCATAATTATTTTCAGAAGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT #Calamus baratangensis gi AGTGTATTAATAAATCTTTCGACGGTAAGGAATCAAATGCTAAAGAATTCATTTCTAA #Calamus aruensis gi #Calamus andamanicus gi #Ceratolobus subangulatus gi ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCATCCTATTAGTAAGCC #Korthalsia cheb gi CGCCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTTCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT TCGATATCAAGGAAAAGCAATTTTGGTTTCAAAGGGGGCTCATCTTCTGATGAAGAAA TGGAAATGTCACCTTGTCAATTTCTGGCAATATTATTTTCGCTTTTGGTCTCAACCGTA CAGGATCCATATAGACCAATTATATAACTGTTCTTTCTATTTTCTAGGTTATCTTTCAA GTGTATTAATAAATCTTTCGACGGTAAGGAATCAAATGCTAGAGAATTCATTTCTAAT GGATACTGTTACTAAAAAATTCGATACCAGAGTCCCAGTTATTCCTCTTATTGAATCA TTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGGCACCCTATTAGTAAGCC #Plectocomia himalayana gi CGCCATAATTATTTTAAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT 25

36 26 #Plectocomia himalayana gi CGCCATAATTATTTTAAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT #Plectocomia himalayana gi CGCCATAATTATTTTAAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT #Plectocomia mulleri gi CGCCATAATTATTTTCAGAGGACCCTATGGTCCTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGT TGGATATCAAGGAAAAGCAATTCTGGTTTCAAAGGGGGCTCATCTTCTGATGAAGAA ATTGTCTAAAGCTAAATTTTGTACCGTATCGGGACACCCTATTAGTAAGCC #Bambusa multiplex gi TACCCAGGTTTTTTTCGGAAAACCGTATGGTTCTTTATGGATCCTCTTATGCACTATGT TCGATATCAAGGAAAGGCAATTCTTGCATCAAAAGGAACTCTTCTTTTGAAGAAGAA ATGGAAATGTTACCTTGTCAATTTCTGGCAATATTCTTTCTCTTTTTGGACTCAACCGC GAAGGATCCATCTAAACCAATTAGCAAACTCTTGCTTCGATTTTCTGGGGTACCTTTC AAGTGTACCAATAAATCCTTTGTTAGTAAGGAATCAAATGCTAGAGAATTCATTTCTA ATAGATACTCGAATGAAAAAATTCGATACCATAGTCCCCGCTACTCCCCTCATTCGAT CCTTATCAAAAGCTCAATTTTGTACTGGATCGGGGCATCCTATTAGTAAACC Lampiran 2 Hasil pengurutan basa nukleotida (sequencing) rotan pada penanda rbcl #Calamus_thysanolepis_gi #Calamus_unifarius_gi

37 27 GGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGTCCACCTCATGGCATCC #Calamus_bonianus_gi AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_bonianus_gi AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_bonianus_gi AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_guruba_gi #Calamus_guruba_gi #Calamus_viminalis_var._fasciculatus_gi

38 28 AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_viminalis_var._fasciculatus_gi AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_viminalis_var._fasciculatus_gi AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_henryanus_gi #Calamus_henryanus_gi #Calamus_karinensis_gi #Calamus_karinensis_gi

39 29 #Calamus_karinensis_gi #Calamus_yunnanensis_var._densiflorus_gi #Calamus_yunnanensis_var._densiflorus_gi #Calamus_yunnanensis_var._intermedius_gi #Calamus_yunnanensis_var._intermedius_gi #Calamus_yunnanensis_var._intermedius_gi #Calamus_nambariensis_var._menglongensis_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT

40 30 #Calamus_nambariensis_var._menglongensis_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_nambariensis_var._menglongensis_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_nambariensis_var._xishuangbannaensis_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_nambariensis_var._xishuangbannaensis_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_nambariensis_var._xishuangbannaensis_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_nambariensis_var._xishuangbannaensis_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT

41 31 #Calamus_nambariensis_var._xishuangbannaensis_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_yunnanensis_gi #Calamus_yunnanensis_gi #Calamus_yunnanensis_gi #Calamus_yunnanensis_gi #Calamus_yunnanensis_gi #Calamus_erectus_gi

42 32 #Calamus_erectus_gi #Calamus_erectus_gi #Calamus_gracilis_gi TTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCGCCCGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCT ATATTGCTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATG AAGTTGAAAGAGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATG #Calamus_gracilis_gi TTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCGCCCGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCT ATATTGCTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATG AAGTTGAAAGAGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATG #Calamus_gracilis_gi TTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCGCCCGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCT ATATTGCTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATG AAGTTGAAAGAGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATG #Calamus_nambariensis_var._alpinus_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT

43 33 #Calamus_nambariensis_var._alpinus_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_nambariensis_var._alpinus_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_platyacanthus_var._longicarpus_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTATCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_platyacanthus_var._longicarpus_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTATCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_rhabdocladus_gi #Calamus_rhabdocladus_gi #Calamus_rhabdocladus_gi

44 34 #Calamus_guruba_var._elipsoideus_gi #Calamus_guruba_var._elipsoideus_gi #Calamus_guruba_var._elipsoideus_gi #Calamus_andamanicus_gi #Calamus_delessertianus_gi #Calamus_tetradactylus_gi

45 35 AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_palustris_gi ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTGTCGGAGAGGAAAATCAAT #Calamus_brandisii_gi #Calamus_hookerianus_gi #Calamus_khasianus_gi #Calamus_viminalis_gi AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_lakshmanae_gi

46 36 #Calamus_caesius_gi #Calamus_hollrungii_gi GGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGTCCACCTCATGGCATCC #Calamus_moti_gi _Australia #Calamus_viminalis_gi _Cambodia AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_tetradactylus_gi _Cambodia AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_sp._KYUM-2014_gi _Cambodia TTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCT #Calamus_salicifolius_gi _Cambodia TTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCT

47 37 #Calamus_sp._KYUM-2014_gi _Cambodia AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_tetradactylus_gi _Cambodia AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT #Calamus_caryotoides_gi _Australia #Calamus_peregrinus_gi #Calamus_guruba_gi #Calamus_vattayila_gi AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTATGGTCGTCCTCTATTGGGATGT

48 38 #Calamus_baratangensis_gi #Calamus_stoloniferus_gi #Calamus_travancoricus_gi #Calamus_tenuis_gi #Calamus_dransfieldii_gi #Calamus_nagbettai_gi #Calamus_longisetus_gi GCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAAGTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTG

49 39 #Calamus_karnatakensis_gi #Calamus_thwaitesii_gi #Calamus_rotang_gi #Calamus_metzianus_gi #Calamus_usitatus_gi #Ceratolobus_pseudoconcolor_gi

50 40 #Daemonorops_acamptostachys_gi GCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAAGTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTG #Korthalsia_cheb_gi #Korthalsia_debilis_gi #Myrialepis_paradoxa_gi #Plectocomia_himalayana_gi #Plectocomia_himalayana_gi

51 #Plectocomia_himalayana_gi #Plectocomia_elongata_gi #Plectocomia_mulleri_gi #Bambusa_multiplex_gi TTCCGAGTAACTCCTCAGCCGGGGGTTCCGCCCGAAGAAGCAGGGGCTGCAGTAGCT GCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTTTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTG ATCGTTACAAAGGACGATGCTATCACATCGAGCCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAAT ATATCGCTTATGTAGCTTATCCATTAGACCTATTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATG TTTACTTCCATTGTGGGTAACGTATTTGGTTTCAAAGCCCTACGCGCTCTACGTCTGGA GGATCTGCGAATTCCCACTACTTATTCAAAAACTTTCCTAGGTCCGCCTCATGGTATCC AAGTTGAAAGGGATAAGTTGAACAAGTACGGCCGTCCTTTTTTGGGATGT 41 Lampiran 3 Hasil pengurutan basa nukleotida (sequencing) rotan pada penanda ITS #Ceratolobus concolor gi GCGAGCGGTCCACCCCTCATGATGTCACAAGAAAGTCCACTGAACCTTATCATTTAGA GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTACAGAAGGATCATTATCG AGACCCGACGAGCCAAACCTGCAAACATGTGAACTCATTGCGTGCTGGAGTGTGGGT GGCCCCACCAACCTACACCAACTTCATCGCTCCGACCCCTGCGCCATCGAGACCGGTG GCCATTGGGTAGCAGGAGGACCAGACCCGGCACCTACGGAGGGCGCCAAGGAACCTT GAGAGACATAGGCACACCTTCTGCCCTGCCCCTTGCTCGCAGGGGGCCAGGGTCACG GGGTACTGCCTCCGCCGATGGTAAAGCCTCTAGGCTTTCACGGTATGACT #Ceratolobus concolor gi TGGCAATGCGAGCGCTCCACCCCTCATGATGTCACAAGAAAGTCCACTGAACCTTATC ATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTACAGAAGGATC ATTATCGAGACCCGACGAGCCAAACCTGCAAACATGTGAACTCATTGCGTGCTGGAG TGTGGGTGGCCCCACCAACCTACTCCAACTTCATCGCTCCGACCCCTGCGCCATCGAG ACCGGTGGCCATTGGGTAGCAGGAGGACCAGACCCGGCACCTACGGAGGGCGCCAAG GAACCTTGAGAGACATAGGCACACCTTCTGCCCTGCCCCTTGCTCGCAGGGGGCCAGG GTCACGGGGTACTGCCTCCGCCGATGGTAAAGCCTCTAGGCTTTCACGGT

52 42 #Calamus thysanolepis gi TACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAG CATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAG CTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCT TGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTATCGGGGAGGAAAATCA ATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACA TGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTG GAGGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGTCCGCCT #Calamus unifarius gi GATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAGATACTGATATCTTGG CAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAG TAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAG TCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAAACCGTTATCGGGGAGGAAAA TCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTA ACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGT CTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGTCCA #Calamus bonianus gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTATCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus bonianus gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTATCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus bonianus gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTATCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus guruba gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTGTCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus guruba gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT

53 CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTATCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus viminalis var. fasciculatus gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTATCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus viminalis var. fasciculatus gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTATCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus viminalis var. fasciculatus gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTATCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus henryanus gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTGTCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus henryanus gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTGTCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA CCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG GTTTCAAAGCCCTAAGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTT #Calamus karinensis gi GTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA CGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTT CCGCCTGAGGAAGCAGGGGCAGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACA ACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACA TCGAAACCGTTGTCGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGA 43