IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini telah dilakukan pengembangan dan validasi metode analisis untuk penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit secara KCKT menggunakan kolom C 18 dengan alasan karena kolom ini sudah umum digunakan dan sudah dimiliki oleh sebagian besar laboratorium pangan. Komposisi fase gerak yang digunakan terdiri dari pelarut organik dan air, tanpa penambahan larutan buffer dan pasangan ion, sehingga setelah penggunan selesai, alat KCKT dapat segera dimatikan tanpa pencucian kolom terlebih dahulu menggunakan air. Penelitian hasil pengembangan, validasi dan uji coba metode analisis yang telah dilakukan oleh peneliti sebagai berikut: 4.1 Penetapan aktivitas baku vitamin A Sebelum penelitian ini dimulai, perlu dilakukan penetapan aktivitas baku vitamin A menggunakan spektrofotometer UV-Vis yang sudah dikalibrasi. Penetapan ini perlu dilakukan karena sifat dari vitamin A yang mudah rusak oleh pengaruh udara dan cahaya. Bila tidak dilakukan penetapan aktivitas baku vitamin A, maka kadar baku vitamin A tidak sesuai dengan kadar yang sebenarnya dan akibatnya hasil pengujian tidak akurat. Data uji penetapan aktivitas baku vitamin A dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8. Data hasil uji penetapan aktivitas baku vitamin A No. Bobot Baku (g) Faktor Kadar Baku Absorban Pengenceran Vit. A (IU/g) 1 0, , , , , , Rata-rata (IU/g) SD (IU/g) 15954,51 RSD (%) 0,94 Data yang dipereleh menunjukan kadar baku vitamin A adalah IU/g dengan RSD 0,94 %. Dari data diperoleh dapat disimpulkan bahwa baku vitamin A tersebut dapat digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya.

2 Pemilihan kondisi analisis optimum Sebelum disuntikkan ke dalam sistem KCKT, larutan baku dan larutan sampel disiapkan dengan cara menimbang, lalu melarutkannya menggunakan n- pentana dan 2-propanol, ditambahkan larutan butil hidroksi toluena dan tetra-n- butil ammonium hidroksida. Adapunun maksud dari penambahan perekaksi- pereaksi tersebut adalah sebagai berikut: penambahan pereaksi n-pentana untuk membantu mban kelarutan minyak goreng sawit dalam pelarut 2-propanol. Minyak goreng sawit merupakan senyawa yang sangat non polar, sedangkan 2-propanol bersifat semi polar. Agar minyak goreng sawit mudah bercampur dengan 2- propanol, o maka minyak goreng sawit tersebut dilarutkan terlebih dahulu dengan pelarut lain (n-pentana) yang lebih mudah bercampur dengan minyak goreng sawit, lalu diencerkan dengan 2-propanol. Pereaksi butil hidroksi toluena berfungsi untuk mencegah oksidasi vitamin A. Oksidasi terjadi akibat pengaruh udara dan cahaya, yang akan membentuk yang selanjutnya radikal bebas tersebut dapat mengoksidasi vitamin A. Butil hidroksi toluena akan beraksi dengan radikal bebas tersebut, sehingga mencegah terjadinya reaksi oksidasi vitamin A. Pereaksi tetra-n-butil ammonium hidroksida berfungsi untuk mengubah vitamin A palmitat atau retinil palmitat menjadi retinol. Tanpa adanya reaksi tersebut, retinil palmitat sangat sulit untuk dianalisis dengan KCKT karena sifat dari retinil palmitat yang sangat non polar, sehingga terjadi inter aksi yang kuat dengan fase diam dan akibatnya retinil palmitat tidak dapat dielusi oleh fase gerak yang digunakan. Reaksi yang terjadi antara vitamin A palmitat dengan tetra-n-butil ammonium hidroksida dapat dilihat pada Gambar 3. + Retinil palmitat Tetra-n-butil ammonium hidroksida Retinol Gambar 3. Reaksi antara retinil palmitat dengan tetra-n-butil ammonium hidroksida menghasilkan retinol.

3 43 Untuk mendapatkan kondisi analisis optimum vitamin A dalam minyak goreng sawit, beberapa parameter kondisi KCKT perlu dioptimasi antara lain: komposisi fase gerak, laju alir fase gerak dan detektor yang digunakan. Komposisi fase gerak dan laju alir yang optimum memberikan jumlah lempeng teoritis (N) yang besar, resolusi (Rs) yang lebih besar dari 1,5, faktor ikutan (Tf) yang mendekati satu, serta waktu retensi yang relatif singkat, sedangkan optimasi detektor yang digunakan untuk menentukan spesifisitas dan selektivitas yang tinggi dalam analisis tanpa adanya gangguan dari matriks sampel. Dalam penelitian ini digunakan kolom C18 yang bersifat non polar, sehingga sistem kromotagrafi ini merupakan sistem kromatografi fase balik. Daya elusi dalam sistem s kromatografi ini berbanding terbalik dengan polaritas fase gerak. Semakin kecil polaritas fase gerak, maka daya elusinya semakin besar. Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari fase gerak berupa pelarut murni (asetonitril atau metanol) dan campuran pelarut organik (asetonitril atau metanol) dengan air. Dalam hal ini, air merupakan senyawa yang paling polar bila dibandingkan dengan asetonitril dan metanol. Apabila jumlah air dalam komposisi fase gerak tersebut ditambah, maka daya elusinya semakin rendah dan akibatnya waktu retensi analit semakin besar. Namun dengan berkurangnya daya elusi dapat memperbaiki bentuk kromatogram tersebut (resolusi, jumlah lempeng teoritis ataupun tailing faktor) hingga diperoleh kondisi yang optimum. Pada pencarian kondisi analisis optimum, laju alir juga divariasikan mulai dari 0,6 ml/menit sampai dengan 1,75 ml/menit. Laju alir berbanding lurus dengan waktu retensi. Pada optimasi laju alir dipilih yang mempunyai waktu terpendek tetapi tidak mengabaikan kapasitasnya. Waktu retensi dikendalikan oleh koefesien distribusi (k), jika harga k besar maka komponen dalam fase diam lebih besar dari pada dalam fase gerak, sehingga komponen akan tinggal lebih lama dalam fase diam. Kecepatan migrasi ditentukan oleh jumlah komponen yang terdapat dalam fase gerak, karena komponen hanya bergerak dibawa oleh fase gerak, sedangkan laju alir mempengaruhi migrasi suatu komponen. Untuk fase gerak yang viskositasnya besar akan menyebabkan peningkatan tekanan pada kolam, sehingga bila menggunakan fase gerak dengan menggunakan pelarut yang mempunyai viskositas yang besar, maka laju alirnya tidak boleh besar. Dalam hal

4 44 ini, asetonitril merupakan pelarut yang mempunyai viskositas paling kecil bila dibandingkan denga air dan metanol. Dalam hal ini, bila komposisi fase gerak terdiri dari asetonitril dengan jumlah yang besar maka dalam analisis bila menggunakan laju alir yang besar tekanan kolom tetap rendah. Pada pencarian kondisi analisis optimum, detektor yang digunakan juga divariasikan. Detektor yang digunakan pada penelitian ini adalah detektor ultraviolet dan detektor fluoresens. Detektor ultraviolet digunakan untuk mendeteksi eteke komponen zat yang dapat menyerap cahaya di daerah ultraviolet ( nm). Keuntungan dari detektor ini adalah pemilihan panjang gelombang yang luas dan sensitivitas terhadap alat yang baik. Detektor fluoresens digunakan untuk mendeteksi komponen zat yang dapat menyerap cahaya dan kemudian memancarkan manc cahaya pada panjang gelombang yang lebih tinggi. Dibandingkan dengan detektor ultra violet, detektor flouresen lebih peka dan lebih selektif, karena hanya komponen zat yang berfluoresensi saja yang dapat dideteksi. Vitamin A dapat dideteksi baik dengan menggunakan detektor ultraviolet maupun menggunakan gu n detektor fluoresens. Pada penelitian ini digunakan kolom C 18 (Waters Xbridge, dengan panjang 250 mm, diameter 4,6 mm ukuran partikel 5,0 µm). Pemilihan kondisi optimum dilakukan dengan memvariasikn komposisi fase gerak, laju alir dan detektor yang digunakan (detektor ultraviolet dan fluoresens). Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan komposisi fase gerak metanol dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 9, sedangkan data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol dengan detektor fluoresens dapat dilihat pada Tabel 10. Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol dan air dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 11, sedangkan data pengamatan a kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan gu n variasi komposisi fase gerak metanol dan air dengan detektor fluoresens dapat dilihat pada Tabel 12. Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan metanol dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 13,

5 45 sedangkan data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan metanol dengan detektor fluoresens dapat dilihat pada Tabel 14. Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 15 dan Tabel 17, sedangkan data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air dengan detektor fluoresens dapat dilihat pada Tabel 16 dan Tabel 18. Berdasarkan kromatogram yang dihasilkan dari berbagai kondisi optimasi percobaan dan dengan nilai skor yang diperoleh, diperoleh 1 kondisi analisis yang paling optimum untuk analisis vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit yaitu: komposisi fase gerak yang terdiri dari campuran asetonitril dan air (80:20), laju alir 1,75 ml/menit dengan detektor ultraviolet pada panjang gelombang 325 nm. Kromatogram blanko (minyak goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A) dan kromatogram baku vitamin A palmitat (dalam matriks minyak goreng sawit) yang dianalisis menggunakan KCKT kolom C18 pada kondisi optimum komposisi fase gerak yang terdiri dari campuran asetonitril dan air (80:20), laju alir 1,75 ml/menit dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm dapat dilihat pada Gambar 4. Dari gambar 4 menunjukkan bahwa walaupun kromatogram matriks minyak goreng sawit memberikan banyak puncak, namun pada saat vitamin A keluar dari kolom dan dideteksi oleh detektor, di sekitar puncak/kurva vitamin A tidak ada matriks atau perekasi yang mengganggu dan memberikan waktu retensi yang sama dengan vitamin A, sehingga dengan kondisi KCKT tersebut matriks minyak goreng sawit dan pereaksi yang digunakan tidak mengganggu dalam analisis vitamin A dalam kondisi KCKT yang digunakan.

6 mv(x10) Detector A:325nm 2.50 mv(x10) Detector A:325nm Vitamin A/7.841/ min A min B Gambar 4. Kromatogram A (blanko minyak goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A) dan kromatogram B (baku vitamin A palmitat dalam matriks minyak goreng sawit); yang dianalisis menggunakan KCKT kolom C18 pada kondisi optimum dengan komposisi fase gerak yang terdiri dari campuran asetonitril dan air (80:20), laju alir 1,7 ml/menit dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm. 4.3 Uji kesesuaian sistem (UKS) Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum instrumen KCKT digunakan. Secara normal terdapat variasi dalam peralatan dan teknik analisis, maka uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan bahwa sistem operasional sudah sesuai dan memberikan hasil yang diharapkan sesuai dengan tujuan analisis. Data uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada Tabel 19. Dari tabel tersebut dapat dilihat bahwa pada penyuntikan ulang larutan baku vitamin A dengan 6 kali pengulangan, diperoleh waktu retensi (Rt) 7,900 menit dengan standar deviasi relatif (RSD) 0,223 %, luas area dengan RSD 0,726 %. Nilai RSD kurang dari 1,0 %, maka data ini menunjukkan tidak terjadi perubahan yang signifikan dari waktu retensi dan luas area baku vitamin A dan sistem operasional yang digunakan teruji efektif untuk analisis dan dapat disimpulkan bahwa UKS sudah memberikan hasil yang baik dan sistem KCKT tersebut dapat digunakan untuk analisis vitamin A.

7 Tabel 9. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan, fase gerak metanol 100% dengan berbagai variasi laju alir, detektor UV pada panjang gelombang 325 nm No, Laju Alir (ml/menit) Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 1,0 4, , , ,8 5, , , ,6 7, , , Tabel 10. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan: fase gerak metanol 100% dengan berbagai variasi laju alir detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm No, Laju Alir (ml/menit) Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 1,0 4, , , ,8 5, , , ,6 7, , , Tabel 11. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol dan air; laju alir: 1,50 ml/menit, detektor UV pada panjang gelombang 325 nm No, Komposis Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 85:15 14, , , :10 7, , , :5 4, , , ,5:2,5 3, , ,

8 Tabel 12. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol dan air; laju alir: 1,50 ml/menit, detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm No, Komposis Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 85:15 14,293 2 Baik , :10 7,835 3 Baik , :5 4, , , ,5:2,5 3, , , Tabel 13. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan metanol; laju alir: 1,0 ml/menit, detektor UV pada panjang gelombang 325 nm No, Komposisi Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 75:25 5, , , :50 4, , , :75 4, , ,

9 Tabel 14. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan metanol; laju alir: 1,0 ml/menit, detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm No, Komposisi Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 75:25 5, , , :50 4, , , :75 4, , , Tabel 15. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air; laju alir: 1,5 ml/menit, detektor UV panjang 325 nm No, Komposisi Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 100:0 3, , , :5 4, , , :10 5, , , :15 7, , , :20 9, , , :25 13,163 2 Baik ,

10 Tabel 16. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air; laju alir: 1,5 ml/menit, dengan detector fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm No, Komposisi Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 100:0 3, , , :5 4, , , :10 5, , , :15 7, , , :20 9, , , :25 13,352 2 Baik , Tabel 17. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air; laju alir: 1,75 ml/menit, detektor UV pada panjang gelombang 325 nm No, Komposisi Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 100:0 3, , , :5 3,789 3 Baik , :10 4,778 3 Baik , :15 6,250 3 Baik , :20 8,456 3 Baik , :25 11,259 2 Baik ,

11 Tabel 18. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air; laju alir: 1,5 ml/menit, detektor fluoresens panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm No. Komposisi Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs) Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 100:0 3, , , :5 3, , , :10 4, , , :15 6, , , :20 8, , , :25 11, , ,

12 52 Tabel 19. Data hasil uji kesesuaian sistem (UKS) baku vitamin A No Kode Waktu Retensi (Rt) Luas Area 1 UKS 1 7, UKS 2 7, UKS 3 7, UKS 4 7, UKS 5 7, UKS 6 7, Rata-rata 7, SD 0, ,279 RSD 0,223 0,726 Syarat RSD (%) 1,0 1,0 4.4 Validasi metode analisis penetapan kadar vitamin A Kurva kalibrasi dan uji linieritas. Setelah diperoleh kondisi optimum untuk analisis dan uji kesesuaian sistem telah memenuhi sesuai dengan yang diinginkan, selanjutnya dilakukan validasi terhadap metode analisis tersebut. Validasi ini diawali dengan pembuatan kurva kalibrasi dan linieritas dengan rentang konsentrasi 0,4443 IU/mL sampai dengan 13,5233 IU/mL. Pemilihan rentang konsentrasi ini berdasarkan konsentrasi vitamin A yang ditambahkan ke dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran dan mencakup konsentrasi batas kuantisasi yaitu 5,73 IU/g. Untuk analisis vitamin A dalam minyak goreng sawit, baku untuk pembuatan kurva kalibrasi diperlakukan sama terhadap larutan uji, yaitu ditambahkan minyak goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A. Hal ini dimaksudkan untuk menyamakan adanya gangguan matriks dari minyak goreng sawit antara larutan uji dan larutan baku. Kurva kalibrasi vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dapat dilihat pada gambar 5. Dari hasil perhitungan statistik kurva kalibrasi memberikan nilai r 0,99997 dan Vxo 2,54 dimana kriteria linieritas yang dapat diterima adalah r minimal 0,995 dan V xo maksimal 5 % sehingga dapat disimpulkan bahwa linieritas baku vitamin A memenuhi uji linieritas. Selanjutnya dibuat kurva konsentrasi versus faktor respon detektor dan kurva konsentrasi versus residual. Kurva hubungan antara konsentrasi vitamin

13 53 A terhadap faktor respon detektor dapat dilihat pada Gambar 6 dan kurva hubungan antara konsentrasi vitamin A terhadap residual dapat dilihat pada Gambar 7. Dari kedua kurva tersebut dapat dilihat adanya penyebaran secara random antara konsentrasi vitamin A dengan faktor respon detektor dan konsentrasi vitamin A dengan residual yang mendekati garis tengah menunjukkan linieritas yang baik. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa linieritas baku vitamin A dengan rentang konsentrasi 0,4443 IU/mL sampai dengan 13,5233 IU/mL memenuhi kritria uji linieritas dan dapat diterima untuk perhitungan analisis selanjutnya Luas Area Konsentrasi Vitamin A (IU/mL) Gambar 5. Kurva kalibrasi baku vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit

14 Faktor Respon Detektor Residual Konsentrasi Vit. A (IU/mL) Konsentrasi Vitamin A (IU/mL) Gambar 6. Hubungan antara konsetrasi vitamin A dengan faktor respon detektor. Gambar 7. Hubungan antara konsen sentrasi vitamin A terharesidual Uji presisi Presisi pengukuran kuantitatif dapat ditentukan dengan menganalisis sampel yang sama secara berulang-ulang (minimal 6 x pengulangan), kemudian dihitung nilai standar deviasinya (SD) dan dari nilai standar deviasi tersebut dihitung nilai standar deviasi baku relatif (RSD) atau koefesien variasi (KV). Dari nilai % RSD yang diperoleh dibandingkan dengan % RSD Horwitz yaitu suatu kurva berbentuk terompet yang menghubungkan reprodusibilitas (presisi yang dinyatakan sebagai % RSD dengan konsentrasi analit). Presisi metode analisis diekspresikan sebagai fungsi dari konsentrasi melalui persamaan: Presisi suatu metode akan memenuhi syarat apabila %RSD yang diperoleh dari percobaan lebih kecil dari 2/3 % RSD Horwitz dan berdasarkan persamaan Horwitz dapat dipastikan bahwa, semakin kecil konsentrasi suatu analit, maka nilai presisi yang dapat diterima akan semakin besar. Pada penelitian ini, uji presisi dilakukan analisis terhadap tiga konsentrasi, yaitu konsentrasi rendah ( 23,48 IU/g), konsentrasi sedang (46,74 IU/g) dan konsentrasi tinggi (71,28 IU/g), dari masing-masing

15 55 konsentrasi tersebut selanjutnya dilakukan uji presisi sebanyak 6 kali pengulangan dan pengujian dilakukan oleh analis yang sama dan waktu yang hampir bersamaan (ripitabilitas). Presisi suatu metode dinyatakan memenuhi syarat keberterimaan jika % RDS lebih kecil dari 2/3 CV Horwitz. Data hasil uji presisi dapat dilihat pada Tabel 20. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa nilai RSD untuk ripitabilitas yang dihasilkan tidak melebihi 2/3 dari nilai RSD berdasarkan rumus Horwizt. Hal ini menunjukkan bahwa sistem operasional alat dan analis memiliki nilai presisi yang baik terhadap metode dengan respon yang relatif konstan, sehingga hasil pengukuran memiliki nilai presisi yang memenuhi persyaratan Uji akurasi Berbeda halnya dengan presisi yang merujuk pada pengertian ketelitian, akurasi merujuk pada pengertian ketepatan (kecermatan). Penentuan akurasi metode untuk membuktikan kedekatan hasil analisis dengan nilai benar. Akurasi dapat ditetapkan dengan 3 cara yaitu; penetapan dengan menggunakan bahan acuan bersertifikat atau standard reference material (SRM), membandingkan menggunakan metode yang telah valid (metode resmi atau metode standar) dan menghitung uji perolehan kembali dengan menggunakan penambahan standar (standar adisi). Pada penelitian ini digunakan metode penambahan standar adisi dan menghitung persen perolehan kembali. Uji perolehan kembali dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah baku pembanding vitamin A ke dalam sampel yang sebelumnya telah ditentukan kadar vitamin A-nya (sampel yang telah ditentukan nilai presisinya). Selanjutnya sampel dianalisis hingga diperoleh nilai persen perolehan kembalinya. Nilai persen perolehan kembali yang mendekati 100 % menunjukkan bahwa metode tersebut memiliki ketepatan yang baik dalam menunjukkan tingkat kesesuaian dari rata-rata suatu pengukuran yang sebanding dengan nilai sebenarnya (true value).

16 56 Pada penelitian ini, uji akurasi dilakukan analisis terhadap tiga konsentrasi yang berbeda, yaitu konsentrasi rendah ( 23,48 IU/g), konsentrasi sedang (46,74 IU/g) dan konsentrasi tinggi (71,28 IU/g), dari masing-masing konsentrasi tersebut selanjutnya dilakukan uji akurasi sebanyak 6 kali pengulangan dan pengujian dilakukan pada waktu yang hampir bersamaan. Pengujian akurasi dilakukan dengan cara penambahan standar adisi dan akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali. Data hasil uji akurasi dapat dilihat pada Tabel 21. Dari tabel hasil uji akurasi dapat dilihat, secara keseluruhan nilai persen perolehan kembali berada dalam rentang 96,84 102,39 %, dimana kriteria persen perolehan kembali yang dapat diterima adalah %. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi kriteria untuk uji akurasi dan dengan kata lain metode yang telah dikembangkan ini memberikan hasil akurasi yang tidak berbeda dengan metode standar atau metode resmi Uji selektivitas (spesifisitas) Pada uji selektivitas (spesifisitas), dilakukan analisis terhadap sampel minyak goreng sawit yang sama pada uji presisi, namun pada saat penyiapan larutan uji ditambahkan senyawa-senyawa kimia lainnya yang mungkin terdapat atau sengaja ditambahkan ke dalam minyak goreng sawit. Senyawa kimia tersebut dapat berupa: senyawa anti oksidan (butil hidroksi anisol, butil hidroksi toluena, propil galat, tersier butil hidrokinon), vitamin yang larut dalam minyak (vitamin D dan vitamin E) dan senyawa kimia alami yang terdapat dalam minyak goreng sawit (beta karoten). Kromatogram campuran senyawa kimia yang sedang dilakukan uji selektivitasnya (tanpa penambahan vitamin A) dan baku vitamin A dengan matriks sampel minyak goreng sawit dapat dilihat pada Gambar 8. Data hasil uji selektivitas (spesifisitas) dapat dilihat pada Tabel 22.

17 Tabel 20. Data uji presisi penetapan kadar vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit No. Bobot Sampel Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A RSD 2/3 RSD Pengenceran SD (IU/g) RSD (%) (g) (IU/g) Rata-rata (IU/g) Horwitz (%) Horwitz (%) 1 2, ,56 2 2, ,83 3 2, ,17 23,48 0,46 1,97 7,26 4,84 4 2, ,99 5 2, ,73 6 2, ,60 7 2, ,83 8 2, ,63 9 2, ,00 46,74 0,90 1,93 6,54 4, , , , , , , , , , , , ,07 71,28 1,33 1,87 6,14 4, , , , , , ,86 Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan presisi vitamin A n a (Intersep) b (Slope) r 12 51, , ,

18 Tabel 21. Data uji akurasi penetapan kadar vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit No Bobot Sampel (g) Vit. A yang ditambahkan (IU) Pengenceran Luas Area Vit. A total (IU) Vit. A dari sampel (IU) Rekoveri Vit. A (%) 1 1, , , , ,15 2 1, , , , ,84 3 1, , , , ,18 4 1, , , , ,98 5 1, , , , ,92 6 1, , , , ,31 7 1, , , , ,94 8 1, , , , ,89 9 1, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,12 Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan akurasi vitamin A n a (Intersep) b (Slope) r 12 51, , , Rata-Rata Rekoveri (%) SD (%) RSD (%) 98,40 1,87 1,90 98,76 1,81 1,83 98,29 1,50 1,52 58

19 mv(x10) Detector A:325nm 2.50 mv(x10) Detector A:325nm Vitamin A/7.879/ min A min Gambar 8. Kromatogram A (campuran senyawa kimia yang sedang dilakukan uji selektivitasnya: butil hidroksi anisol, butil hidroksi toluena, propil galat, tersier butil hidrokuinon, vitamin D, vitamin E dan beta karoten) dan kromatogram B (baku vitamin A) dalam matriks sampel minyak goreng sawit yang dianalisis menggunakan KCKT kolom C18 pada kondisi optimum dengan komposisi fase gerak yang yang terdiri dari campuran asetonitril dan air (80:20) laju alir 1,75 ml/menit dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm. B Data yang diperoleh menunjukkan bahwa kromatogram yang dihasilkan tidak diganggu oleh adanya senyawa-senyawa yang sengaja ditambahkan ke dalam minyak goreng sawit dan pada uji t diperoleh hasil yang tidak berbeda bermakna bila dibandingkan dengan hasil dari presisi yang telah dilakukan, sehingga dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi syarat uji selektivitas (spesifitas) terhadap analit: senyawa anti oksidan (butil hidroksi anisol, butil hidroksi toluena, propil galat, tersier butil hidrokinon), vitamin yang larut dalam minyak (vitamin D dan vitamin E) dan senyawa kimia alami yang terdapat dalam minyak goreng sawit (beta karoten) Uji robustness. Pada uji robustness, dilakukan analisis terhadap sampel minyak goreng sawit yang sama pada uji presisi, namun pada metode tersebut dilakukan sedikit perubahan kecil seperti: perubahan penambahan atau pengurangan jumlah pereaksi yang digunakan, perubahan komposisi fase gerak, perubahan laju alir, dan perubahan merek kolom. Data hasil uji robustness dengan perubahan penambahan jumlah pereaksi menjadi: n-

20 60 pentana 3 ml, larutan antioksidan butil hidroksi toluena 3 ml dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida 10,5 ml dapat dilihat pada Tabel 23. Data hasil uji robustness dengan perubahan pengurangan jumlah pereaksi n-pentana 2 ml, larutan antioksidan butil hidroksi toluena 2 ml dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida 9,5 ml dapat dilihat pada Tabel 24. Data hasil uji robustness dengan perubahan komposisi fase gerak asetonitril:air (81:19) dan laju alir 1,74 ml/menit dapat dilihat pada Tabel 25. Data hasil uji robustness dengan perubahan komposisi fase gerak asetonitril:air (79:21) dan laju alir 1,76 ml/menit dapat dilihat pada Tabel 26. Data hasil uji robustness dengan perubahan menggunakan merek kolom yang berbeda dapat dilihat pada Tabel 27. Dari Tabel menunjukkan dalam uji t diperolah nilai t hitung lebih kecil dari t tabel, sehingga dapat disimpulkan hasil pengujian kondisi normal dengan hasil pengujian pada kondisi yang sedang diuji robutsnessnya memberikan hasil uji yang tidak berbeda bermakna Uji batas deteksi dan batas kuantisasi Pada penentuan uji batas deteksi dan batas kuantisasi dibuat larutan vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan konsentrasi 0,4988 IU/g sampai dengan 9,9970 IU/g. Kurva regresi kadar vitamin A terhadap tinggi noise dengan sinyal pada penentuan uji batas deteksi dan batas kuantisasi dapat dilihat pada Gambar Perbandingan tinggi noise terhadap tinggi sinyal (S/N) Kadar Vit. A (IU/g) Gambar 9. Kurva regresi kadar vitamin A terhadap tinggi noise dengan sinyal (S/N).

21 Tabel 22. Data uji selektivitas (spesifisitas) vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit No Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD Uji t (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) t Hitung t Tabel 1 2, ,20 2 2, ,68 3 2, ,81 47,36 0,99 1,609 2, , ,13 5 2, ,80 6 2, ,56 Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan uji selektivitas (spesifisitas) n a (Intersep) b (Slope) r 12 51, , ,

22 Tabel 23. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode pengurangan jumlah pereaksi menjadi: n-pentana 2 ml, larutan antioksidan butil toluena 2 ml dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida 9,5 ml No Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD Uji t (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) t Hitung t Tabel 1 2, ,59 2 2, ,46 3 2, ,07 47,24 0,91 1,431 2, , ,71 5 2, ,36 6 2, ,27 Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan uji selektivitas (spesifisitas) n a (Intersep) b (Slope) R 12 51, , , Tabel 24. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode pengurangan jumlah pereaksi menjadi: n-pentana 3 ml, larutan antioksidan butil toluena 3 ml dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida 10,5 ml No Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD Uji t (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) t Hitung t Tabel 1 2, ,31 2 2, ,62 3 2, ,78 46,90 0,99 0,415 2, , ,52 5 2, ,85 6 2, ,29 Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan uji selektivitas (spesifisitas) n a (Intersep) b (Slope) R 12 51, , ,

23 Tabel 25. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode perubahan komposisi fase gerak menjadi asetonitri: air (81:19) dan laju alir 1,74 ml/menit No Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD Uji t (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) t Hitung t Tabel 1 2, ,59 2 2, ,46 3 2, ,07 47,23 0,86 1,364 2, , ,71 5 2, ,36 6 2, ,27 Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan uji selektivitas (spesifisitas) n a (Intersep) b (Slope) R 12 51, , , Tabel 26. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode perubahan komposisi fase gerak asetonitri menjadi: air (79:21) dan laju alir 1,76 ml/menit No Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD Uji t (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) t Hitung t Tabel 1 2, ,92 2 2, ,59 3 2, ,68 47,37 0,87 1,744 2, , ,13 5 2, ,65 6 2, ,25 Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan uji selektivitas (spesifisitas) n a (Intersep) b (Slope) R 12 51, , ,

24 Tabel 27. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode penggunakan merek kolom C 18 yang berbeda (kolom merek Shimadzu Shim-pack, Jepang: panjang 250 mm, diameter dalam 1,46 mm dan ukuran partikel 5 m) No Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD Uji t (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) t Hitung t Tabel 1 2, ,75 2 2, ,02 3 2, ,75 46,41 0,99 0,856 2, , ,99 5 2, ,82 6 2, ,15 Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan uji selektivitas (spesifisitas) n a (Intersep) b (Slope) R 12 51, , ,

25 65 Setelah dianalisis dan dibuat persamaan regresi linier, diperoleh nilai batas deteksi vitamin A dalam minyak goreng sawit adalah 1,66 IU/g dan nilai batas kuantisasi vitamin A dalam minyak goreng sawit adalah 5,89 IU/g. Batas deteksi dan batas kuantisasi yang diperoleh sudah dapat diterima, karena untuk mengetahui apakah minyak goreng sawit yang diuji memenuhi syarat atau tidak dalam hal kandungan vitamin A adalah minimal 45 IU/g, sedangkan batas deteksi dan batas kuantitasi yang diperolah jauh di bawah 45 IU/g. 4.4 Uji coba penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran. Hasil analisis terhadap minyak goreng sawit yang beredar di pasaran dan pada labelnya mengklaim akan kandungan vitamin A menunjukkan bahwa pada ke-empat sampel mengandung vitamin A berturut-turut sebesar 16,75 IU/g, 28,39 IU/g, 29,07 IU/g dan 66,65 IU/g (75 % sampel tidak memenuhi persyaratan kadar vitamin A yang akan ditetapkan pemerintah). Data hasil analisis terhadap sampel minyak goreng sawit yang beredar di pasaran dapat dilihat pada tabel 28. Dari tabel tesebut dapat disimpulkan bahwa kandungan vitamin A dalam sampel yang diuji masih banyak yang belum memenuhi persyaratan kadar vitamin A yang akan ditetapkan oleh pemerintah. Hasil evaluasi kromatogram dan SD yang diperoleh dari penetapan kadar vitamin A dapat disimpulkan bahwa matriks sampel yang terkandung dalam berbagai merek minyak goreng sawit yang beredar di pasaran tidak mengganggu dalam analisis penetapan kadar vitamin A, sehingga metode yang telah dikembangkan dan telah divalidasi oleh peneliti dapat digunakan sebagai metode alternatif untuk penetapan kadar vitamin A dalam berbagai merek minyak goreng sawit. Dari hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap metode analisis yang telah dikembangkan dan telah divalidasi oleh peneliti, dapat dibuat ringkasan hasil penelitian sebagai berikut:

26 66 1. Hasil optimasi metode analisis penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit secara KCKT menggunakan kolom C 18 diperoleh hasil yang optimal menggunakan komposis fase gerak asetonitril:air (80:20) dengan laju alir 1,75 ml/menit menggunakan detektor ultraviolet pada panjang gelombang 325 nm, dibuktikan dengan perolehan skor yang tinggi dalam penilaian kromatogram KCKT. 2. Metode yang telah dikembangkan peneliti hasilnya sudah valid yang dibuktikan dengan hasil validasi dari metode tersebut yang sudah memenuhi persyaratan yang ditentukan. 3. Metodenya selektif, dibuktikan dari hasil selektivitas pada bagian uji validasi yang telah dilakukan dan hasilnya sudah memenuhi persyaratan yang ditentukan. 4. Metodenya cepat, dibuktikan dengan persiapan sampel pada metode yang telah dikembangkan peneliti tanpa proses saponifikasi, tanpa proses ektraksi dan tanpa proses pemekatan atau penguapan pelarut, sehingga untuk sekali pengujian sampel menggunakan metode tersebut diperlukan waktu sekitar 2 jam, sedangkan bila menggunakan metode resmi yang sudah ada (dengan proses saponifikasi, ekstraksi dan proses pemekatan atau penguapan pelarut) dari pengalaman yang pernah diperoleh peneliti diperlukan waktu sekitar 6 jam. 5. Metodenya mudah dan praktis, karena metode yang telah dikembangkan peneliti persiapan sampelnya tanpa proses saponifikasi, tanpa proses ekstraksi dan tanpa proses pemekatan atau penguapan pelarut, sehingga metode ini lebih mudah dan praktis; tanpa diperlukan keahlian dan peralatan khusus untuk proses persiapan sampel. 6. Metode yang sudah dikembangkan dan divalidasi oleh peneliti memiliki keunggulan-keunggulan seperti telah diuraikan di atas, namun kelemahannya metode ini hanya dapat digunanakan untuk penetapan kadar vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dan tidak dapat digunakan untuk penetapan kadar vitamin A dalam produk pangan yang lain, misalnya: susu, daging dan telur.

27 Tabel 28. Data hasil analisis penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran No Kode Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD RSD (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) (%) 1 Avn A 2, ,25 2 Avn B 2, ,24 16,75 0,70 4,17 3 Fvt 2, ,84 4 Fvt 2, ,95 28,39 0,78 2,76 5 Sva A 2, ,20 6 Sva B 2, ,94 29,07 0,18 0,61 7 Snc A 2, ,04 8 Snc B 2, ,65 66,35 1,85 2,78 Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan kadar vitamin A n a (Intersep) b (Slope) r 12 51, , ,