PHYLOGENETIC ANALYSIS OF AQUILARIA AND GYRINOPS MEMBER BASED ON TRNL-TRNF GENE SEQUENCE OF CHLOROPLAST. Oleh:

Transkripsi

1 Jurnal Sangkareang Mataram PHYLOGENETIC ANALYSIS OF AQUILARIA AND GYRINOPS MEMBER BASED ON TRNL-TRNF GENE SEQUENCE OF CHLOROPLAST Oleh: I Gde Adi Suryawan Wangiyana Forestry Faculty of Nusa Tenggara Barat University Abstract: and Gyrinops are main agarwood producers that only could be distinguished based on their flower structure. Molecular characteristic analysis is needed to support morphological character for breeding and conservation purpose. Several molecular analyses were conducted based on similarity characteristic of and Gyrinops. However phylogenetic analysis of these genera was so few to support the polyphasic classification. The purpose of this study is to do phylogenetic analysis based on trnl-trnf sequence. Thirteen sequences of and six sequences of Gyrinops were downloaded from NCBI. ClustalX. program were used for multiple alignment of sequences. Three phylogenetic trees were reconstructed with MEGA. by different method including: Neighbor Joining, Minimum and Maximum Liklihood. Phydit program were used to construct similarity matrix between sequences. Based on phylogenetic analysis, all members were clustered in the same clade. All sister taxa also composed with member except for. On the other hand, G.salicifora, G.Podocarpa and G.Ladermanii are the only Gyrinops members that form same clade. Other Gyrniops members were spread to different clade. It could be concluded that trnl-trnf sequence is a useful phylogenetic marker for although have several limited for Gyrinops. Moreover, based on phylogenetic analysis and similarity analysis it could be suggested that and Gyrinops sould not be separated into different genera. Keyword: Phylogenetic Analysis, -Gyrinops, trnl-trnf Chloroplast PENDAHULUAN Gaharu adalah hasil hutan bukan kayu dengan nilai ekonomis tinggi yang dihasilkan terutama oleh dua genus famili thymelaeaceae yaitu: dan Gyrinops. Dengan nilai ekonomis yang tinggi menyebabkan pesatnya eksploitasi terhadap anggota kedua genus tersebut. Akibatnya kedua genus tersebut terancam kelestariannya sehingga perlu tindakan konservasi (Schmidt, 0). Genus dan Gyrinops selama ini dibedakan secara morfologis berdasarkan struktur bunga. Genus mempunyai 0 buah stamen sementara genus Gyrinops hanya memiliki stamen (Compton and Zich, 00). Di era taksonomi modern saat ini, membedakan dua kelompok hanya berdasarkan satu karakter tunggal kurang relevan. Terlebih lagi seringkali terjadi penyimpangan jumlah stamen pada Gyrinops seperti yang dilaporkan oleh Koherani (0), bahwa jumlah stamen pada G. versteegii bervariasi antara tetapi tidak pernah berjumlah 0. Perkembangan biologi molekular yang pesat belakangan ini mendorong pesatnya perkembangan penerapan data molekular untuk menyokong proses identifikasi dan klasifikasi. Hal ini berlaku juga untuk genus dan Gyrinops. Tercatat beberapa proses identifikasi kedua genus ini dengan menggunakan data molekular diantaranya: studi keragaman genetic anggota genus berdasarkan analisis Isoenzim (Situmorang, 000), studi keragaman genetis pada anggota genus dan Gyrinops versteegii dengan analisis Amplified Fragment Length Polymorphism (Toruan-Mathius et al., 00) dan studi gen δguanine synthase untuk keperluan identifikasi anggota genus (Kumeta and Ito, 0). Study study tersebut menekankan pada analisis similaritas untuk melakukan klasifikasi molekular. Gambar. Struktur bunga Gyrinops (kiri) dan (kanan) (S=stamen) (Koherani, 0) Untuk memperoleh klasifikasi molekular yang bersifat polyphasic dibutuhkan dukungan data pendekatan dengan analisis similaritas dan analisis phylogenetic (Lengeler et al., ). Pendekatan analisis similaritas pada genus dan Gyrinops telah banyak dilakukan sebelumnya namun tidak demikian halnya dengan analisis filogenetik. Untuk itu perlu dilakukan lebih banyak studi filogenetik terhadap kedua genus ini. Untuk analisis filogenetik diperlukan marker molekular yang representatif. Hasil dan kualitas

2 Jurnal Sangkareang Mataram dari analisis filogenetik sangat ditentukan oleh marker yang digunakan (Patwardhan et al., 0). Gen kloroplast telah banyak digunakan sebagai marker molekular untuk analisis filogenetik tumbuhan (Small et al., 00). Komplit genom dari kloroplast digunakan untuk analisis filogenetik berbagai macam tanaman diantaranya: sebagai marker molekular untuk studi anggota genus Oncidium (Wu et al., 00), analisis phylogenetic dan studi genetika populasi anggota genus Cymbidium (Yang et al., 0), marker molekular hubungan filogenetik antar anggota genus Eleusine (Agrawal et al., 0). Belakangan ini, Gen kloroplast sudah mulai digunakan sebagai marker molekular sekaligus DNA barcoding anggota genus. Sekuen Gen kloroplast yang digunakan diantaranya adalah: matk, rbcl, rpob, rpoc, psba-trnh, ITS dan trnl-trnf (Lee et al., 0). Akan tetapi, analisis filogenetik yang secara langsung membandingkan antara anggota genus dan Gyrinops belum pernah dilakukan sebelumnya. Diantara sekuen gen kloroplast, sekuen gen trnl-trnf mempunyai primer yang sangat conserve dengan amplifikasi yang sangat bisa diandalkan sehingga cocok digunakan sebagai marker molekular (Gambar ). Oleh karena itulah Studi ini bertujuan untuk melakukan analisis filogenetik anggota genus dan Gyrinops berdasarkan sekuen trnltrnf kloroplast anggota Famili thymelaeaceae sebagaimana dan Gyrinops. Keterangan tentang sekuen yang digunakan dalam studi ini dapat dilihat pada tabel. Tabel. Keterangan sekuen trnf-trnl anggota genus dan Gyrinops No Spesies Panjang sekuen (bp) Assesion Number Genus A. beccariana AY0. A. citrinicarpa AY. A. crassna AY. A. hirta KU0. A. khasiana AY. A. malaccensis AY. A. microcarpa KU00. A. parvifolia AY. A. rostrata KT. A. sinensis EU. A. subintegra KT. A. urdanetensis AY0. A. yunnanensis KU0. Genus Gyrinops G. caudate AY. G. ledermannii AY. G. podocarpa AY. G. salicifolia AY. G. versteegii KU0. G. walla AY. Outgrup Gonystylus AY b. Gambar. Posisi sekuen Non-Coding spacer kloroplast (trnl-trnf) serta primer yang digunakan untuk amplifikasi c. METODE a. Data sekuen Sekuen gen trnl-trnf kloroplast dari anggota genus dan Gyrinops diunduh dari web NCBI ( menggunakan Multiple Sequence Alignment Multiple Sequence Alignment dilakukan dengan menggunakan program ClustalX.. (Larkin et al., 00). Alignment bertujuan untuk menata sequence trnl-trnf agar satu sama lain diletakkan sesuai dengan posisi homologi antar sequence sehingga dapat dibandingkan. File FASTA digunakan sebagai data input. Alignment total (do complete alignment) dilakukan agar diperoleh file yang kompatibel untuk program MEGA dan PHYDIT. mode Nucleotide Search. Sebanyak sekuen anggota genus Aquilari dan sekuen anggota genus Gyrinops digunakan untuk merekonstruksi pohon filogenetik. Sebagai outgroup untuk melakukan root dipilih sekuen Gonystylus bancanus karena masih merupakan Rekonstruksi Phylogenetic tree dengan MEGA Rekonstruksi pohon filogenetik pada MEGA.(Tamura et al. 0) menggunakan data sequence hasil alignment ClustalX.. Karena terdapat perbedaan format file Clustal X dan Mega, file sekuen harus dikonversi terlebih dahulu agar kompatibel. Rekonstruksi Phylogenetic tree dilakukan dengan menggunakan algoritme filogenetik, yaitu: Neighbor Joining dan Maximum Liklihood. Neighbor Joining tree (Saitou and Nei, ) direkonstruksi dengan menggunakan Test of

3 Jurnal Sangkareang Mataram Phylogeny bootstrap 000 replikasi.model evolusi yang digunakan adalah Tamura Parameter. Laju evolusi (Rates among sites) menggunakan Gamma Distributed. Perlakuan terhadap data jika ada yang hilang (missing data treatment) menggunakan mode complete deletion. Maximum Likelihood tree (Felsenstein,) direkonstruksi dengan menggunakan Test of Phylogeny bootstrap 000 replikasi. Model evolusi yang digunakan adalah Tamura Parameter. Laju evolusi (Rates among sites) menggunakan Gamma Distributed. Perlakuan terhadap data jika ada yang hilang (missing data treatment) menggunakan mode use all sites. Untuk optimasi pohon filogenetik digunakan ML Heuristic Method Nearest-Neighbor-Interchange (NNI) dengan Initial tree for ML adalah Neighbor Joining. d. Pembuatan Matriks Similaritas dengan PHYDIT Program Phydit menggunakan data input berupa hasil alignment dengan format gde sehingga harus dilakukan konversi terlebih dahulu agar data kompatibel. Matriks similaritas nukleotida dibuat dengan mode Generating Similarity Table. Output berupa Matrix similaritas selanjutnya di copy ke MS Excel untuk pengaturan tampilan yang lebih baik (Chun, ). Setelah data matriks similaritas diperoleh, dilakukan analisis hubungan similaritas antara anggota genus Gyrinops dengan Gyrinops, dengan serta Gyrinops dengan dengan nilai cut of value sebesar %. HASIL Pohon filogenetik hasil rekonstruksi dengan menggunakan program MEGA disajikan pada gambar dan gambar Gambar. Neighbor Joining tree Tamura Parameter 000 bootstrap Sementara itu, untuk matriks similaritas ditunjukkan oleh tabel. Matriks similaritas ditampilkan dalam bentuk jauh lebih sederhana dibandingkan dengan matriks similaritas output dari program PHYDIT. Hanya terdapat dua kelompok nilai similaritas antar spesies yang dibandingkan yaitu nilai similaritas lebih dari dan nilai similaritas kurang dari. Tabel. Matriks similaritas dimodifikasi PHYDIT yang 0 0 Gambar. Maximum Likelihood tree Tamura Parameter 000 bootstrap

4 Jurnal Sangkareang Mataram Keterangan: : Anggota genus : Anggota genus Gyrinops (masing masing spesies anggota genus dan Gyrinops dapat dilihat pada table ) : Similaritas > : Similaritas < Untuk menentukan kecenderungan similaritas antar sesama anggota genus Gyrinops, sesama anggota genus dan antar genus Gyrinops dan, maka dibuat tabel yang mampu menerangkan hubungan tersebut seperti tertera pada tabel, dan Tabel. Nilai similaritas antar Anggota Genus Gyrinops dan No 0 0 Gyrinops A.subintegra A.yunnanensis A.citrinic A.subintegra A.parvifolia A.citrinicarpa A.parvifolia A.subintegra A.yunnanensis A.khasiana Index similaritas,,,,,,,,,,0,,,0,,,,,,, Tabel. Nilai similaritas antar anggota genus Gyrinops. NO Gyrinops G.ledermanii G.ledermanii G.salicifolia G.salicifolia G.salicifolia Gyrinops G.salicifo Index similaritas,,,, 00,0,0 Tabel. Nilai similaritas antar anggota genus No 0 A. beccariana A,beccariana A.yunnanensis A,subintegra A,subintegra A,citrinicarpa A,citrinicarpa A,parvifolia A,malaccensis A,hirta A.parvifolia Index Similaritas,,,,0,,, 00, 00,,, PEMBAHASAN Selama ini satu satunya karakter yang digunakan untuk membedakan antara genus Gyrinops dan adalah karakter bunga. Kedua genus tersebut terkenal sebagai penghasil komoditi gaharu yang memiliki nilai ekenomis tinggi. Berdasarkan karakter morfologi bunga, Gyrinops mempunyai jumlah stamen sama dengan jumlah mahkota yaitu sebanyak stamen dan mahkota. Sementara itu, Gyrinops mempunyai jumlah stamen dua kali jumlah mahkota, yaitu: 0 stamen dan mahkota (Koherani, 0). Membedakan takson hanya berdasarkan karakter merupakan hal yang kurang relevan untuk dilakukan diera taksonomi modern. Kelompok takson sebaiknya diklasifikasikan berdasarkan banyak karakter (politetik) bukan hanya dari karakter tunggal (monotetik). Karakter molekular merupakan salah satu karakter kunci yang sangat dapat diandalkan sebagai dasar klasifikasi diera taksonomi modern. Dengan memanfaatkan karakter molekar, dapat dilakukan klarifikasi apakah karakter morfologi bunga sudah cukup dijadikan sebagai acuan untuk membedakan anggota genus dan Gyrinops. Salah satunya adalah analisis filogenetik. Resolusi marker yang digunakan dalam analisis filogenetik merupakan hal yang sangat esensial. Marker yang memiliki resolusi bagus akan mampu membedakan taksa berbeda baik pada level spesies maupun genus. Marker tersebut akan menempatkan taksa satu spesies atau satu genus kedalam clade yang sama dalam phylogenetic tree (Patwardhan et al., 0) Phylogenetic tree yang direkonstruksi menggunakan algoritme berbeda mempunyai topologi yang tidak jauh berbeda. Semua anggota genus tergabung dalam clade yang sama. Hal ini menunjukkan bahwa sekuen gen trnl-trnf

5 mempunyai resolusi cukup bagus untuk analisis filogenetik anggota genus. Untuk anggota genus Gyrinops, tidak semua anggota menempati satu clade. hanya G. salicifolia, G. podocarpa dan G. ladermanii selalu tergabung dalam satu clade. Sementara itu anggota genus Gyrinops lainnya tergabung dalam clade bersama sama dengan anggota genus. Hal ini menunjukkan bahwa sekuen gen trnl-trnf relatif memiliki resolusi yang rendah untuk analisis filogenetik anggota genus Gyrinops Dalam Neighbor Joining tree dan Maximum likelihood tree, terdapat anggota genus Gyrinops yang tergabung dalam clade yang sama dengan anggota genus. Hal ini menunjukkan bahwa pembagian genus dan Gyrinops pada dasarnya tidak bersifat monofiletik karena terdapat anggota genus dan Gyrinops yang membagi nenek moyang bersama. Hal ini juga mengindikasikan bahwa berdasarkan hubungan kekerabatan, dan Gyrinops sebaiknya tidak dipisahkan menjadi genus yang berbeda. Pasangan sister taksa antara Neighbor Joining tree dan Maximum Likelihood tree cukup konsisten meskipun terdapat beberapa perbedaan. Sister taksa merupakan kerabat terdekat terakhir yang tidak berbagi nenek moyang bersama dengan taksa lainnya dalam phylogenetic tree (Gregory, 00). Sister taksa yang terbentuk kebanyakan adalah antara Anggota genus dengan anggota genus aquilaria serta anggota genus Gyrinops dengan anggota genus Gyrinops. Penyimpangan sister taksa terdapat pada pasangan sister taksa G. versteegii dan A. Hirta. Hal ini mengindikasikan bahwa keduanya taksa tersebut seharusnya secara filogenetik menempati genus yang sama. Meskipun direkonstruksi dengan metode statistik dan algoritme berbeda, namun Neighbor Joining tree dan Maximum likelihood tree menunjukkan topology yang tidak jauh berbeda. Neighbor Joining adalah algoritme yang menggunakan metode distance similarity sehingga terdapat indeks similaritas yang disusun menggunakan model evolusi tertentu (Saitou and Nei, ). Sementara itu algoritme Maximum likelihood menggunakan metode character state yang berusaha mencari Phylogenetic tree optimum dari replikasi yang dihasilkan (Felsenstein,). Perbedaan keduanya hanya terlihat dari skala divergensi yang sedikit berbeda antar taksa yang dibandingkan. Skala divergensi taksa pada Neighbor Joining tree sedikit lebih besar dibandingkan dengan skala divergensi taksa Maximum likelihood tree. Pasangan taksa yang menjadi sister taksa memiliki skala divergensi yang berbeda beda. Jurnal Sangkareang Mataram Hal ini menunjukkan bahwa dalam sejarah evolusinya terdapat perbedaan laju evolusi antara taksa yang ada sekarang dengan nenek moyang bersama sister taksa tersebut. Baik pada Neighbor Joining tree dan Maximum likelihood tree pasangan sister taksa A. sinensis dan A. yunnanensis selalu memiliki skala divergensi yang berbeda secara signifikan. Dalam hal ini, A. yunnanensis cenderung memiliki laju evolusi yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan A. sinensis. Selain A. yunnanensis, A. rostrata juga memiliki skala divergensi yang lebih tinggi dibandingkan anggota genus lainnya. Sementara itu untuk anggota genus Gyrinops yang memiliki laju divergensi signifikan berbeda dengan anggota lainnya adalah: G. caudata dan G. ladermanii. Berdasarkan matriks similaritas secara umum tiap anggota genus Aquilari dan Gyrinops memiliki indeks similaritas yang tinggi. Nilai similaritas yang tinggi ini mengindikasikan bahwa antara anggota genus dan Gyrinops memiliki similaritas sekuen trnl-trnf yang tinggi. Hal ini semakin mempertegas bahwa sebenarnya kedua genus ini secara genetis tidak perlu dipisahkan. Analisis similaritas antar taksa selanjutnya dilakukan dengan menggunakan cut of value sebesar. Untuk menjaring agar tidak terlalu banyak ditemukan pasangan taksa dengan indeks similaritas tinggi. Berdasarkan hasil pembandingan nilai similaritas antar taksa, diperoleh pasangan taksa antar genus Gyrinops dan lebih banyak dibandingkan dengan pasangan taksa GyrinopsGyrinops dan -. Berdasarkan data tabel, dan Terdapat pasangan sister taksa Gyrinops-, jauh lebih banyak dibandingkan dengan pasangan taksa GyrinopsGyrinops yang hanya pasang, dan yang hanya pasang. Hal ini menunjukkan bahwa dari segi genetis, similaritas antara anggota Genus Gyrinops dan sangat tinggi sehingga seharusnya tidak dipisahkan menjadi genus berbeda. Similaritas yang tinggi antar anggota genus dan Gyrinops sesuai dengan penelitian Toruan-Mathius et al. (00) bahwa berdasarkan analisis Amplified Fragment Length Polymorphysm (AFLP) antara anggota dan Gyrinops versteegii memiliki nilai similaritas yang tinggi. PENUTUP a. Simpulan Sekuen gen trnl-trnf cocok digunakan untuk analisis filogenetik anggota genus meskipun memiliki keterbatasan jika digunakan untuk genus Gyrinops

6 Jurnal Sangkareang Mataram b. Saran Berdasarkan analisis filogenetik dan analisis hubungan similaritas, dan Gyrinops sebaiknya tidak dipisahkan menjadi genus berbeda. DAFTAR PUSTAKA Agrawal, R., N. Agrawal, R. Tandon and S. N. Raina. 0. Chloroplast genes as genetic markers for inferring patterns of change, maternal ancestry and phylogenetic relationship among Elusine spescies. AoB PLANT : plt0; doi:0.0/aobpla/ plt0 Chun, J.. Computer-assisted classification and identification of actinomycetes. Ph. D. Thesis. University of Newcastle, United Kingdom. Felsenstein, J.. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. J Mol Evol, Gregory, R. T. 00. Understanding Evolutionary Tree. Evo Edu Outreach (00) : Koherani (0). Studi pembungaan dan perkembangan buah serta viabilitas poleh pohon gaharu (Gyrinops versteegii). Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor. Bogor Kumeta, Y. and M. Ito, 0. Genomic organization of δ-guanine synthase genes in crassna and its possible use for the identification of species. Journal of Natural Medicine,, 0- (0). Larkin M. A., G. Blackshields, N. P. Brown, R. Chenna, P. A. McGettigan, H. McWilliam, F. Valentin, I. M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J. D. Thompson, T. J. Gibson, D. G. Higgins, 00. ClustalW and ClustalX version. Bioinformatics():. Lee S. Y., W. L. Ng, M. N. Mahat, M. Nazre, R Mohammed. 0. DNA Barcoding of the endangered (Thmelaeaceae) and its application in species authentication of agarwood products traded in the market. PLos ONE (): e0. Doi:0./ journal.pone.0. Lengeler, J. W., G. Drews, H. G. Schlegel.. Biology of Prokaryotes. Georg Thieme Verlag, Stuttgart. Patwardhan, A., S. Ray and A. Roy., 0. Molecular markers in phylogenetic studied-a review. J Phylogen Evolution Biol (0), : Saitou. N and M. Nei,. The Neighbor-joining Method: A New Method for Reconstructing Phylogenetic Trees. Mol. Biol. Evol. ():0-. Schmidt, M. S., 0. Introduction To CITES And Agarwood Overview. PC0 Inf. Annex. Situmorang, J Mikropropagasi Kayu Gaharu ( spp) Asal Riau serta Identifikasi Sifat Genetiknya Berdasarkan Analisis Isoenzim. Tesis. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor. Small R. L., R. C. Cronn and J. F. Wendel, 00. Use of nuclear genes for phylogeny reconstruction in plants. Australian Systematic Botany,. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., and S. Kumar.0. MEGA: Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance,and Maximum Parsimony Methods. Mol Biol Evol., -. Toruan-Mathius, N., D. Rahmawati and Anidah, 00. Genetic variation among species and Gyrinops versteegii using Amplified Fragment Length Polymorphysim Markers. BIOTROPIA. Vol. No., 00:. Wu, F. H., M. T. Chan, D. C. Liao, C. T. Hsu, Y.W. Lee, H. Daniell, M. R. Duvall and C. S. Lin., 00. Complete chloroplast genome of Oncidium Gower Ramsey and evaluation of molecular markers for identification and breeding in Oncidiinae. BMC Plant Biology 00, 0: Yang, J. B., M. Tang, H. T. Li, Z. R. Zhang and D. Z. Li, 0. Complete chloroplast genome of the genus Cymbidium: light into the species identification, phylogenetic implications and population genetic analyses. BMC Evolutionary Biology 0, :. Zich, F. And J. Compton. 00. Agarwood (Gaharu) harvest and trade in Papua New Guinea: a preliminary Assessment.