BAB III METODE PENELITIAN. A. Waktu dan Tempat Penelitian. MIPA dan Laboratorium Universitas Setia Budi Surakarta. B.

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan selama 4 bulan, mulai dari bulan September sampai Desember 2013, bertempat di Laboratorium Jurusan Biologi Fakultas MIPA dan Laboratorium Universitas Setia Budi Surakarta. B. Bahan dan Alat 1. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kemangi (Ocimum basilicum Linn.) yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu, 70% alkohol (C n H 2n+1 OH), 70% etanol (C 2 H 5 OH), serbuk carboxyl methyl cellulose (CMC), dimethyl sulfoxide (DMSO), tetrasiklin, serbuk NaCl, aquades, nutrien agar, nutrien cair, kertas saring Whatman, kertas HVS, kapas, benang, alumunium foil, kain kasa, kertas label, cotton bud, biakan Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 yang diperoleh dari Pusat Studi Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. 2. Alat Peralatan yang digunakan antara lain blender, baskom plastik, kain hitam, batang pengaduk kaca, batang L (batang kaca penyebar), botol kaca, corong gelas, eksikator, timbangan analitik, 1 set rotary evaporator, refrigerator, vortex, 1 set alat-alat gelas laboratorium, rak commit tabung to reaksi, user cawan petri, bunsen burner, 19

2 20 hotplate, magnetic stirrer, spatula, gunting, mikropipet, tip, inkubator, shaker TS- 330A, laminar air flow (LAF), seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis, jangka sorong, botol flakon, autoklaf, jarum ose, korek api, kuvet, pinset, dan lup. C. Rancangan Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL). Perlakuan dilakukan dengan variasi konsentrasi ekstrak daun kemangi (Ocimum basilicum Linn.) yang berbeda dengan ketebalan media nutrien agar yang sama yaitu ± 5 mm. Konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi yang digunakan terdiri dari tujuh taraf, yaitu 0 mg/ml, 550 mg/ml, 700 mg/ml, 750 mg/ml, 800 mg/ml, 850 mg/ml, dan 900 mg/ml (Husna, 2007). Proses pengulangan dilakukan sebanyak tiga ulangan. Model matematis rancangan percobaan tersebut adalah sebagai berikut : Tabel 1. Kombinasi perlakuan ekstrak etanol daun kemangi (Ocimum basilicum) Indikator K0 K1 K2 K3 K4 K5 K6 B1 B1K0 B1K1 B1K2 B1K3 B1K4 B1K5 B1K6 B2 B2K0 B2K1 B2K2 B2K3 B2K4 B2K5 B2K6 Keterangan : B1 : Bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 B2 : Bakteri Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 K0 : Konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi 0 mg/ml K1 : Konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi 550 mg/ml K2 : Konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi 700 mg/ml K3 : Konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi 750 mg/ml K4 : Konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi 800 mg/ml K5 : Konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi 850 mg/ml K6 : Konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi 900 mg/ml

3 21 D. Cara Kerja 1. Ekstraksi daun kemangi (Ocimum basilicum Linn.) menggunakan metode yang dilakukan oleh Dewi (2010), Kristiyana dkk. (2010), dan Mpila dkk. (2012) a. Sebanyak 3,5 kilogram daun kemangi yang telah dicuci bersih dengan air dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari dengan ditutupi kain hitam selama beberapa hari sampai kering. b. Selanjutnya daun kemangi yang kering dibuat serbuk simplisia dengan cara dihaluskan dengan blender. c. Serbuk simplisia daun kemangi sebanyak 500 gram diekstrak dengan menggunakan 2 liter etanol 70% dalam maserator selama ± 24 jam. d. Hasil perendaman serbuk simplisia daun kemangi tersebut disaring dengan kertas penyaring kemudian hasil saringan dimasukkan dalam botol kaca. e. Residu kembali dimaserasi sampai 3 kali dengan cara yang sama dan dilakukan pengadukan 1 kali dengan batang pengaduk kaca. f. Filtrat yang dihasilkan, ditampung menjadi satu dan diuapkan untuk memisahkan pelarutnya dengan menggunakan alat rotary evaporator pada suhu 40 C untuk menjaga agar senyawa metabolit sekunder tidak rusak oleh suhu yang terlalu tinggi sampai pelarut habis menguap sehingga didapatkan ekstrak kental daun kemangi. g. Ekstrak ditimbang dan disimpan dalam wadah tertutup sebelum digunakan untuk pengujian.

4 22 2. Pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi (Ocimum basilicum Linn.) menurut metode Husna (2007). a. Ekstrak kental daun kemangi dibuat 6 seri konsentrasi (550 mg/ml, 700 mg/ml, 750 mg/ml, 800 mg/ml, 850 mg/ml, dan 900 mg/ml) dengan menggunakan larutan DMSO. Konsentrasi yang digunakan berasal dari penelitian Husna (2007) tentang pengaruh pemberian ekstrak tumbuhan meniran (Phyllanthus niruni L.) terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa dalam ukuran persentase kemudian diubah menjadi mg/ml. b. Setiap seri konsentrasi dibuat dengan menambahkan larutan DMSO ke dalam beberapa gram ekstrak kental daun kemangi sampai volume 1 ml. c. Jumlah ekstrak yang digunakan untuk pengujian antibakteri menggunakan metode difusi cakram sama dengan konsentrasi yang dibuat, sedangkan pengujian kadar hambat minimum (KHM) atau minimum inhibitory concentration (MIC) dapat dilihat dalam Tabel 2. Tabel 2. Jumlah ekstrak yang digunakan untuk pengujian kadar hambat minimum (KHM) atau minimum inhibitory concentration (MIC) dalam 5,4 ml media cair Konsentrasi (mg/ml) Ekstrak etanol daun kemangi (mg) Keterangan : Volume media nutrient cair : 5 ml Volume kultur bakteri : 200 µl Volume ekstrak etanol daun kemangi : 200 µl

5 23 3. Pembuatan larutan CMC dengan konsentrasi 0,1% (Dewi, 2010) yang digunakan sebagai pelarut tetrasiklin a. Aquades steril sebanyak 100 ml dipanaskan terlebih dahulu dengan menggunakan hotplate. b. Serbuk CMC sebanyak 0,1 gram dimasukkan ke dalam aquades tersebut sambil diaduk hingga tercampur merata. 4. Uji antibakteri a. Regenerasi bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 berdasarkan metode Wuryanti dan Murnah (2009) dan Febriyati (2010) 1) Membuat biakan agar miring yaitu menggoreskan biakan masing-masing dari stok bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 dengan menggunakan jarum ose steril ke media nutrien agar miring yang masih baru. 2) Media biakan agar miring diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam dan disimpan pada suhu 4-5 C. b. Pembuatan garam fisiologis dengan konsentrasi 0,85% 1) Serbuk NaCl ditimbang sebanyak 0,85 gram kemudian dilarutkan dalam 100 ml aquades. 2) Magnetic stirrer dimasukkan ke dalamcampuran tersebut kemudian dipanaskan sampai mendidih. 3) Setelah larutan garam fisiologis mendidih, dimasukkan ke dalam 36 tabung reaksi dengan volume masing-masing 9 ml.

6 24 4) Masing-masing tabung reaksi disumbat dengan kapas dan disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121 C selama 15 menit. 5) Pembuatan garam fisiologis dengan konsentrasi 0,85% dilakukan sebanyak 2 kali yang digunakan untuk bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC c. Pembuatan kurva standar Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 berdasarkan metode Khodijah (2006), Kurniawati dkk. (2012), Putri (2012), dan Ariyanti dkk. (2013) 1) Sebanyak satu ose biakan dari bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 ditumbuhkan dalam 10 ml media nutrien cair yang berbeda kemudian digoyangkan di atas shaker pada kecepatan 120 rpm dalam suhu 37 C selama 24 jam sampai media menjadi keruh. 2) Sebanyak 5 ml biakan bakteri tersebut dipindahkan ke dalam 5 ml media nutrien cair yang baru. 3) Pengenceran berseri masing-masing dilakukan sebanyak 6 tabung yang berisi media nutrien cair sehingga diperoleh perbandingan 1 : 1/2 : 1/4 : 1/8 : 1/16 : 1/32. 4) Masing-masing tabung reaksi yang berisi media dan biakan bakteri tersebut diamati dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 580 nm. Panjang gelombang tersebut digunakan karena dapat menunjukkan nilai absorbansi terhadap seri pengenceran kultur bakteri dengan ketelitiaan tertinggi dibanding panjang gelombang lainnya.

7 25 5) Setelah diketahui nilai optical density (OD), masing-masing dari biakan bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan garam fisiologis 0,85% dalam tabung reaksi yang berbeda dan dihomogenkan dengan vortex (pengenceran 10-1 ). 6) Masing-masing biakan bakteri tersebut diambil 1 ml dari pengenceran 10-1 dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan garam fisiologis 0,85% dalam tabung reaksi lain (pengenceran 10-2 ). 7) Seri pengenceran dibuat sampai pengenceran ) Masing-masing pengenceran diambil 25 µl kultur bakteri dan diteteskan ke permukaan media nutrien cair dalam cawan petri yang berbeda dan diratakan dengan batang L (batang kaca penyebar) kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. 9) Setiap pengenceran masing-masing bakteri diambil 3 kali untuk ditumbuhkan pada cawan petri yang berbeda (3 ulangan) lalu dihitung jumlah sel bakterinya. 10) Jumlah bakteri dihitung jika jumlah koloni yang tumbuh antara Jika ada kontaminasi yang menutupi lebih dari setengah cawan petri, koloni tersebut tidak dapat dihitung. Jika yang memenuhi syarat ada dua tingkat pengenceran maka apabila perbandingan lebih dari atau sama dengan 2:1, dipilih pengenceran yang lebih dulu dan jika perbandingan kurang dari 2:1 maka hasilnya dirata-rata.

8 26 11) Jumlah sel bakteri per ml dihitung dengan cara membagi jumlah koloni dengan faktor pengenceran dan volume yang disebar. 12) Kurva standar dapat diperoleh dengan nilai regresi y = bx + a. Variabel y merupakan jumlah sel bakteri, sedangkan variabel x merupakan besarnya nilai absorbansi. d. Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 dengan media nutrien cair menurut metode yang digunakan oleh Mukhlisoh (2010) dan Putri (2012) 1) Satu ose dari biakan bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 dipindahkan ke dalam 10 ml media nutrien cair yang berbeda. 2) Media yang berisi biakan tersebut kemudian digoyangkan di atas shaker dengan kecepatan 120 rpm dalam suhu 37 C selama 24 jam. 3) Setelah inkubasi selama 24 jam, 5 ml biakan bakteri tersebut masingmasing dipindahkan dalam 95 ml media nutrien cair yang berbeda. 4) Biakan bakteri tersebut diukur nilai absorbansi setiap 2 jam untuk mengetahui fase logaritmik biakan bakteri selama 24 jam pada panjang gelombang 580 nm menggunakan spektrometer UV-Vis sehingga diperoleh nilai optical density (OD). 5) Media yang steril digunakan sebagai blangko. 6) Kurva pertumbuhan ditentukan dengan plot antara waktu dan log jumlah bakteri per ml.

9 27 e. Pengujian antibakteri menurut Putri dkk. (2008), Nuria dkk. (2009), Suhardi (2009), dan Ariyanti dkk. (2013) 1) Ekstrak etanol daun kemangi (Ocimum basilicum) dengan 6 konsentrasi yaitu 550 mg/ml, 700 mg/ml, 750 mg/ml, 800 mg/ml, 850 mg/ml, dan 900 mg/ml diuji terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 secara in vitro. Kontrol positif yang digunakan adalah tetrasiklin 50 µg/ml, sedangkan kontrol negatif yang digunakan adalah larutan DMSO, etanol 70%, dan CMC 0,1%. 2) Biakan bakteri yang akan diuji ditanam satu ose pada 10 ml media nutrien cair, kemudian dishaker pada suhu 37 C selama 10 jam. 3) Biakan bakteri tersebut dioleskan ke permukaan media nutrien agar yang telah memadat pada cawan petri dengan ketebalan ± 5 mm menggunakan cotton bud steril dan didiamkan beberapa saat. 4) Bulatan cakram kertas dengan diameter 6 mm direndam ke dalam ekstrak etanol daun kemangi 550 mg/ml, 700 mg/ml, 750 mg/ml, 800 mg/ml, 850 mg/ml, 900 mg/ml, tetrasiklin 50 µg/ml sebagai kontrol positif, larutan DMSO, etanol 70%, dan CMC 0,1% sebagai kontrol negatif masing-masing selama 5 menit. 5) Cakram kertas tersebut kemudian diletakkan di atas media nutrien agar yang telah diinokulasikan bakteri uji, selanjutnya didiamkan terlebih dahulu pada refrigerator selama ± 2 jam untuk memberikan kesempatan ekstrak dapat meresap ke dalam media nutrien agar dengan baik, lalu diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam.

10 28 6) Diameter zona bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram diukur kemudian dikurangi dengan diameter kertas cakram. 7) Perlakuan yang sama juga dilakukan untuk bakteri Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 dan pengujian bakteri ini dilakukan sebanyak 3 ulangan. f. Metode penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM) atau minimum inhibitory concentration (MIC) berdasarkan metode yang digunakan oleh Sutikno (2010) 1) Sebanyak satu ose biakan dari bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 ditumbuhkan dalam 10 ml media nutrien cair yang berbeda kemudian digoyangkan di atas shaker pada kecepatan 120 rpm dalam suhu 37 C selama 10 jam sampai media menjadi keruh. 2) Larutan stok bakteri dibuat dengan memasukkan 200 µl kultur bakteri ke dalam 4,8 ml media nutrien cair kemudian 200 µl kultur bakteri dari larutan stok tersebut ditambahkan ke dalam 12 tabung reaksi yang berisi 5 ml media nutrien cair. 3) Enam tabung reaksi tersebut ditambahkan 200 µl ekstrak etanol daun kemangi dengan 6 seri konsentrasi (550 mg/ml, 700 mg/ml, 750 mg/ml, 800 mg/ml, 850 mg/ml, dan 900 mg/ml) dapat dilihat pada Tabel 2, kemudian diukur optical density (OD) bakteri dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis (λ 580 nm) sebagai pembanding sebelum perlakuan inkubasi.

11 29 4) Penambahan 200 µl ekstrak etanol daun kemangi dengan 6 seri konsentrasi juga dilakukan untuk enam tabung reaksi yang lain kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C dalam inkubator. 5) Hasil inkubasi diukur optical density (OD) bakteri dengan menggunakan spektrofotometer (λ 580 nm) sebagai pembanding sesudah perlakuan inkubasi. 6) Kadar hambat minimum (KHM) atau minimal inhibitory concentration (MIC) ditentukan dengan membandingkan OD setelah perlakuan inkubasi dikurangi OD sebelum perlakuan. 7) Cara yang sama juga dilakukan untuk enam tabung reaksi dengan 6 seri konsentrasi ekstrak etanol daun kemangi tanpa ditambahkan suspensi bakteri, tetrasiklin 50 µg/ml sebagai kontrol positif, serta suspensi bakteri dan media nutrien cair sebagai kontrol negatif. E. Analisis Data Data hasil pengukuran zona hambat ekstrak etanol daun kemangi terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis FNCC 0048 dan Pseudomonas aeruginosa FNCC 0063 yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analysis of variance (ANOVA) untuk mengetahui pengaruh perlakuan ekstrak etanol daun kemangi terhadap parameter yang diukur yaitu zona hambat kemudian dilanjutkan dengan uji Duncan s multiple range test (DMRT) pada taraf 5% untuk mengetahui beda nyata di antara perlakuan, sedangkan hasil pengukuran absorbansi pada uji MIC pada kedua bakteri tersebut dianalisis secara deskriptif.