EVALUASI DAN OPTIMALISASI PROGRAM PCR DALAM DETERMINASI KELAMIN IKAN BARBIR EMAS Puntius conchonius SECARA MOLEKULAR RADI IHLAS ALBANI DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa Skripsi yang berjudul : EVALUASI DAN OPTIMALISASI PROGRAM PCR DALAM DETERMINASI KELAMIN IKAN BARBIR EMAS Puntius conchonius SECARA MOLEKULAR adalah benar merupakan hasil karya yang belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Semua sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Skirpsi ini. Bogor, Mei 2009 RADI IHLAS ALBANI C14104070
RINGKASAN RADI IHLAS ALBANI. Evaluasi dan Optimalisasi Program PCR dalam Determinasi Kelamin Ikan Barbir Emas Puntius conchonius secara Molekular. Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan AGUS OMAN SUDRAJAT. Pembedaan antara ikan jantan/ betina hasil sex reversal dengan ikan jantan/ betina normal, yang biasanya dilakukan melalui metode pengujian progeny, diperlukan dalam upaya produksi populasi monoseks. Akan tetapi, pengujian progeny memiliki kendala yaitu membutuhkan banyak waktu, biaya, fasilitas, pekerjaan, dan pendataan pada pelaksanaannya. Penanda molekular kelamin juga dapat digunakan untuk keperluan tersebut, serta dapat mengatasi kendala metode pengujian progeny. Kirankumar et al. (2003) telah berhasil menerapkan metode analisa DNA menggunakan PCR dalam menentukan jenis kelamin secara molekular pada ikan barbir emas Puntius conchonius. Tujuan dilakukannya penelitian adalah untuk mengaplikasikan metode PCR dalam identifikasi kelamin ikan barbir emas yang terdapat di Indonesia. Penelitian pendahuluan yang dilakukan menunjukkan bahwa penerapan metode tersebut terhadap ikan barbir emas uji menghasilkan pola pita DNA yang berbeda dengan hasil yang diperoleh Kirankumar et al. (2003), serta belum dapat menunjukan perbedaan yang jelas antara kelamin jantan dengan betina. Optimalisasi terhadap prosedur PCR yang diterapkan diharapkan dapat memperjelas perbedaan pola pita DNA antara ikan barbir emas jantan dan betina. Optimalisasi tersebut dilakukan melalui pengaturan suhu annealing dan durasi waktu ekstensi. Tiga kelompok ikan barbir emas yang telah memiliki ciri kelamin sekunder digunakan dalam penelitian ini. Penelitian terdiri dari tahap evaluasi PCR (menguji program PCR yang digunakan Kirankumar et al. (2003) terhadap ikan barbir emas uji kelompok I), tahap optimalisasi PCR (dilakukan dengan mengubah suhu annealing dan durasi waktu ekstensi pada program PCR), verifikasi program PCR optimal (menguji program PCR optimal terhadap ikan barbir emas uji kelompok II), pencarian penanda DNA yang berkaitan kelamin melalui peningkatan konsentrasi gel agarosa, dan klarifikasi DNA yang diduga sebagai penanda kelamin tersebut terhadap ikan barbir emas uji kelompok III. Suhu annealing dan durasi waktu ekstensi yang digunakan dalam pengujian optimalisasi PCR ialah: (1) 60 C, 60 detik sebagai kontrol/ evaluasi, (2) 62 C, 30 detik sebagai pengujian 1, (3) 58 C, 30 detik sebagai pengujian 2, (4) 62 C, 90 detik sebagai pengujian 3, dan (5) 58 C, 90 detik sebagai pengujian 4. Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam pengujian ialah 0,7% dan 2%. Hasil yang diperoleh menunjukan bahwa program PCR dengan menggunakan suhu annealing 62 C, dan durasi waktu ekstensi 90 detik (pengujian 3) adalah program PCR terbaik untuk menghasilkan pola pita DNA yang menunjukan dengan jelas perbedaan genetik kelamin ikan barbir emas. Berdasarkan pola pita yang dihasilkan melalui penggunaan gel agarosa 2% dapat diyakini bahwa kemungkinan penanda molekular khusus kelamin jantan (terkait kromosom Y) pada ikan barbir emas yang diujikan adalah pita DNA dengan panjang sekitar 270 bp.
EVALUASI DAN OPTIMALISASI PROGRAM PCR DALAM DETERMINASI KELAMIN IKAN BARBIR EMAS Puntius conchonius SECARA MOLEKULAR RADI IHLAS ALBANI SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
Judul Skripsi : Evaluasi dan Optimalisasi Program PCR dalam Determinasi Kelamin Ikan Barbir Emas Puntius conchonius secara Molekular Nama Mahasiswa Nomor Pokok : Radi Ihlas Albani : C14104070 Disetujui, Pembimbing I Pembimbing II Dr. Alimuddin NIP. 132 133 953 Dr. Agus Oman Sudrajat NIP. 131 953 476 Diketahui, Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Prof. Dr. Ir. Indra Jaya, M.Sc. NIP. 131 578 799 Tanggal Lulus :
KATA PENGANTAR Segala Puja Syukur hanyalah milik Sang Penguasa Semesta Alam. Melalui karunia dari Sang Maha Penentu Kehendak, karya ilmiah dengan judul Evaluasi dan Optimalisasi Program PCR dalam Determinasi Kelamin Ikan Barbir Emas Puntius conchonius secara Molekular ini telah berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih adalah mengenai bioteknologi molekular dan seksualitas pada ikan, hal ini didasari pada manfaat luar biasa yang dapat diperoleh melalui informasi dan penggunaan teknologi tersebut, namun masih terbatasnya pengetahuan mengenai hal ini di Indonesia (khususnya pada bidang perikanan). Beragam kata tak mudah diutarakan, hanyalah ungkapan kebahagiaan dan terimakasih yang tulus kepada: 1. Dr. Alimuddin, selaku Pembimbing I dan Pembimbing Akademik 2. Dr. Agus Oman Sudrajat, selaku Pembimbing II 3. Dr. Munti Yuhana, selaku Dosen Penguji pada pelaksanaan Ujian Akhir 4. Anna Octavera SPi., yang telah banyak membantu dalam penelitian dan penyusunan serta penulisan skripsi ini 5. Bapak Drs. Rahmat Setiadi M.Sc. dan Ibu Herawati, serta keluarga atas dukungan yang tiada ternilai 6. Asyur Zaldi, Ahmad Rifai, dan Martinus Johan Mosi, untuk masukan mengenai informasi dan material penunjang penelitian 7. Herma Amalia SP., Lazuardi Y.A. SPi., Mauluddin SPi., Arief E.P. SPi., Dwi H.Y. SPi., teman-teman Lab. Genetik dan BDP angkatan 41 (2004), atas dukungan dan persahabatan selama ini, serta semua pihak yang telah memberikan dukungan baik secara langsung maupun tidak langsung Semoga semua yang telah disusun dapat dimanfaatkan oleh banyak pihak dan berguna bagi kesejahteraan masyarakat. Karena sesungguhnya setelah kesulitan itu ada kemudahan, sesungguhnya setelah kesulitan itu ada kemudahan. Bogor, Mei 2009 Radi Ihlas Albani
DAFTAR RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tanggal 10 September 1986, dari ayah Rahmat Setiadi dan ibu Herawati. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Pendidikan formal yang telah dilalui penulis adalah SMUN 3 Bandung dan lulus tahun 2004. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru Nasional dengan pilihan pertama Program Studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktek kerja lapang di Balai Budidaya Air Tawar Jambi, Jambi dan di Anggung Fish Farm, Jambi dengan komoditas ikan patin Pasupati (Pangasionodon sp) dan patin siam (Pangasionodon hypohthalmus). Penulis juga pernah menjadi asisten mata kuliah Fisiologi Reproduksi Hewan Air semester ganjil 2007/2008, Dasar-dasar Genetika Ikan semester genap 2007/2008, Industri Pembenihan Organisme Akuatik semester ganjil 2008/2009, dan Manajemen Budidaya Air Tawar semester ganjil 2008/2009. Selain itu penulis juga aktif menjadi pengurus Himpunan Mahasiswa Akuakultur (HIMAKUA) periode 2006/2007 sebagai Ketua Departemen Bidang Kewirausahaan, dan juga berpartisipasi dalam beberapa kegiatan seminar baik tingkat kampus maupun nasional sebagai peserta, pembicara, maupun panitia. Prestasi akademik yang pernah diperoleh diantaranya sebagai Penyaji Tingkat Nasional untuk Program Kreativitas Mahasiswa Penelitian (PKMP) dengan judul Teknik Anestesi Ikan Menggunakan Arus Listrik pada Pekan Ilmiah Nasional (PIMNAS) XXI Semarang 2008. Tugas akhir dalam pendidikan tinggi diselesaikan dengan menulis Skripsi yang berjudul Evaluasi dan Optimalisasi Program PCR dalam Determinasi Kelamin Ikan Barbir Emas Puntius conchonius secara Molekular.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR... viii I. PENDAHULUAN... 1 1.1 Latar Belakang... 1 1.2 Tujuan... 2 II. TINJAUAN PUSTAKA... 3 2.1 Ikan Barbir Emas Punctius conchonius... 3 2.2 Determinasi dan Diferensiasi Kelamin pada Ikan... 4 2.3 Penanda (marker) Molekular Kelamin pada Ikan... 4 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR)... 7 2.5 Optimalisasi Program PCR... 11 2.6 Analisis Produk PCR (Elektroforesis)... 14 III. METODE... 16 3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan... 16 3.2 Prosedur Penelitian... 16 3.2.1 Skema Penelitian... 16 3.2.2 Pemilihan Ikan Uji... 17 3.2.3 Ekstraksi DNA... 17 3.2.4 Proses PCR (Polymerase Chain Reaction)... 18 3.2.5 Elektroforesis... 19 3.2.6 Penentuan Program PCR Optimal... 20 3.2.7 Verifikasi Program PCR Optimal dan Pencarian Penanda Kelamin... 21 3.2.8 Klarifikasi Penanda (marker) Kelamin... 21 3.2.9 Analisis Data... 22 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... 23 4.1 Hasil... 23 4.1.1 Evaluasi Program PCR... 23 4.1.2 Optimalisasi Program PCR... 24 4.1.3 Vefikasi Program PCR Optimal... 27 4.1.4 Fragmen DNA Penanda Kelamin... 28 4.1.5 Klarifikasi Penanda (marker) Kelamin... 29 4.2 Pembahasan... 30 V. KESIMPULAN DAN SARAN... 40 5.1 Kesimpulan... 40 5.2 Saran... 40 DAFTAR PUSTAKA... 41 vii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Ikan Barbir Emas... 3 2. Polymerase Chain Reaction: Siklus Pertama... 8 3. Polymerase Chain Reaction: Siklus Kedua... 10 4. Skema Pelaksanaan Penelitian... 16 5. Kelompok Ikan Uji Barbir Emas Jantan... 17 6. Kelompok Ikan Uji Barbir Emas Betina... 17 7. Pola Pita DNA yang Diperoleh Kirankumar et al. (2003)... 23 8. Pola Pita DNA Hasil Evaluasi Program PCR... 24 9. Pola Pita DNA Hasil Program PCR Optimal (pengujian 3)... 25 10. Pola Pita DNA Hasil Program PCR Pengujian 1... 25 11. Pola Pita DNA Hasil Program PCR Pengujian 2... 26 12. Pola Pita DNA Hasil Program PCR Pengujian 4... 26 13. Hasil Verifikasi Program PCR Optimal pada Kelompok Ikan Uji II... 27 14. Hasil Verifikasi Program PCR Optimal (ikan uji I dan II) pada Gel Agarosa 2 %... 28 15. Penanda Molekular Khusus Jantan pada Ikan uji kelompok I dan II... 29 16. Hasil Klarifikasi pada Betina Kelompok Ikan Uji III... 29 17. Hasil Klarifikasi pada Jantan Kelompok Ikan Uji III... 30 18. Beberapa Kemungkinan Penempelan Primer pada DNA Cetakan yang dapat Mengakibatkan Amplifikasi (Dale & Schantz, 2002)... 32 19. Ilustrasi antara Primer Spesifik (A) dengan Primer Tidak Spesifik (B)... 35 viii