Lampiran 1. Gambar Alat KCKT dan Syringe 50 µl Alat KCKT Syringe 50 µl
Lampiran 2. Gambar Perangkat Penelitian Lainnya Ultrasonic cleaner Pompa vakum dan seperangkat penyaring fase gerak
Lampiran 2. (Lanjutan) Alat vortex Sentrifuge
Lampiran 2. (Lanjutan) Neraca analitik
Lampiran 3. Plasma Kontrol
Lampiran 4. Fase gerak
Lampiran 5. Kromatogram Penyuntikan Larutan Pirazinamida Baku, Fase Gerak Buffer Fosfat ph 7,4 : Metanol (96,8:3,2)
Lampiran 6. Kromatogram Penyuntikan Larutan Nikotinamid Baku, Fase Gerak Buffer Posfat ph 7,4 : Metanol (96,8:3,2)
Lampiran 7. Kromatogram Penyuntikan Plasma Kontrol
Lampiran 8. Kromatogram Penyuntikan Sampel Plasma Darah Pasien TB
Lampiran 9. Kromatogram Penyuntikan Larutan Pirazinamida Baku pada Pembuatan Kurva Kalibrasi A. Kromatogram dari Larutan Pirazinamida Baku Konsentrasi 2,4368 mm (300 mcg/ml) dengan Baku Dalam Nikotinamid Konsentrasi 1,2285 mm (150 mcg/ml)
Lampiran 9. (Lanjutan) B. Kromatogram dari Larutan Pirazinamida Baku Konsentrasi 3,2491 mm (400 mcg/ml) dengan Baku Dalam Nikotinamid Konsentrasi 1,2285 mm (150 mcg/ml)
Lampiran 9. (Lanjutan) C. Kromatogram dari Larutan Pirazinamida Baku Konsentrasi 4,0614 mm (500 mcg/ml) dengan Baku Dalam Nikotinamid Konsentrasi 1,2285 mm (150 mcg/ml)
Lampiran 9. (Lanjutan) D. Kromatogram dari Larutan Pirazinamida Baku Konsentrasi 4,8736 mm (600 mcg/ml) dengan Baku Dalam Nikotinamid Konsentrasi 1,2285 mm (150 mcg/ml)
Lampiran 9. (Lanjutan) E. Kromatogram dari Larutan Pirazinamida Baku Konsentrasi 6,4982 mm (800 mcg/ml) dengan Baku Dalam Nikotinamid Konsentrasi 1,2285 mm (150 mcg/ml)
Lampiran 10. Perhitungan Persamaan Regresi dan Kurva Kalibrasi Pirazinamida Baku yang Diperoleh secara KCKT pada λ 254 nm Data Rasio Luas Puncak dari Penyuntikan Larutan Pirazinamida Baku Konsentrasi 2,4363 mm 6,4982 mm dengan Baku Dalam Nikotinamid Konsentrasi 1,2285 mm dalam Plasma Konsentrasi ppm (mm) (μg/ml) Pirazinamida (PZA) Luas Puncak Nikotinamida (NIK) Rasio PZA/NIK 300 2,4368 8367 90446 0,09250824 400 3,2491 128463 383693 0,33480673 500 4,0614 383936 355131 1,08111091 600 4,8736 506451 301399 1,68033404 800 6,4982 504196 240060 2,10029159 Data Kalibrasi Pirazinamida Baku Rasio Luas Puncak Pirazinamida terhadap Nikotinamid (y) terhadap Konsentrasi (x) No. Konsentrasi PZA (mm) (x) Rasio Luas Puncak PZA / NIK (y) x.y x 2 y 2 1. 2,4368 0,09250824 0,225424072 5,9379942 0,00855777 2. 3,2491 0,33480673 1,087820558 10,556651 0,11209555 3. 4,0614 1,08111091 4,390823866 16,49497 1,16880081 4. 4,8736 1,68033404 8,189275988 23,751977 2,82352249 5. 6,4982 2,10029159 13,64811483 42,226603 4,41122478 Σ 21,1191 5,28905152 27,54145932 98,968195 8,5242014 Ratarata 4,22382 1,0578103 a = = = xy 2 x ( x)( y) 2 ( x) / n / n 27,54145932 (21,1191)(5,28905152) / 5 2 98,968195 (21,1191) / 5 27,54145932 22,3400016 98,968195 89,203277
= 5,20145772 9,7649185 = 0,53266 y = ax + b b = y ax = 1,0578103 (0,53266)( 4,22382) = 1,0578103 2,24986 = - 1,1920 Sehingga, diperoleh persamaan regresi y = 0,5326x - 1,1920. Untuk mencari hubungan kadar (x) dengan perbandingan luas puncak (y) digunakan pengujian koefisien kolerasi (r). r = xy ( x)( y) / n 2 2 2 ( x ( x )/ n) y ( y) 2 [ ( / n) ] r = r = r = r = 27,54145932 (21,1191)(5,28905152) / 5 2 2 [( 98,968195 (21,1191) / 5)( 8,5242014 (5,28905152) / 5) ] 27,54145932 22,3400016 [( 98,968195 89,2032769)( 8,5242014 5,5948132) ] 5,20145773 [( 9,76491824)( 2,92938820) ] 5,20145773 28,60524 r = 5,20145773 5,34838633 r = 0,97252
Lampiran 11. Perhitungan Konsentrasi Obat Pirazinamida Luas Puncak Pirazinamida (sampel) = 204900 Luas Puncak Nikotinamid (baku dalam) = 1782455 Maka, rasio luas puncak sampel dan baku dalam (Y) = 204900 = 0,11495381 1782455 Dari persamaan regresi y = 0,5326x - 1,1920, maka konsentrasi obat: 0,11495381 = 0,5326x - 1,1920 0,5326x = 0,11495381 + 1,1920 0,5326678x = 1,3069538 x = 1,3069538 0,5326678 x = 2,4537 mm = 0,0024537 M = 0,0024537 x 123,11 = 0,302075 g/l = 0,302075 mg/ml = 302,075 mcg/ml (ppm)
Lampiran 12. Perhitungan Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi Pirazinamida Persamaan garis regresi pirazinamida baku: y = ax + b y = 0,5326x - 1,1920 No. x (mm) y yi (y-yi) (y-yi) 2 1. 2,4368 0,092508237 0,1058396-0,0133313 0,000177724 2. 3,2491 0,334806734 0,5384706-0,2036638 0,041478943 3. 4,0614 1,081110914 0,9711016 0,1100093 0,012102046 4. 4,8736 1,680334042 1,4036793 0,2766547 0,076537823 5. 6,4982 2,100291594 2,2689413-0,1686497 0,028442721 Σ 0,158739257 SD = 2 (y yi) = n 2 0,158739257 5 2 = 0, 0529130 = 0,2300282 LOD = 3,3 xsd slope = 3,3 x 0,2300282 0,5326 = 1,4253 mm LOQ = 10 xsd slope = 10 x 0,2300282 0,5326 = 4,3189 mm
Lampiran 13. Data Pasien Nama Umur : Dedi : 23 tahun Jenis Kelamin : Laki-laki Berat Badan : 49 kg Telah memakan Obat TB tahap intensif selama ± 1 bulan.
Lampiran 14. Sertifikat Analisis Pirazinamida
Lampiran 15. Sertifikat Analisis Nikotinamid
Lampiran 16. Surat Persetujuan Komisi Etik
Lampiran 17. Pembuatan Plasma dari Sampel Darah Pasien TB Pasien TB Darah + heparin di dalam venoject Diambil darahnya sebanyak 5 ml melalui vena Dimasukkan ke dalam venoject yang telah terbasahi heparin Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran per menit selama 5 menit Dipisahkan supernatan dari endapan Lapisan atas (plasma) Lapisan bawah (endapan) Plasma
Lampiran 18. Pembuatan Plasma Kontrol Donatur (Dewasa dan Sehat) Darah + heparin di dalam venoject Diambil darahnya sebanyak 5 ml melalui vena Dimasukkan ke dalam venoject yang telah terbasahi heparin Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran per menit selama 5 menit Dipisahkan supernatan dari endapan Lapisan atas (plasma) Lapisan bawah (endapan) Plasma
Lampiran 19. Pembuatan Larutan Induk Baku Pirazinamida Pirazinamida Baku LIB I Pirazinamida konsentrasi 81,2281 mm Ditimbang sebanyak 10 mg Dimasukkan ke dalam vial yang telah dikalibrasi 1 ml Dilarutkan dengan fase gerak Dicukupkan sampai garis tanda
Lampiran 20. Pembuatan Larutan Induk Baku Pertama Nikotinamid Nikotinamid Ditimbang sebanyak 10 mg Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml Dilarutkan dengan fase gerak Dicukupkan sampai garis tanda LIB I Nikotinamid konsentrasi 8,1900 mm
Lampiran 21. Pembuatan Larutan Induk Baku Kedua Nikotinamid LIB I Nikotinamid konsentrasi 8,1900 mm Dipipet sebanyak 1,5 ml Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml Dicukupkan dengan fase gerak sampai garis tanda Larutan Nikotinamid dengan konsentrasi 1,2285 mm
Lampiran 22. Penyuntikan Plasma Kontrol Plasma Dipipet sebanyak 300 µl Dimasukkan ke dalam politube Ditambahkan 600 µl metanol, lalu divortex Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran per menit selama 5 menit Supernatan Endapan Dipisahkan menggunakan spuit Disaring menggunakan PTFE ø 0,2 µm Diinjeksikan ke dalam sistem KCKT sebanyak 20 µl Kromatogram plasma
Lampiran 23. Pembuatan Linearitas Kurva Kalibrasi Baku Pembanding Pirazinamida LIB I pirazinamida Larutan Pirazinamida dengan konsentrasi 2,4368 mm; 3,2491 mm; 4,0614 mm; 4,8736 mm; 6,4982 mm Dipipet sebanyak 30 μl; 40 μl; 50 μl; 60 μl; 80 μl Dimasukkan ke dalam vial yang telah dikalibrasi 1 ml Dicukupkan dengan fase gerak sampai garis tanda Dipipet sebanyak 10 µl Dimasukkan ke dalam vial yang telah dikalibrasi 2 ml Ditambah sebanyak 50 µl nikotinamid ke dalam masing-masing vial Ditambahkan plasma ke dalam vial sampai garis tanda Divortex lalu didiamkan selama 5 menit Dipipet sebanyak 300 µl Dimasukkan ke dalam politube Ditambahkan 600 µl metanol lalu divortex Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran per menit selama 5 menit Supernatan Endapan
Lanjutan: Supernatan Dipisahkan menggunakan spuit Disaring menggunakan PTFE ø 0,2 Diinjeksikan ke dalam sistem KCKT sebanyak 20 µl Kromatogram Diperoleh Rt dan luas puncak Dihitung persamaan regresi Hasil
Lampiran 24. Pemeriksaan Kadar Pirazinamida dalam Plasma Darah Pasien TB Plasma Pasien Ditambahkan 50 μl nikotinamid 1,2285 mm Divortex Didiamkan selama 5 menit Dipipet sebanyak 300 µl Dimasukkan ke dalam politube Ditambahkan 600 µl methanol, lalu divortex Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran per menit selama 5 menit Supernatan Endapan Kromatogram plasma + obat + nikotinamid Dipisahkan menggunakan spuit Disaring menggunakan PTFE ø 0,2 µm Diinjeksikan ke dalam sistem KCKT sebanyak 20 µl Diperoleh Rt dan luas puncak Dihitung konsentrasi yang didapat Hasil