56 LAMPIRAN Lampiran A: Alur Kerja Isolasi Bakteri Penghasil Biosurfaktan Air laut Dimasukkan ke dalam botol Winkler steril Diisolasi bakteri dengan pengenceran 10 0, 10-1, 10-3 Dibiakkan dalam cawan petri steril yang berisi media Bushnell Hass Agar (BHA) yang mengandung % naftalen dengan metode cawan sebar Diinkubasi selama 15-0 hari pada suhu 33ºC Isolat tumbuh Dimurnikan pada media TSA (Tripton Soya Agar) Diinkubasi selama 4-48 jam pada suhu 33ºC Diamati ciri morfologi koloni Biakan murni
44 57 Lampiran B: Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 10 8 sel/ml Untuk Pengujian Isolat bakteri Diambil 1- ose Dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi air laut steril Dihomogenkan dengan vorteks Dibandingkan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standard yang setara dengan 10 8 CFU/ml Suspensi isolat bakteri
Lampiran C: Alur Kerja Pengujian Kemampuan Bakteri dalam Mendegradasi Naftalen 58 45 Isolat bakteri Suspensi bakteri Dibuat pengenceran 10 8 sel/ml yang disamakan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standarad Sebanyak ml dimasukkan ke dalam botol yang berisi 5 ml media Bushnell Hass Broth yang mengandung % naftalen Diinkubasi pada suhu 30ºC dengan digoyang di atas shaker pada kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm selama 15 hari Dilakukan estimasi kepadatan sel bakteri pada hari ke-5, 10, 15 dengan metode SPC (Standard Plate Count) Kultur Cair Bakteri Diatur ph media hingga pada 1,0 dengan menggunakan NaOH 0,1N Disaring dengan menggunakan kertas saring Filtrat Dimasukkan ke dalam corong pisah 50 ml Diekstraksi dengan n-hexane 10 ml selama 15 menit dengan 3x ulangan Didiamkan hingga terbentuk lapisan Lapisan Atas Lapisan Bawah Dimasukkan ke dalam sample cup sebanyak 5 ml Diinjeksikan sebanyak 1 µl ke dalam Chromatografi Gas Dianalisis jumlah naftalen yang tersisa pada media dengan cara mensubstitusikan nilai luas area ke persamaan kurva standard Chromatografi Gas Hasil
59 46 Lampiran D: Pembuatan Kurva Standar Naftalen Untuk Kromatografi Gas 0,1 gr Naftalen Dilarutkan dengan N-heksan Dibuat dengan konsentrasi ppm, 5 ppm,100 ppm, 1000 ppm, dan 100 ppm Dihomogenkan dengan membolak balik labu takar sehingga naftalen larut Diinjeksikan masing- masing konsentrasi sebanyak 1 µl ke dalam Chromatografi Gas Hwlet Packard 6890 Luas Area Ditentukan persamaan garis regresi kurva standar naftalen dengan memplot luas area dan konsentrasi naftalen dengan metode Least Square Kurva Standar Naftalen
60 47 Lampiran E: Alur Kerja Estimasi Kepadatan Sel Isolat Bakteri dengan Metode SPC Sampel hasil perlakuan Diencerkan sampai konsentrasi 10-7 Diinokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi media Plate Count Agar Disebar dengan menggunakan hockeystik Diinkubasi selama 4-48 jam pada suhu 3ºC Dihitung kepadatan sel isolat Kepadatan sel isolat
61 48 Lampiran F: Screening Aktivitas Biosurfaktan Isolat Bakteri Dibuat pengenceran 10 8 sel/ml yang disamakan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standard Suspensi bakteri Sebanyak ml dimasukkan ke dalam botol yang berisi 30 ml media Bushnell Hass Broth yang mengandung % dekstrose Diinkubasi pada suhu 30ºC dengan digoyang di atas shaker pada kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm selama 15 hari Dilakukan estimasi kepadatan sel bakteri pada hari ke- 15 dengan metode SPC (Standard Plate Count) Kultur Cair Bakteri Disaring dengan menggunakan kertas saring Supernatan Residu Dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 ml Ditambahkan ml aquadest Ditambahkan 4 ml n-heksan Divorteks selama 10 detik Didiamkan selama 1 menit Diamati terbentuknya kekeruhan dari adanya emulsi yang stabil Diukur ketebalan emulsi yang terbentuk dengan menggunakan jangka sorong Hasil
6 49 Lampiran G: Alur Kerja Pembuatan Kurva Standar Rhamnosa Rhamnosa Dilarutkan dengan Sodium Bikarbonat (NaHCO 3 ) 0,05 M dengan konsentrasi 0 (blanko), 10 ppm, 50 ppm, 80 ppm, dan 400 ppm Dimasukkan sebanyak ml ke dalam tabung reaksi Dihomogenkan dengan vorteks Ditambahkan 3,6 ml larutan orsinol Dididihkan Didinginkan pada suhu ruang selama 15 menit Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 41 nm Absorbansi Ditentukan persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa dengan memplot absorbansi dan konsentrasi rhamnosa dengan metode Least Square Kurva Standar Rhamnosa
63 50 Lampiran H: Alur Kerja Produksi Biosurfaktan dan Kuantifikasi dengan Metode Orsinol yang Dimodifikasi Isolat bakteri Suspensi bakteri Dibuat pengenceran 10 8 sel/ml yang disamakan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standard Sebanyak ml dimasukkan ke dalam botol yang berisi 5 ml media Bushnell Hass Broth yang mengandung % naftalen Diinkubasi pada suhu 30ºC dengan digoyang di atas shaker pada kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm selama 15 hari Kultur Cair Bakteri Disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit Supernatan Pellet Dimasukkan sebanyak 4 ml ke dalam tabung reaksi Masing-masing tabung diekstrak dengan ml diethylether selama 5 menit Diulangi sampai 3 kali Diambil lapisan ether, dikeringkan, dilarutkan kembali dalam ml 0,05 M sodium bikarbonat Dihomogenkan dengan vorteks Ditambahkan 3,6 ml larutan orsinol Dididihkan selama 0 menit Didinginkan pada suhu ruang selama 15 menit Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 41 nm Hasil
64 51 Lampiran I: Komposisi Media Bushnell-Hass, Larutan Standar Mac Farland, dan Larutan Orsinol a. Komposisi Media Bushnell-Hass Agar per Liter (Atlas, 1946) 1. KH PO 4 = 1,0 gr. K HPO 4 = 1,0 gr 3. NH 4 NO 3 = 1,0 gr 4. MgSO 4. 7H O = 0, gr 5. FeCl 3 = 0,05 gr 6. CaCl. H O = 0,0 gr 7. Agar = 0 gr Kemudian seluruh komposisi ini dilarutkan dengan air laut dan disterilkan dengan autoklaf. b. Komposisi Larutan Mac Farland (Lorian, 1980) Sebanyak 0,5 ml BaCl 0,048 M ditambahkan ke dalam 99,5 ml H SO 4 0,35 N. Kemudian divorteks sampai homogen. c. Komposisi Larutan Orsinol (Chandrasekaran & Be Miller, 1980; Koch et al., 1991) sebanyak 100 mg orsinol dilarutkan dalam 100 ml H SO 4 53%, kemudian didiamkan selama 1 jam hingga warna kuning sempurna.
65 5 Lampiran J : Penentuan Kurva Standar Naftalen dan Kurva Standar Rhamnosa a. Penentuan Kurva Standar Naftalen Std. No. Konsentrasi Naftalen (ppm) Luas Area 1 3,331 5 8,358 3 10000 11353,593 4 1000 13593,468 Kurva Standar Naftalen Untuk menentukan persamaan garis regresi kurva standar naftalen digunakan metode Least Square, masukkan nilai konsentrasi naftalen sebagai nilai X dan nilai luas area sebagai Y. Tabel penentuan persamaan garis regresi kurva standar naftalen metode Least Square No X Y X Y XY 1 3,331 4 11,095561 6,66 5 8,358 5 69,856164 41,79 3 10000 11353,593 10 8 18904074 113535930 4 1000 13593,468 144 x 10 6 1847837,3 16311616 n=4 X 007 Y 4958,75 X = Y = XY = X = 5501,75 Y = 639,6875 4400009 31368657,3 76657594,5 berikut : R = Untuk mencari nilai R (Regresi) masukkan nilai yang diperoleh ke rumus X ( ( XY X) n X)( n Y Y) ( Y) n R= 1
66 53 Dan untuk mencari persamaan garis dari data dan kurva di atas, masukkan nilai yang diperoleh ke rumus berikut: Y = b = a bx Y = a bx n( XY) ( X)( n( X ) ( X) Y) a = Y - b X b = 1,1336 = 3,1159 Dari nilai a dan b yang diperoleh dari data di atas, maka persamaan kurva standar naftalen adalah: Y = 1,1336X + 3,1159. Dimana Y = Luas Area X = Konsentrasi naftalen (ppm) Tabel Hasil Analisa Naftalen pada Sampel Sampel Luas Area Konsentrasi Naftalen (ppm) Sp 4 44,916 36,87 Sp 7 33,11 6,55 Sp 10 809,47 475,61 Sp 13 1317,643 10863,0
67 54 Kurva Analisa Naftalen dengan Kromatografi Gas Konsentrasi Naftalen ppm Konsentrasi Naftalen 5 ppm
68 55 Konsentasi Naftalen 10000 ppm Konsentrasi Naftalen 1000 ppm
69 56 Kurva Analisa Sp 4 Kurva Analisa Sp 7
70 57 Kurva Analisa Sp 10 Kurva Analisa Sp 13
71 58 b. Penentuan Kurva Standar Rhamnosa No Kosentrasi Rhamnosa (ppm) Absorbansi 1 10 0,15 50 0,351 3 80 0,483 4 400,137 Untuk menentukan persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa digunakan metode Least Square, masukkan nilai konsentrasi rhamnosa sebagai nilai X dan nilai absorbansi sebagai nilai Y. Tabel Penentuan Persamaan Regresi Kurva Standar Rhamnosa Metode Least Square No X Y X Y XY 10 0,15 100 0,03104 1,5 50 0,351 500 0,1301 17,55 80 0,483 6400 0,3389 38,64 400,137 160000 4,566769 854,80 n=4 X 540 Y 3, 13 X 169000 Y 4, 9463 XY 91, 51 X = 135 Y = 0,780 berikut : R = Untuk mencari nilai R (Regresi) masukkan nilai yang diperoleh ke rumus X ( ( XY X) n X)( n Y Y) ( Y) n R= 0,9998
7 59 Dan untuk mencari persamaan garis dari data dan kurva di atas, masukkan nilai yang diperoleh ke rumus berikut: Y = b = a bx Y = a bx n( XY) ( X)( n( X ) ( X) Y) a = Y - bx b = 0,0051 = 0,0911 Dari nilai a dan b yang diperoleh dari data di atas, maka persamaan kurva standar naftalen adalah: Y = 0,0911 + 0,0051X. Dimana Y = Absorbansi X = Konsentrasi biosurfaktan (ppm) Tabel Hasil Analisa Absorbansi dan Konsentrasi Biosurfaktan pada Sampel Sampel Absorbansi Konsentrasi Biosurfaktan (ppm) Sp 01 0,187 18,763 Sp 0 0,17 15,806 Sp 03 0,177 16,786 Sp 04 0,474 75,180 Sp 05 0,195 0,455 Sp 06 0,33 45,531 Sp 07 0,405 61,547 Sp 08 0,86 38,98 Sp 09 0,19 5,14 Sp 10 0,05,3 Sp 11 0,186 18,564 Sp 1 0,180 17,467 Sp 13 0,166 14,786
73 60 Lampiran K : Data dan Analisis RAL Screening Aktivitas Biosurfaktan Isolat Bakteri Laut Belawan, Sumatera Utara a. Tabel Data Screening Aktivitas Biosurfaktan Isolat Bakteri Laut Belawan, Sumatera Utara Isolat Ketebalan Emulsi (mm) Rata-Rata Nilai Hasil Bakteri U 1 U U Total 3 (mm) Konversi ke ml Duncan Sp 01 10,91 9,8 9,6 30,35 10,1 1,56 ff Sp 0 3,6 3,34 4,13 11,09 3,70 0,57 kk** Sp 03 4,54 5,03 5,95 15,5 5,17 0,79 IjIJ Sp 04 18,1 0,7 17,41 56,5 18,75,89 aa* Sp 05 6,10 4,5 5,03 15,65 5, 0,80 jj Sp 06 15,7 1,56 14,56 4,84 14,8,19 cc* Sp 07 15,04 15,7 17,05 47,81 5,94,45 bb* Sp 08 1,9 1,03 13,94 38,89 1,96 1,99 ee Sp 09 13,3 14,01 13,81 41,14 13,71,11 dd Sp 10 6,7 7,34 7,05 1,11 7,04 1,08 gg Sp 11 6,05 6,86 5,86 18,77 6,6 0,96 hh Sp 1,63 3,34 3,4 9,39 3,13 0,48 ll** Sp 13,63,34 Keterangan : U = Ulangan 3,4 8,39,80 0,43 mm** ` * = Tiga nilai aktivitas tertinggi ** = Tiga nilai aktivitas terendah b. Tabel Analisi RAL (Rancangan Acak Lengkap) Screening Aktivitas Biosurfaktan Isolat Bakteri Laut Belawan SK DB JK KT Fh Ft 5% 1% Perlakuan 1 1053,91 87,8 109,77**,96,15 Galat 6 0,7 0,80 - Total 38 1074,63 - - ** = Berbeda sangat nyata SK = Sumber Keragaman DB = Derajat Bebas JK = Jumlah Kuadrat KT = Kuadrat Tengah Fh = Faktor Hitung
7461 Lampiran L: Dokumentasi Penelitian a. Uji Biokimia Sederhana Isolat Bakteri Laut Belawan Uji Hidrogen Sulfida (TSIA) Uji Sitrat b. Uji Potensi Isolat Bakteri Laut Belawan pada Media Bushnell-Hass Broth c. Ekstraksi Media Bushnell-Hass Broth untuk Analisa Naftalen Sisa Degradasi
75 6 d. Emulsifikasi pada Screening Aktivitas Biosurfaktan Keterangan : a. Lapisan N-heksan b. Lapisan Emulsi c. Lapisan Air Alat-Alat Penelitian Kromatografi Gas Hwlet Packard 6890 Spektrofotometer UV-Visibel Shimadzu 140