10/12/2012 ENZIM ADALAH BIOKATALISATOR ENZIM SEBAGAI BIOKATALISATOR SIFAT-SIFAT ENZIM SEBAGAI BIOKATALISATOR

Transkripsi

1 ENZM SEBAGA BOKATALSATOR T U J U A N N S T R U K S O N A L K H U S U S : M A H A S S W A M A M P U M E N J E L A S K A N P E R A N E N Z M S E B A G A B O K A T A L S A T O R ENZM ADALAH BOKATALSATOR Enzim : molekul protein tak hidup yang dihasilkan oleh sel hidup Protein enzim melangsungkan ribuan reaksi kimia di dalam sel. Reaksi kimia yang dikatalisis enzim di dalam sel: - mengekstrak energi dari lingungam -mengubah sumber energi menjadi molekul yang bermanfaat - memperbaiki dan membangun diri sendiri - melakukan pembuangan hasil samping - melakukan replikasi diri SFAT-SFAT ENZM SEBAGA BOKATALSATOR Katalis yg paling efisien mampu mempercepat reaksi 1020 kali lbh cepat Enzim bersifat sangat spesifik, baik jenis reaksi maupun substratnya, Trombin 1

2 Tiga sifat utama enzim : Enzim tidak ikut bereaksi dgn substrat atau produknya Aktifitas dapat dikontrol sesuai dengan kebutuhan organisme itu sendiri Contoh : enzim yg mengkatalisis reaksi pertama pada suatu siklus biosintesis biasanya di hambat oleh produk akhirnya(feedback inhibition) Kemampuan katalitiknya Spesifisitas Kemampuan untuk diatur (regulasi) bbrp enzim disintesis dlm btk tidak aktif. Dan akan diaktifkan oleh kondisi dan waktu yang sesuai (enzim allosterik). prekursor yg tidak aktif disebut zymogen Bagian-bagian enzim Bagian-bagian enzim (lanjutan) Holoenzim Apoenzim/ apoprotein Gugus prostetik Koenzim Kofaktor BM antara 12,000 1 juta kdalton Ada enzim yang tidak membutuhkan molekul kimiawi lain untuk aktifitasnya, tetapi ada juga yang membutuhkan kofaktor / koenzim Kofaktor ion-ion inorganik yg dibutuhkan enzim untuk melakukan fungsinya Koenzim molekul organik (komplek) yang dibutuhkan enziim untuk melakukan fungsinya 2

3 Tabel 1. Berbagai koenzim yang berasal dari vitamin Vitamin Koenzim Fungsi enzimatik Thiamin (B1) Thiamin pirofosfat Dekarboksilasi oksidatif Riboflavin (B2) Flavin nukleotida Memindahkan H Niasin (B5) Nikotinamid nukleotida Memindahkan H Piridoksin (B6) Piridoksal fosfat Transaminasi Asam Pantotenat Koenzim A Dekarboksilasi oksidatif, metabolisme asetil Ko A Biotin Biotin Karboksilasi Folat Tetrahidrofolat Memindahkan 1 karbon Bagaimana enzim bekerja Koenzim atau kofaktor yang terikat sangat kuat bahkan terikat dengan ikatan kovalen dengan enzim gugus prostetik Enzim aktif lengkap dengan semua komponennya holoenzim Bagian yang terdiri dari protein saja pada suatu enzim Apoenzim / apoprotein Fungsi koenzim adalah sebagai karier sementara dari gugus fungsional yg berperan dalam reaksi ensimatis tersebut. Reaksi tanpa enzim: Lambat Membutuhkan suhu yang tinggi Tekanan yang tinggi Reaksi enzimatis Enzim memberikan suatu lingkungan yg spesifik di dalam sisi aktifnya, sehingga reaksi secara energetik dapat lebih mudah terjadi 3

4 Perbedaan antara energi reaktan (fase awal) dgn energi produk (fase akhir) selisih energi bebas standar (ΔGº) Agar reaksi berjalan spontan, bagaimanakah nilai ΔGº Enzim mempercepat reaksi tetapi tidak mengubah keseimbangan reaksi atau ΔGº Kesetimbangan reaksi antara Reaktan dan produk mencerminkan perbedaan energi bebas pada fase awal Kecepatan reaksi tergantung energi aktifasi ΔGº suatu pasokan energi dibutuhkan untuk mengawali suatu reaksi Energi aktifasi untuk reaksi yg dikatalis dengan ensim lebih rendah dr reaksi tanpa ensim Glukosa + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O ΔGº = kj/mol Enzim penting untuk menurunkan energi aktifasi untuk memulai suatu reaksi Enzim mengikat substrat menciptakan jalan reaksi yg berbeda yg mempunyai fase transisi lebih rendah dbanding reaksi tanpa enzim nti dr reaksi katalisis ikatan yg spesifik pd fase transisi 4

5 Substrat terikat interaksi nonkovalen E + S ES EP E + P Kekuatan enzim dlm mengkatalisis suatu reaksi kemampuan enzim membawa substrat bersama-sama pd orientasi yang tepat untuk terjadinya suatu reaksi Substrat terikat pd sisi aktif yi cekukan pd protein yg berisi asam amino yg penting untuk tjdnya suatu reaksi kimia Karakteristik sisi aktif enzim merupakan bagian kecil dari enzim sisi aktif merupakan suatu cekukan yang bersifat 3 dimensi. memberikan lingkungan mikro yg sesuai utk terjadinya suatu reaksi kimia substrat terikat pada sisi aktif dengan interaksi / ikatan yang lemah. Spesifitas enzim dipengaruhi oleh asam amino yg menyusun sisi aktif suatu enzim 5

6 Sisi aktif mempunyai 2 bagian yg penting: Bagian yang mengenal substrat dan kemudian mengikatnya Bagian yang mengkatalisis reaksi, setelah substrat diikat oleh enzim Gambar sisi aktif ensim dan asam amino yang terlibat Asam amino yang membentuk kedua bagian tersebut tidak harus berdekatan dalam urutan secara linear, tetapi dalam konformasi 3D mereka berdekatan Teori untuk menjelaskan kerja enzim: Lock and Key analogy Enzim memiliki struktur sisi spesifik yang cocok dengan substrat. Mampu menerangkan spesifitas ensim ttp tidak dapat menerangkan stabilitas fase transisi ensim nduced Fit theory mempertimbangkan fleksibilitas protein, sehingga pengikatan suatu substrat pada enzim menyebabkan sisi aktif mengubah konformasinya sehingga cocok dgn substratnya. dpt menerangkan fase transisi ES komplek Perbandingan model induced fit dan kunci dan anak kunci pada pengikatan substrat oleh enzim? 6

7 FAKTOR YANG MEMPENGARUH KERJA ENZM Faktor-faktor yg mempengaruhi kerja enzim ph setiap enzim mempunyai ph optimum utk bekerja. contoh : pepsin ph 2, amylase ph 7.0 Temperatur setiap kenaikan suhu 10 C (sampai 40 C), kecepatan reaksi naik 2 x lipatnya dan reaksi terhambat dan berhenti pada 60 C. Mengapa? [S] dan atau [E] Konsentrasi Substrat ph dan suhu PENGARUH ph dan suhu Protein memiliki banyak gugus ionik perubahan ph akan mempengaruhi sisi katalitik dari enzim Aktivitas enzim max terjadi pada kisaran ph tertentu ph opt 4,5 8,0 Beberapa enzim memiliki ph opt yang ekstrim, misal : pepsin 0H 1,8 dan arginase ph 10,0 Pada kisaran ph ekstrim, asam dan basa mengalami inaktivasi yang irreversible, sedang diluar itu terjadi inaktivasi yang reversible Enzim yang sama tapi asalnya berbeda bisa mempunyai ph opt yang berbeda, misal : metil esterase dari kapang ph opt nya 5,0, sedangkan dari kacang merah ph opt 8,5. Jika suhu meningkat maka laju reaksi enzimatis akan semakin meningkat, tetapi laju denaturasi thermal juga meningkat perlu dibuat suhu opt Pengaruh suhu terhadap reaksi katalitik enzim dan denaturasi dinyatakan dengan Per Arrhenius : k = Ae -E/RT k = konstanta laju reaksi A = konstanta Arrhenius E = energi aktivasi R = konstanta ketetapan gas T = suhu absolut 7

8 KNETKA ENZM Cabang enzimologi yang membahas faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatis nteraksi antara molekul enzim dan lingkungan terjadi pada tingkat intensitas beragam. Faktor2 yang mempengaruhi aktivitas enzim : Konsentrasi enzim Substrat Senyawa inhibitor dan aktivator ph Jenis pelarut pada lingkungan Kekuatan ion suhu No. Tabel. Berbagai faktor yang mempengaruhi kecepatan reaksi enzim Faktor yang mempengaruhi kecepatan reaksi Jenis Faktor 1. Konsentrasi Konsentrasi enzim, substrat, produk, inhibitor, aktivator Keterangan yang dapat diperoleh Mekanisme reaksi, Parameter kinetika (K m, V, K i ) 2. Faktor luar Suhu Parameter termodinamika dan perubahannya ( G, H, S, E a ph ph golongan fungsional (asam amino yang penting dalam pengikatan substrat) Konstanta dielektrik dan kekuatan ion 3. Faktor dalam Struktur substrat, Produk dan Efektor Struktur enzim Jenis ikatan dan muatan protein enzim Sifat2 interaksi dengan enzim, golongan fungsional pada lokasi aktif enzim Sifat biologis enzim, asam amino yang berperan pada lokasi aktif a. Gambar. a. Hubungan antara kecepatan awal reaksi enzim (v) dengan konsentrasi substrat (S) b. Hubungan antara konsentrasi enzim (E), kompleks enzim substrat (ES), Substrat (S) dan produk hasil reaksi (P) b. Perhatikan Gambar (a) : Sebelum tercapai, kecepatan awal reaksi enzim (v) dipengaruhi oleh konsentrasi susbtrat Gambar (b) : Keadaan setimbang : kecepatan pembentukan ES dari E dan S = kecepatan penguraiannya = kecepatan max reaksi enzim yang dicapai pada konsentrasi substrat tertentu. Pada keadaan pra setimbang : terjadi S dan E dan P dan ES. Pada keadaan setimbang : [ ] ES mencapai max semua molekul enzim berubah menjadi ES kecepatan pembentukan ES diatur oleh k 1, sedang kecepatan penguraian ES diatur oleh k 1 dan k 2 pada fase ini [ ] ES per satuan waktu tetap (konstan) 8

9 Pengukuran Parameter Reaksi Enzim Pengukuran Parameter Reaksi Enzim (2) Konsentrasi substrat satuan berat atau konsentrasi (M, mm, M) Enzim murni ; satuan berat/konsentrasi Komisi Enzim nternasional tahun 1956 jumlah enzim yang melakukan katalisis yang menyebabkan perubahan 1 mol substrat/menit = Unit enzim (U) Tahun 1972 diubah 1 kat (1 katal) = jumlah enzim yang mengkatalis pengubahan 1 g mol substrat/detik : 1 kat = 1 mol/detik = 60 mol/menit = 60 x 10 6 mol /menit = 6 x 10 7 U Konsentrasi enzim unit/ml atau unit/mg berat protein enzim satuan spesifik aktivitas enzim. Turnover number (bilangan balik) = jumlah mol substrat yang dapat diubah per mol enzim dalam keadaan optimum/maksimum mol S atau P/menit Bilangan Balik = = E mol E Persamaan Michelis Menten Reaksi Enzimatis k 1 k E + S ES 2 k E + P -1 Kecepatan Pembentukan Produk : v = dp/dt = k 2 (ES)...1)...2) d(es)/dt = k 1 (E)(S)-k -1 (ES)-k 2 (ES)...3) Konservasi Enzim (E) = (E 0 ) (ES)...4) 9

10 Dari Pers (3) dan (4) : k 1 (E) o (S) ES = (5) k 1 + k 2 + k 1 (S) Substitusi Pers (5) ke Pers (2) : k 2 (E) o (S) v = (6) (k 1 + k 2 )/k 1 + S Jika semua enzim telah berubah menjadi ES (ES = E o ) reaksi enzim mencapai max : = k 2 (ES) = k 2 (E o )...(7) Konstanta Michelis Menten : k -1 + k 2 K m = ) k 1 Substitusi pers (7) dan (8) ke Pers (6) : v V [S] max K m [S] k [E ][S] 2 0 K m [S] Pada saat v mencapai ½, Pers (1) menjadi : (S) ½ = V = K m (S) K m + (S) = 2 S) K m = (S)...10) V = k 2 (E) o ; atau k 2 = /(E) o...11) Pers. Michelis Menten k 2 = bilangan balik enzim (semakin murni enzim k 2 semakin tinggi Percobaan Penentuan Parameter Kecepatan untuk Kinetika Michaelis-Menten Lineweaver-Burk Eadie-Hofstee Hanes- Woolf Kinetika Batch 10

11 Penentuan Parameter Buat persamaan dalam bentuk persamaan linier. Plot data. Data bagaimana yang harus kita miliki untuk pengujian kinetika enzim? Buat sebuah percobaan Slope dan titik potong berhubungan dengan nilai paramater. k cat / K m k cat Turn over number k 3 [E t ] Activity Unit 1 mmole min Specific Activity unit mg Activity Enzyme Kinetics v o = [S] K m + [S] Maximum velocity & K m Affinity with substrate Observe v o change under various [S], resulted plots yield and K m Direct plot Double reciprocal Bi-substrate reaction also follows M-M equation, but one of the substrate should be saturated when estimate the other nhibition Significance zero order 1st order E3 E2 E1 Competitive Non-competitive Uncompetitive Juang RH (2004) BCbasics Percobaan Kinetika Enzim Enzim + Substrat (reaktan) ditempatkan pada wadah dengan suhu konstan, diaduk. Catat laju kehilangan reaktan atau pembentukan produk Kenapa harus suhu konstan? Kenapa harus diaduk dengan sempurna? Bagaimana dengan medium? Buffer? Lineweaver-Burk double reciprocal plot Y = m x + b Plot 1/v Vs 1/[S]. Slope = K m /, Titik potong = 1/ 11

12 intercepts 1 v K m 1 [S] 1 Solusi Secara Grafik -1/ K m 1/ V 1/ Slope = K m / 1/ [S] Contoh: Lineweaver-Burk [S] x 10-5 M V, M/min x Plot 1/V Vs 1/[S] 12

13 Eadie-Hofstee plot Hanes- Woolf Metode Lain v K m v [S] PR Dari contoh data untuk Lineweaver-Burl, hitung juga Km dan Vmax dengan menggunakan metode Edie-Hofstee dan Hanes-Woolf [S] v K m 1 [S] Perbandingan Metode Lineweaver-Burk: memberikan pendugaan yang baik terhadap, kesalahan tidak simetris terhadap data, pada [S] yang rendah nilai error semakin tinggi Eadie-Hofstee: bias< pada [S] yang rendah Hanes-Woolf: lebih akurat untuk. Tidak satupun metode ini yang sempurna Kinetika Reaksi Batch v d[s] dt [S] K m [S] t [S 0 ] [S] K m ln [S 0 ] [S] [S 0 ] [S] t ntegrasi dihasilkan : K m t ln [S 0 ] [S] 13

14 Penghambatan Reaksi Enzimatis PENGATURAN ENZM Kerja enzim dapat dihambat secara reversible atau irreversible rreversible pembentukan atau pemecahan ikatan kovalen dalam enzim Reversible suatu senyawa dapat terikat dan kemudian dpt lepas kembali Reversible inhibitor ini dpt dibagi : competitive non-competitive un-competitive Penghambatan substrat Penghambat kompetitif (competitive inhibitor): molekul inhibitor berkompetisi dengan substrat untuk menempati sisi aktif enzim. Penghambat non kompetitif (allosteric inhibition) Molekul penghambat bergabung dengan enzim di luar sisi aktif, menyebabkan konformasi enzim berubah Penghambatan competitive Penghambatan umpan balik (Feedback nhibition) Penumpukan produk akhir menghambat kerja enzim pertama dalam rangkaian reaksi tersebut sehingga produksi enzim selanjutnya ditunda inhibitor bersaing dgn substrat untuk terikat pd sisi aktif Biasanya inhibitor berupa senyawa yg menyerupai substratnya, & mengikat enzim membentuk komplek E krn terikat scr reversible penghambatannya bias, yaitu ketika ditambah substrat maka penghambatan berkurang 14

15 Contoh penghambatan kompetitif : asam malonat yang strukturnya mirip dengan asam suksinat menghambat suksinat dehidrogenase Gambar. Penghambatan kompetitif pada reaksi enzim, dilakukan menurun Leneweaver-Burk Pemetaan Nilai K 1 = konstanta kesetimbangan bagi reaksi penghambatan, dimana : k -1 (E)() K 1 = = k 1 E Pers Michelis Menten dengan adanya penghambatan kompetitif : V v max [S] V K m 1 max [S] K [S] K m,app [S] Pers Lineweaver-Burk bagi enzim yang mengalami penghambatan : Penghambatan non-competitive inhibitor terikat pada sisi lain dari enzim (bkn sisi aktif) jadi tidak memblok pembtkan enzim-substrat komplek Enzim mjd tidak aktif ketika inhibitor terikat walau enzim mengikat substrat nhibitor mengurangi konsentrasi enzim yg aktif, sehingga mempengaruhi Vmax nya 15

16 Gambar. Penghambatan non kompetitif pada reaksi enzim. Pemetaan dilakukan menurut Lineweaver Burk Persamaan Lineweaver-Burk untuk enzim yang mengalami penghambatan non kompetitif : Penghambatan un-competitive Terikat pd sisi selain sisi aktif enzim Berbeda dgn noncompetitive inhibitor ini hanya terikat pd ES komplek Sehingga tidak terikat pd enzim bebas berubah, dan K m juga berubah 16

17 Cartoon Guide Equation and Description Double Reciprocal Direct Plots 10/12/2012 Enzyme nhibition (Mechanism) Enzyme nhibition (Plots) Competitive Non-competitive Uncompetitive Substrate S nhibitor E Compete for active site E + S ES E + P + E [] binds to free [E] only, and competes with [S]; increasing [S] overcomes nhibition by []. S S E Different site E + S ES E + P + + E + S ES [] binds to free [E] or [ES] complex; ncreasing [S] can not overcome [] inhibition. S E S E + S ES E + P + ES [] binds to [ES] complex only, increasing [S] favors the inhibition by []. Competitive Non-competitive Uncompetitive v o K m K m [S], mm unchanged K m increased ntersect at Y axis 1/K m 1/v o 1/ 1/[S] v o ntersect at X axis K m = K m decreased K m unchanged 1/v o 1/ [S], mm K m K m [S], mm Both & K m decreased Two parallel lines 1/v o 1/ 1/K m 1/[S] 1/K m 1/[S] Juang RH (2004) BCbasics Juang RH (2004) BCbasics 17

18 Penghambatan Oleh Substrat k E + S 1 ES E + P k -1 + S k 2 v Penghambatan oleh Substrat No substrate inhibition ES [S] K si= ESS k si ESS k- si Substrate inhibition [S] max. rate K m K Si v [S] K m [S] [S]2 K S i S REAKS ENZMATS DUA SUBSTRAT Model reaksi : A + B P + Q Umumnya terjadi pada enzim transferase Cara penentuan nilai K m dan sama dengan penentuan pada substrat tunggal Diperlukan rangkaian percobaan yang menggunakan salah satu substrat tetap (misal B) sedang yang kedua divariasi untuk menentukan pengaruhnya terhadap K m, sehingga diperoleh K ma, kemudian perlakuan dibalik, sehingga diperoleh K m B Ada 2 keadaan yang mungkin terjadi jika 2 substrat bereaksi dengan bantuan enzim, yaitu : - reaksi pergantian tunggal - reaksi pergantian ganda 18

19 REAKS PERGANTAN TUNGGAL Kedua substrat A dan B secara simultan harus terdapat pada sisi aktif enzim sehingga diperoleh senyawa terner EAB Ada 2 cara reaksi pergantian tunggal (RPT), yaitu : - RPT- acak - RPT - teratur Pada RPT-acak, reaksi enzim dengan substrat maupun produk terjadi secara acak : P E + A EA B EQ E + Q EAB EPQ E + B EB A Q EP E + P Pada RPT-teratur terdapat substrat utama yang harus terikat terlebih dahulu sebelum substrat kedua bereaksi Bi Bi Mechanism E + A (Substrat utama) EA EA + B EAB A B E EA (EAB) EQ E (EPQ) Setelah A terikat pada E, maka B terikat oleh EA menjadi EAB. Baik A maupun B kemudian mengalami transformasi menjadi P dan Q yang masih terikat dengan E. P dilepas lebih dahulu kemudian Q. P Q REAKS PERGANTAN GANDA (RPG) Beda RPT-teratur dengan RPT-acak : pada RPT teratur, hasil reaksi pertama akan menghambat secara kompetitif reaksi total. Persamaan untuk menghitung V pada RPT-teratur : A 1 A Ks K V ( Km V B max B m B 1 1 Km ( ) (1 ) A V B max Salah satu substrat utama terikat pada enzim yang kemudian dilepas sebagai hasil sebelum substrat kedua masuk terikat pada enzim Contoh : reaksi yang dikatalis oleh aspartat amino transferase Aspartat + -ketoglutarat oksaloasetat + Glutamat Mekanismenya disebut : Ping-Pong Bi Bi Mechanism 19

20 Ping-Pong Bi Bi Mechanism : Substrat utama (asam aspartat) terikat terlebih dahulu pada enzim Gugus amino pada asam aspartat dipindahkan pada gugus prostetis (piridoksal fosfat) yang terikat pada enzim Aspartat akan berubah menjadi asam oksaloasetat dan dilepas dari sisi aktif Substrat kedua masuk pada sisi yang sama dan terjadi penempelan gugus amino pada asam tersebut membentuk glutamat Asam glutamat meninggalkan sisi aktif A E Q E *A E*B P E* B Persamaan untuk menghitung V pada reaksi pergantian ganda : 1 K V V A m B 1 Km ( ) (1 )( A B 1 max ) naktivasi Enzim Enzim akan mengalami denaturasi akibat : Suhu ph Radias9 Pengikatan rreversible oleh inhibitor Suhu dapat meningkatkan laju aktivitas enzim (thermal activation) dan menurunkan laju aktivitas enzim (thermal denaturation) Pengaruh Suhu Pada suhu moderat, semakin tinggi suhu maka laju reaksi akan meningkat v k2[ E], dimana k2 Ae E a RT Pada suhu tinggi, maka semakin tinggi suhu laju denaturasi akan meningkat : d[ E] kd[ E], atau dt [E] [ E ] e Ed kdt RT, dimana kd Ad e d 0 20

21 Pengaruh Suhu 2 Pengaruh suhu terhadap laju reaksi : Enzim allosterik Enzim allosterik mengalami perubahan konformasi sebagai respon terhadap pengikatan modulator efektor v Ae E a RT [E 0 ]e k d t Energi Aktivasi 10 kcal/mol Energi Deaktivasi 100 kcal/mol Allosterik enzim biasanya lebih komplek dari non allosterik enzim, memiliki sub unit lebih dari satu Memiliki satu atau lebih sisi allosterik / regulator untuk mengikat modulator. Seperti halnya substrat, setiap regulator memiliki sisi pengikatan yang berbeda Untuk enzim homotropik sisi aktif dan sisi regulator sama specific activity is the amount of product formed by an enzyme in a given amount of time under given conditions per milligram of enzyme. The rate of a reaction is the concentration of substrate disappearing (or product produced) per unit time (mol L 1s 1) The enzyme activity is the moles converted per unit time (rate reaction volume). Enzyme activity is a measure of quantity of enzyme present. The S unit is the katal, 1 katal = 1 mol s-1, but this is an excessively large unit. A more practical value is 1 enzyme unit (EU) = 1 μmol min-1 (μ = micro, x 10-6). The specific activity is the moles converted per unit time per unit mass of enzyme (enzyme activity / actual mass of enzyme present). The S units are katal kg-1, but more practical units are μmol mg-1 min-1. Specific activity is a measure of enzyme efficiency, usually constant for a pure enzyme. f the specific activity of 100% pure enzyme is known, then an impure sample will have a lower specific activity, allowing purity to be calculated. The % purity is 100% (specific activity of enzyme sample / specific activity of pure enzyme). The impure sample has lower specific activity because some of the mass is not actually enzyme. 21