KEGIATAN BELAJAR 3 VALIDASI METODE ANALISIS KIMIA Capaian Pembelajaran Merancang Validasi Metoda Uji Dalam Analisis Kimia Sub Capaian Pembelajaran 1. membedakan verifikasi metode dan validasi metode 2. merancang parameter yang digunakan dalam melakukan validasi metode analisis Pokok-pokok materi 1. Pengertian Validasi Metode 2. Parameter validasi metode analisis URAIAN MATERI Dalam rangka penjaminan sistem mutu laboratorium pengujian, alat-alat ukur harus memiliki jadwal kalibrasi sesuai dengan kesepakatan yang telah ditetapkan. Selain jadwal kalibrasi laboratorium pengujian harus memiliki metode-metode pengujian yang digunakan tervalidasi dan dilaporkan pada suatu dokumen khusus. Pada kegiatan belajar 3 ini akan diuraikan apakah itu validasi metode analisis, kapan perlu dilakukan validasi metode, dan parameter-parameter yang digunakan pada pekerjaan tersebut. A. Pengertian Validasi Metode Analisis Beberapa definisi dari validasi metode analisis adalah sebagai berikut: Badan POM RI (Anonim, 2006) Tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa tiap bahan, proses, prosedur, kegiatan, sistem, perlengkapan atau mekanisme yang digunakan dalam produksi maupun pengawasan mutu akan senantiasa mencapai hasil yang diinginkan. (CPOB: 2006) AOAC ( Association of Analytical Chemistry) Validasi metode analisis adalah proses yang menunjukkan atau membuktikan karakteristik kinerja metode suatu analisis dapat diterima atau tidak. ISO/IEC 17025 : 2005 klausul 5.4.5.1 Validasi metode analisis sebagai langkah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus telah dipenuhi.
Secara garis besar validasi metode analisis adalah proses pembuktian bahwa suatu pekerjaan atau aktivitas pengukuran atau prosedur analisis kimia memberikan hasil yang mampu telusur ke sistem satuan internasional. Validasi metode sangat diperlukan karena beberapa alasan yaitu validasi metode merupakan elemen penting dari kontrol kualitas, validasi membantu memberikan jaminan bahwa pengukuran akan dapat diandalkan. Dalam beberapa bidang, validasi metode adalah persyaratan peraturan. Validasi metode analisis perlu dilakukan ketika: 1. Menggunakan metode yang tidak baku yaitu metode yang diambil dari suatu jurnal yang belum diakui secara luas, buku ajar, dan dari laporan penelitian. 2. Menggunakan metode yang dikembangkan oleh laboratorium untuk kepentingan sendiri yag merupakan kegiatan yang terencana serta ditugaskan pada personil yang kompeten yang dilengkapi dengan sumber daya yang memadai. 3. Menggunakan metode standar tetapi telah mengalami modifikasi sekecil apapun. misalnya perubahan temperature dan pereaksi. 4. Menggunakan metode rutin yang digunakan di laboratorium berbeda, atau dilakukan oleh analis atau peralatan yang berbeda. 5. Menggabungkan dua atau lebih metode standar Setelah Anda memahami pengertian dan kapan perlu dilakukan validasi metode analisis, ada satu definisi lainnya yang terkadang selalu disandingkan dengan kata valiadasi metode yaitu verifikasi metode analisis. Istilah verifikasi juga sering digunakan untuk alat-alat ukur. Verifikasi alat ukur adalah proses pembuktian atau pengumpulan bukti dengan cara membandingkan ke alat lain yang sejenis bahwa skala ukur atau cara pengukuran atau persyaratan satuan ukuran telah terpenuhi. Verifikasi metode uji adalah konfirmasi ulang dengan cara menguji suatu metode dengan melengkapi bukti-bukti yang obyektif, apakah metode tersebut memenuhi persyaratan yang ditetapkan dan sesuai dengan tujuan. Verifikasi sebuah metode uji bermaksud untuk membuktikan bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian dengan metode tersebut dengan hasil yang valid. Verifikasi bertujuan untuk membuktikan bahwa laboratorium memiliki data kinerja. Verifikasi metode analisis dilakukan pada metode yang sudah standar. Adapun parameter verifikasi metode akan lebih sedikit dibandingkan denga validasi metode analisis. Apakah itu parameter validasi metode analisis akan diuraikan pada bahasan selanjutnya. B. Parameter Validasi Metode Analisis
Parameter ini berkaitan dengan sejauh mana zat lain mengganggu identifikasi atau analisis kuantifikasi analit. Selain itu juga merupakan ukuran dari kemampuan metode untuk mengidentifikasi/mengukur analit. Kehadiran zat lain, baik endogen maupun eksogen, dalam sampel matriks di bawah kondisi yang dinyatakan metode ini. Kekhususan ditentukan dengan menambahkan bahan-bahan yang mungkin dihadapi dalam sampel. Terdapat sepuluh parameter yang harus dikumpulkan untuk melakukan validasi metode analisis yaitu: 1. linearitas (range atau daerah kerja) 2. batas deteksi (LOD : limit of detection) 3. batas kuantitasi (LOQ : limit of quantification) 4. presisi (ketelitian) 5. akurasi (ketepatan) 6. sensitivitas 7. selektivitas 8. uji ketegaran (robustness) 9. uji ketangguhan (ruggedness) 10. ketidakpastian (uncertainty) Cara mengukur parameter dalam melakukan validasi metode akan dijelaskan pada bagian masing-masing. Adapun bagaimana penerapan dari sepuluh parameter tersebut aka dijelaskan pada kegiatan belajar 4 yaitu bagaimana meracang suatu kegiatan validasi metode analisis 1. Linearitas dan jangkauan kerja Menunjukkan kemampuan suatu metode analisis memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. linearitas ditentukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya (minimal 5 larutan deret standar), sehingga akan didapat hubungan antara konsentrasi dan respon pengukuran melalui persamaan garis pada kurva kalibrasi yang ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasinya seperti terdapat pada Gambar 3.1. Kurva Kalibrasi Persamaan Garis r Gambar 3.1 Hubungan dalam linearitas Koefisien korelasi (r) inilah yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah :
>/= 0,9970 (ICH 1995) ICH : International Conference on Harmonization >/= 0,9980 (WA Laboratory Operations Manager) WA : West Australian >/= 0,9980 (AOAC) Adapun tahapan pekerjaan pada parameter linearitas adalah : 1) Dibuat tujuh deret larutan standar ( misalnya kosentrasi 2,5 : 5,0: 7,5 : 10,0 : 12,5 :15,0 dan 17,5 ppm). 2) dilakukan pengukuran respon untuk masing-masin larutan standar. 3) Dibuat persamaan garisnya dengan metode regresi linear y = bx + a (b kemiringan garis dan a: intersep) 4) Tentukan nilai koefisien korelasinya yang menunjukkan linearitas kurva kalibrasi. 5) Lakukan pekerjaan sebanyak 3 kali pengulangan. Kurva kalibrasi untuk menentukan parameter linearitas terdapat pada Gambar 3.2 Gambar 3.2 Persamaan regresi linear y = bx + a 2. Sensitivitas Sensitivitas masih berkaitan dengan linearitas persamaan regresi linear metode analisis, maka dari kurva kalibrasi dapat pula langsung menentukan sensitivitas metode. Sensitivitas metode menunjukkan kemampuan dari suatu alat atau prosedur/metode penentuan untuk membedakan perbedaan kecil dari konsentrasi analit. Sensitivitas metode ditentukan berdasarkan nilai kemiringan garis (slope) dari persamaan regresi kurva standar. Nilai kemiringan garis yang kecil menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi yang kecil tidak terlalu berpengaruh terhadap sinyal detektor yang dihasilkan, sehingga sensitivitas menjadi kurang baik. Sebaliknya apabila nilai kemiringan garis besar (tegak) menunjukkan
perubahan konsentrasi yang tidak terlalu kecil akan tetapi dapat berpengaruh besar terhadap sinyal detektor. Sehingga metode analisis memiliki sensitivitas yang baik. 3. Batas Deteksi, (Limit of Detection,LOD) Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. LOD juga didefinisikan sebagai konsentrasi terendah yang dapat dibedakan dari kebisingan latar belakang dengan tingkat kepercayaan tertentu. Ada beberapa metode untuk menentukan LOD, yang semuanya tergantung pada analisis spesimen dan pemeriksaan sinyal untuk rasio kebisingan blanko. Minimum persyaratan untuk sinyal terhadap kebisingan dapat digunakan untuk menentukan LOD. LOD merupakan parameter yang dapat dipengaruhi oleh perubahan kecil dalam sistem analisis (misalnya suhu, kemurnian reagen, efek matriks, kondisi berperan). Oleh karena itu, penting bahwa parameter ini selalu dilakukan oleh laboratorium dalam melakukan validasi metode. Pengujian LOD a. Untuk metode non instrumen, batas deteksi ditetapkan dengan melakukan analisis sampel yang mengandung analit dalam kadar yang diketahui dan menentukan batas terendah kadar analit yang dapat dideteksi. LOD = 3 (SD/b) SD = simpangan baku blangko, b = kemiringan garis regresi (Y = bx + a) b. Untuk metode instrumen, batas deteksi dilakukan dengan mengukur besarnya respon instrumen dari larutan blanbko dan menghitung simpangan bakunya. LOD = Nilai rata-rata blanbko sampel + 3 SD 4. Batas Kuantisasi (LOQ) Batas kuantitasi adalah konsentrasi terendah analit yang dapat ditentukan dengan akurasi yang bisa diterima. Pengujian a. Untuk metode non isntrumental, umumnya ditentukan dengan melakukan analisis sampel yang mengandung analit dalam jumlah yang diketahui lalu menetapkan kadar terendah analit yang dapat dideteksi dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima.
b. Untuk metode instrumental, umumnya dengan mengukur besarnya respon latar belakang analisis dengan cara menganalisis sejumlah larutan blangko sampel (yang tidak mengandung analit) sekurang-kurangnya 7 kali pengulangan. Pengujian LOD dan LOQ dapat pula ditentukan secara bersamaan berdasarkan persamaan regresi linier yang diperoleh pada uji linearitas. LOD dan LOQ dihitung dari rerata kemiringan garis dan standar deviasi kurva standar yang diperoleh. LOD = 3 (SD/b); dan LOQ= 10 (SD/b) SD = standar deviasi kurva standar, (s / ) b = kemiringan garis regresi (Y = bx + a) Pada Tabel 3.1 disajikan hasil pengolahan data penentuan LOD dan LOQ Tabel 3.1 Contoh Pengolahan Data LOD dan LOQ dari kurva kalibrasi standar No. x (ppm) y ŷ x 2 (yi-ŷ) (yi-ŷ) 2 1 2,50 0,0615 0,0616 6,25-0,0001 0,0000 2 5,00 0,1306 0,1346 25,00-0,0040 0,0000 3 7,50 0,2113 0,2076 56,25 0,0037 0,0000 4 10,00 0,2789 0,2806 100,00-0,0017 0,0000 5 12,50 0,3677 0,3536 156,25 0,0141 0,0002 6 15,00 0,4134 0,4266 225,00-0,0132 0,0002 7 17,50 0,5013 0,4996 306,25 0,0017 0,0000 Σx = 70,00 Σy =1,9647 0,0004 x = 10,00 y = 0,2807 0,0001 Sy/x = ( ŷ) b= 0,0292 =, = 0,0034 Maka nilai LOD dan LOQ nya adalah: LOD = /
, = = 0,3493 ppm, LOQ = / =, = 1,11644ppm, 5. Presisi Presisi didefinisikan sebagai keterdekatan hasil yang diterima (baik sebagai nilai teoritis maupun sebagai nilai rujukan yang diterima) dengan nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran. Presisi dinyatakan dengan 2 cara, yaitu: Uji Ketahanan (repeatability) Uji ketertiruan (reproducibility) Penentuan nilai presisi metode dapat dilakukan melalui cara: a. Larutan sampel yang telah disiapkan diukur dengan AAS sebanyak 7 kali ulangan. b. Ketelitian diukur dengan menghitung persentase relatif standar deviasi (%RSD) dengan terlebih dahulu menentukan standar deviasi berdasarkan data hasil percobaan yang diperoleh. s = ( ) % RSD = x 100% Pada Tabel 3.2 disajikan contoh perhitungan presisi metode analisis
No. Tabel 3.2 Contoh perhitungan presisi metode analisis x kadar (mg/g) x x (x x ) 1 2,0528-0,0333 0,00110606 2 2,0377-0,0483 0,00233493 3 2,0610-0,0250 0,00062705 4 2,0678 0,0270 0,00072885 5 2,1240-0,0182 0,00033101 6 2.1459 0,0380 0,00144040 Σx =14,6022 14,6022 0,0599 0,00358363 x = 2,0860 0,0101593 s = 0,0411 RSD (%) 1,97 Nilai presisi metode menunjukkan nilai RSD (%) adalah 1,97 untuk memahami persyaratan nilai RSD silahkan Anda membuka rujukan pada link berikut ini Reference of Modul PPG Teknik kimia. 6. Akurasi Akurasi menunjukkan derajat kedekatan hasil dari sederet pengukuran yang diperoleh dari contoh yang homogen pada kondisi tertentu. Akurasi ini menandakan suatu metode baik dilakukan untuk analaisis ini, jika akurasinya baik berarti prosedur ini baik. Terdapat 3 cara dalam metode ujinya, yaitu: Uji Pungut Ulang (Recovery Test) Uji relatif terhadap akurasi metode baku Uji terhadap standard reference material (SRM) Penentuan akurasi metode analisis a. Dilakukan dengan membuat lautan sampel sebanyak 7 buah dan ditambahkan masingmasing kedalamnya larutan SRM kalsium 15 ppm sebanyak 1 ml. b. Diukur masing-masing larutan dengan SSA. c. Dihitung persen perolehan kembali (% recovery) dengan rumus:
% perolehan kembali = ( ) x 100..(3.1) Cf = Konsentrasi total sampel yang ditambah analit. CA = Konsentrasi sampel sebenarnya C*A = Konsentrasi analit yang ditambahkan Hasil pengujian akurasi dapat dilihat pada Tabel 3.3 Tabel 3.3 Pengolahan data akurasi metode analisis Pengulangan ke- Perolehan kembali Perolehan kembali (µg/ml) (%) 1 1,4623 97,49 2 1,4658 97,72 3 1,4829 98,86 4 1,4987 99,32 5 1,4863 99,09 6 1,4760 98,40 7 1,4760 98,40 7. Selektivitas dan Spesifitas Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama walaupun adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Parameter selektivitas dapat dilakukan untuk tujuan berikut ini: a. Untuk identifikasi Metode harus mampu menyeleksi senyawa-senyawa yang ada dalam sampel yang berkaitan dengan struktur molekulnya. Metode tersebut dapat dibuktikan dengan hasil positif (atau dibandingkan dengan bahan acuan standar yang diketahui) dari sampel yang
mengandung analit dan digabung dengan hasil negatif dari sampel yang tidak mengandung analit. b. Untuk penetapan cemaran Pengujian metode analisis dilakukan dengan menguji sampel yang ditambahkan sejumlah tertentu cemaran atau hasil urai dan terlihat dengan nyata cemaran itu dapat ditetapkan secara akurat dan presisi yang memadai. Penentuan selektivitas a. Dilakukan dengan membuat lautan sampel sebanyak 7 buah dan ditambahkan masingmasing kedalamnya larutan standar Mg 1 ppm sebanyak 50 µl. b. Diukur masing-masing larutan dengan AAS. c. Dibandingkan hasil perolehan kadarnya dengan uji- t dengan rumus: t = x keterangan: t x n s = besaran dalam perhitungan batas kepercayaan dan uji keberartian rataan. = rerata selisih antar terok = jumlah terok = simpangan baku dari selisih antar terok Contoh hasil pengujian selektivitas dapat ditunjukkan pada Tabel 3.4 Tabel 3.4 Data pengolahan selektivitas metode analisis Pengulangan Kadar sampel Kadar sampel yang selisih x diganggu 1 2,0528 2,2774-0,2246 2 2,0377 2,2746-0,2369 3 2,0610 2,2568-0,1958 4 2,1130 2,2774-0,1643 5 2,0678 2,2760-0,2082 6 2,1240 2,2842-0.1602 7 2,1459 2,3047-1589 Σx 14,6022 15,9511-1,3489 x 2,0860 2,2787-0,1927 s 0,0411 0,0142 0,0322
t = -0,1927 7/0,0322 t = -15,83 Pada batas kepercayaan 95% pada daerah pengujian berikut kriteria penerimaan : t hitung 2,45 Daerah kriteria penolakan : t hitung 2,45 t hitung < t tabel, sehingga dinyatakan dipertahankan dan tidak ada perbedaan kadar kalsium pada sampel yang ditambah Mg dengan yang tidak ditambah Mg. sehingga selektivitas metode dinyatakan baik. 8. Uji Ketangguhan (Ruggedness) Uji Ketangguhan (Ruggedness) adalah parameter uji derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, dan hari yang berbeda. Uji ketangguhan dilakukan untuk mengetahui perubahan reliabilitas metode uji dengan berjalannya waktu rentannya metode uji terhadap adanya perubahan kondisi pengujian. Penentuan uji ketangguhan a. Dilakukan dengan mengukur larutan standar sebanyak 5 buah dengan 3 kali waktu pengukuran yang berbeda. b. Diukur masing-masing larutan dengan AAS. c. Dibandingkan hasil perolehan kadarnya dengan uji- F (Anova). Uji ketangguhan ini sebagai uji pembanding untuk metode sebelumnya, jika dilakukan uji ketegaran ini maka tidak perlu dilakukan pembandingan metode. Hasil uji ketangguhan metode dapat ditunjukkan pada Tabel 3.5 Tabel 3.5 Data pengolahan ketangguhan metode analisis Konsentrasi Pengulangan 1 2 3 2,50 0,0643 0,0644 0,0606 5,00 0,1250 0,1267 0,1156 7,50 0,1885 0,1927 0,1799 10,00 0,2309 0,2307 0,2185 12,50 0,2979 0,2926 0,2863 Σ y 0,9066 0,9071 0,8609 2,6746 y 2 0,8219 0,8228 0,7411 2,3859
n=5 N=5 N = 15 Sumber ragam Jumlah kuadrat derajat bebas kuadrat rerata antar-sampel 2,3859/3-(2,6746) 2 /15 2 0,3184/2 = 0,1592 (between smple) = 0,3184 dalam-sampel (within sample) Dari penguranan= 2,,6746 4 2,6746/4 = 0,6687 F hitung =,, Dari tabel F nilai F tabel adalah 6,944 (P=0,05), karena nilai hasil hitungan F(=4,200) lebih kecil daripada 6,944, maka hipotesis nol diterima rerata sampel tidak berbeda secara signifikan. 9. Uji Ketangguhan (Robustness) Untuk memvalidasi ketangguhan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase gerak (1%), ph fase gerak (± 0,2 unit), dan perubahan temperature kolom (± 2-3 C). Robustness adalah ukuran bagi suatu metode analisis dalam mempertahankan unjuk kerjanya dalam situasi dimana pengaturan kondisi analisis tidak sesempurna seperti yang ditetapkan dalam metode yang bersangkutan. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah. 10. Uji Ketidakpastian (Uncertainty) Sebagaimana telah dituliskan pada dokumen standar Persyaratan Umum Kompetensi Laboratorium Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi ISO/IEC 17025:2005 telah diatur pula persyaratan tentang ketidakpastian, yaitu dalam klausul 5.4.6. Dalam standar itu diatur bahwa laboratorium wajib mempunyai dan menerapkan prosedur untuk mengestimasi ketidakpastian pengukuran. Estimasi ketidakpastian tersebut harus wajar (reasonable) dan didasarkan pada pengetahuan atas unjuk kerja metode, dan harus menggunakan data-data yang diperoleh dari pengalaman sebelumya serta data validasi metode. Istilah ketidakpastian pengukuran yang digunakan dalam peraturan ini berdasarkan pada kosakata istilah dasar dan umum dalam
metrologi adalah parameter yang terkait dengan hasil pengukuran, yang mencirikan penyebaran nilai-nilai yang cukup dan dapat dikaitkan dengan pengukuran. Penentuan Estimasi Ketidakpastian Pengukuran pada pembuatan Larutan Standar Cd 1000 mg/l Pembuatan larutan standar Cd 1000 mg/l Cara kerja sesuai SNI: Logam Cd dibersihan lapisan luar dari oksidanya, kemudian dilarutkan dengan asam nitrat dan dimasukkan dalam labu ukur 1000 ml, ditambahkan aquabides sampai batas. Untuk lebih lengkapnya materi ketidakpastian metode analisis silahkan kunjungi link berikut ini.reference of Modul PPG Teknik kimia