BAB III METODE PENELITIAN. Biologi FST Universitas Airlangga pada bulan Maret sampai dengan bulan Juli

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FST Universitas Airlangga pada bulan Maret sampai dengan bulan Juli Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris yang menggunakan rancangan acak lengkap dengan tiga kali ulangan. Penelitian terdiri dari sembilan perlakuan, yaitu (A, T, B, Ea, Eb, Ec, BEa, BEb, BEc) dengan rincian perlakuan (A) akuades, (T) surfaktan sintetis Tween-20 sebagai kontrol, (B) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1), variasi konsentrasi enzim yang digunakan adalah crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 yang selanjutnya diberi kode (Ea, Eb, Ec) dengan masing-masing konsentrasi 1 ml (12,5 % (v/v)), 2 ml (25 % (v/v)), 3 ml (37,5 % (v/v)), serta campuran biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) dengan crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 (BEa, BEb, BEc). 37

2 38 Rincian perlakuannya adalah sebagai berikut: Tabel 3.1Kombinasi perlakuan penelitian Biosurfaktan Surfaktan sintetis Jenis crude enzyme Kode Oil Acinetobacter sp. Tween-20 Lipase perlakuan sludge P2(1)[=CMC] [=CMC] Ea Eb Ec A T (kontrol) B Ea Eb Ec Bea BEb BEc Keterangan: (-) tidak ditambahkan (+) ditambahkan 3.3 Variabel Penelitian Variabel penelitian meliputi: (1) variabel bebas : konsentrasi crude enzyme (ekstrak kasar) lipase Micrococcus sp. L II 61 1 ml (12,5 % (v/v)), 2 ml (25 % (v/v)), 3 ml (37,5 % (v/v)) (2) variabel terikat : persentase kelarutan oil sludge (%). (3) variabel kendali: volume oil sludge perlakuan (0,20 ml), media, ph media, kecepatan agitasi (rpm), volume biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) (3 ml) dan lama waktu agitasi (menit). 3.4 Bahan dan Alat Penelitian Isolat bakteri penelitian Isolat bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah Micrococcus sp. L II 61 yang diisolasi oleh Fatimah dan Nurhariyati (2011)

3 39 sebagai sumber penghasil enzim lipase dan Acinetobacter sp. P2(1) yang diisolasi oleh Ni matuzahroh dkk. (2009) untuk memproduksi biosurfaktan adalah dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga Bahan penelitian a. Media pertumbuhan bakteri penghasil biosurfaktan dan crude enzyme Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), air mineral sintetis (AMS) komposisi dari Pruthi and Cameotra (1997), akuades, minyak goreng dan molase 4%. b. Bahan kimia (NH 4 ) 2 SO 4, MgSO 4. 7H 2 O, NaCl, CaCl 2, MnSO 4. H 2 O, H 3 BO 3, ZnSO 4. 7H 2 O, CuSO 4. 5H 2 O, CoCl 2. 6H 2 O, dan Na 2 M o O 4. 2H 2 O, NaOH 10%, HCl 5%, KH 2 PO 4, K 2 HPO 4, FeSO 4.7H 2 O, alkohol, dan Tween-20. c. Bahan uji kelarutan oil sludge Oil sludge, aluminium foil, cling wrap, kapas, kertas koran, kertas saring Whatman no. 1 dengan diameter 110 mm, label, dan spiritus Alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoclave Ogawa Seiki, bak plastik, botol kultur, botol fial, cawan Petri, Erlenmeyer, gelas ukur, gelas Beaker, Finn pipet, jarum ose loop, kompor listrik, kuvet, Laminar Air Flow (LAF), lemari es, mikropipet, magnetic stirrer MG-78-1, neraca analitik Shimadzu AEL-200, oven, indikator ph fix 1-14 Macherey-Nagel, pinset, pipet volume, bunsen, rak tabung reaksi, sentrifuge Beckman, shaker incubator, spatula

4 40 besi, spatula kaca, spektrofotometer (spectronic 20 Bausch-Lomb), tabung reaksi, tensiometer Du-Nouy, tip mikropipet, vortex dan waterbath. 3.5 Prosedur Penelitian Pembuatan media untuk bakteri Sebanyak 2,8 gram NA dilarutkan ke dalam 100 ml akuades dan dipanaskan pada hot plate hingga mendidih. Kemudian media dituang ke dalam 20 tabung reaksi dimana masing-masing tabung diisi 5 ml NA sebagai stock NA miring. Tabung reaksi yang berisi NA selanjutnya disumbat dengan kapas dan ditutup dengan aluminium foil. Kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121º C, 1 atm, selama 20 menit. Tabung reaksi berisi NA yang telah disterilisasi selanjutnya dimiringkan dan didiamkan sampai media memadat (Renjana, 2011) Pembuatan media air mineral sintesis Air Mineral Sintetis (AMS) yang digunakan merupakan komposisi dari Pruthi and Cameotra (1997). Media AMS dibuat dengan cara melarutkan bahan (NH 4 ) 2 SO 4 (3 g), MgSO 4. 7H 2 O (0,2 g), NaCl (10 g), CaCl 2 (0,01 g), MnSO 4. H 2 O (0,001 g), H 3 BO 3 (0,001 g), ZnSO 4. 7H 2 O (0,001 g), CuSO 4. 5H 2 O (0,001 g), CoCl 2. 6H 2 O (0,005 g), dan Na 2 M o O 4. 2H 2 O (0,001 g) ke dalam 1000 ml akuades. Larutan tersebut dihomogenkan menggunakan pengaduk magnetik dan ph larutan dinetralkan dengan penambahan NaOH 10% atau HCl 5%. Kemudian disterilkan yang disebut sebagai larutan makro nutrien dan ditambah larutan mikro nutrien stok KH 2 PO 4 (1 g) dan K 2 HPO 4 (1 g) dalam 50 ml akuades beserta stok FeSO 4.7H 2 O (1 g) dalam 50 ml akuades setelah disterilkan secara terpisah.

5 Pembuatan stok bakteri Biakan murni Micrococcus sp. L II 61 dan Acinetobacter sp. P2(1) diperbanyak dalam media Nutrient Agar (NA) miring yang telah disiapkan untuk stok. Bakteri ditanam dengan metode gores (streak). Biakan bakteri diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang (27-30 o C). Koloni yang tumbuh baik digunakan sebagai stok bakteri selama penelitian. Gambar 9. Teknik peremajaan mikroba dengan metode streak (gores) pada tabung agar miring (Tortora et al., 2010) Perbanyakan bakteri dalam Nutrient Broth Media Nutrient Broth (NB) yang dibuat dengan cara melarutkan NB (13 g/l) dalam akuades kemudian disterilkan dengan autoclave. Masing-masing dua ose biakan bakteri Micrococcus sp. L II 61 dan Acinetobacter sp. P2(1) dari media agar miring diinokulasikan ke dalam botol 250 ml yang berisi 50 ml media NB. Kultur bakteri dalam Nutrient Broth diinkubasi pada shaker incubator selama 24 jam pada suhu o C, selanjutnya kultur dapat dijadikan stock penelitian (Renjana, 2011).

6 Produksi biosurfaktan Botol kultur ukuran 500 ml diisi dengan 86,4 ml campuran Air Mineral Sintetis (AMS) dan 4% substrat molase (v/v), ph 7. Media disterilkan dengan autoclave. Kemudian ditambahkan 4,8 ml stok KH 2 PO 4 dan K 2 HPO 4, 4,8 ml stok FeSO 4. 7H 2 O dan 4% starter bakteri Acinetobacter sp. P2(1) (4 ml) yang memiliki nilai OD= 0,5 pada λ= 650 nm sehingga total volume larutan adalah 60 ml. Kultur bakteri kemudian diinkubasi dalam shaker dengan kecepatan 120 rpm selama 3 hari (Suciastuti, 2011) Karakterisasi biosurfaktan Kultur bakteri yang telah diinkubasi selama 3 hari ditanam dengan metode streak (gores) pada cawan Petri berisi media Nutrient Agar untuk mengetahui adatidaknya kontaminasi dari mikroba lain. Lalu, sel bakteri dipisahkan dari medium yang mengandung biosurfaktan dengan sentrifugasi (9000 rpm, 4 o C, 15 menit). Supernatan hasil sentrifugasi dipisahkan dari peletnya dan dikarakterisasi dengan mengukur tegangan permukaan serta aktivitas emulsifikasi supernatan kultur menggunakan solar. Pengukuran tegangan permukaan (TP) (mn/m) supernatan kultur bakteri dilakukan menggunakan tensiometer Du-Nouy seperti yang ditunjukkan pada gambar 10. Sebanyak 10 ml supernatan dari kultur bakteri Acinetobacter sp. P2(1) dimasukkan ke dalam cawan Petri yang bersih dan bebas lemak. Mula-mula cawan Petri ditempatkan pada meja sampel yang datar, cincin digantungkan pada pengait yang terdapat pada alat tersebut dan skala diatur pada angka 0. Kemudian, cawan Petri berisi sampel dinaikkan perlahan-lahan dengan cara memutar alat

7 43 pengatur dibagian bawah alat hingga cincin dapat tercelup tepat pada permukaan cairan sampel. Setelah itu, alat pengatur yang ada disisi lain digerakkan hingga cincin terlepas dari sampel. Nilai tegangan permukaan yang didapat adalah nilai skala pada saat cincin terlepas dari sampel (Ni matuzahroh dkk., 2009). Nilai tegangan permukaan sampel dihitung menggunakan rumus. Akuades dan molase digunakan sebagai kontrol, dinyatakan dalam dyne/cm dan dilaporkan sebagai hasil rata-rata dari 3 ulangan, dengan menggunakan rumus: r = r o x Dimana: r = tegangan permukaan sampel r o = tegangan permukaan akuades pada t o C = tegangan permukaan sampel yang terbaca pada alat o = tegangan permukaan akuades yang terbaca pada alat Penurunan nilai tegangan permukaan (>10 dyne/cm) menunjukkan bahwa bakteri tersebut berpotensi menghasilkan biosurfaktan. Sedangkan aktivitas emulsifikasi diukur dengan menggunakan metode Suryatmana dkk. (2006). Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 1 ml supernatan ditambah dengan 1 ml solar. Setelah divortex selama 2 menit, diamati aktivitas emulsifikasi (AE) (%) setelah 1 jam dan 24 jam diamati dengan mengukur tinggi fase emulsi (cm) terhadap tinggi total cairan (cm) dikali 100% (Pruthi and Cameotra, 1997). % Emulsifikasi = tinggi emulsi tinggi totalcairan X100%

8 44 Gambar 10. Tensiometer du-nouy (Muna, 2011) Produksi crude enzyme lipase Media produksi crude enzyme lipase yang digunakan adalah media Nutrient Broth (13 g/l) yang ditambahkan dengan substrat minyak goreng sebanyak 2% (v/v). Sebanyak 100 ml media dimasukkan ke dalam masingmasing botol kultur ukuran 500 ml dan disterilisasi pada suhu 121 o C selama 15 menit (Suciastuti, 2011). Sebanyak 5% (v/v) kultur Micrococcus sp. L II 61 dalam Nutrient Broth dengan nilai absorbansi 0,5 pada λ 650 nm diinokulasikan ke dalam masing-masing botol kultur berukuran 500 ml yang telah berisi media produksi dengan volume 100 ml. Inkubasi dilakukan dalam shaker pada suhu ruang dengan agitasi 120 rpm selama 16 jam. Supernatan crude enzyme diperoleh dengan cara kultur disentrifugasi pada kecepatan rpm dalam suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan hasil sentrifugasi tersebut digunakan sebagai crude enzyme (ekstrak kasar enzim). Crude enzyme lipase tersebut diuji aktivitas lipolitik secara kuantitatif, selain itu juga dilakukan pengukuran nilai tegangan permukaan

9 45 (mn/m) serta aktivitas emulsifikasi (%) pada solar setelah 1 dan 24 jam (Pruthi and Cameotra, 1997) Pengukuran aktivitas lipolitik crude enzyme lipase Pengukuran tegangan permukaan (TP) (mn/m) crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 dilakukan menggunakan tensiometer Du-Nouy. Sedangkan, nilai aktivitas emulsi setelah 1 jam dan 24 jam pada solar diamati dengan mengukur tinggi fase emulsi (cm) terhadap tinggi total cairan (cm) dikali 100% (Pruthi and Cameotra, 1997) Persiapan oil sludge dalam tabung reaksi untuk perlakuan Oil sludge dipipet sebanyak 0,20 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang ditambahkan 7,80 ml larutan uji sehingga konsentrasi oil sludge dalam larutan uji sebesar 2,5% (v/v). Berat oil sludge ditimbang menggunakan timbangan analitik dan dicatat sebagai Wop Perlakuan Penelitian ini termasuk ke dalam penelitian eksperimental yang terdiri atas 1 kontrol dan 8 perlakuan dengan rincian sebagai berikut : Perlakuan 1 (A), yaitu 0,20 ml oil sludge + 7,80 ml akuades. Kontrol (T), yaitu 0,20 ml oil sludge + 7,80 ml surfaktan sintetis Tween-20 pada konsentrasi sama dengan CMC. Perlakuan 2 (B), yaitu 0,20 ml oil sludge + 7,80 ml biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) Perlakuan 3 (Ea), yaitu 0,20 ml oil sludge + 1 ml crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II ,80 ml akuades.

10 46 Perlakuan 4 (Eb), yaitu 0,20 ml oil sludge + 2 ml crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II ,80 ml akuades. Perlakuan 5 (Ec), yaitu 0,20 ml oil sludge + 3 ml crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II ,80 ml akuades. Perlakuan 6 (BEa), yaitu 0,20 ml oil sludge + 3 ml biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 1 ml crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II ,80 ml akuades. Perlakuan 7 (BEb), yaitu 0,20 ml oil sludge + 3 ml biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 2 ml crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II ,80 ml akuades. Perlakuan 8 (BEc), yaitu 0,20 ml oil sludge + 3 ml biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 3 ml crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II ,80 ml akuades. Kontrol perlakuan dalam penelitian ini menggunakan surfaktan sintetis Tween-20 yang merupakan surfaktan tandingan dari biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1). Volume total tiap perlakuan adalah 8 ml sehingga masing-masing penambahan 1 ml crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61 setara dengan 12,5% (v/v), 2 ml 25% (v/v), 3 ml 37,5% (v/v) dan pada perlakuan penambahan biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) sebesar 37,5% (v/v).

11 Uji kelarutan oil sludge Seluruh kelompok kontrol dan perlakuan yang masing-masing terdiri atas 3 ulangan, divortex pada suhu ruang (27 30 o C) selama 15 menit. Oil sludge yang terlarut (dalam fase cair) lalu, dilakukan sentrifugasi pada kecepatan rpm selama 15 menit pada suhu 4 C sebanyak 5 ml. Kemudian supernatan didiamkan selama 15 menit sebelum difiltrasi. Pada perlakuan tanpa sentrifugasi, setelah divortex perlakuan didiamkan selama 15 menit kemudian difiltrasi. Kelarutan oil sludge diketahui dengan cara melakukan filtrasi atau penyaringan fase cair dari masing-masing perlakuan Filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan Kertas saring Whatman no. 1 dengan diameter 110 mm dan disiapkan untuk filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan. Kertas saring yang digunakan untuk filtrasi dibungkus dengan aluminium foil. Aluminium foil dan kertas saring dioven dengan suhu o C selama satu hari kemudian ditimbang dengan neraca analitik dan dicatat beratnya sebagai Wo. Sebanyak 1 ml sampel fase cair dari hasil sentrifugasi dituang ke dalam aluminium foil dengan kertas saring di dalamnya. Kelarutan oil sludge diukur dari oil sludge yang terpisah dan terperangkap dikertas saring tersebut. Kertas saring yang telah ditambahkan 1 ml sampel dikeringkan dengan cara dioven pada suhu C selama enam jam. Kertas saring yang telah kering kembali ditimbang dan dicatat beratnya sebagai Wt. Berat kering dinyatakan sebagai berat yang tidak berubah kembali setelah proses pengovenan.

12 48 Semua prosedur yang dilakukan ketika filtrasi fase cair dari kontrol dan perlakuan ini dilakukan secara bebas lemak. Setiap perlakuan yang dilakukan dalam uji kelarutan oil sludge, selalu disertai dengan blanko. Blanko merupakan berat larutan Tween-20, supernatan biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) dan crude enzyme Micrococcus sp. L II 61 tanpa penambahan oil sludge yang diperlakukan sama seperti perlakuan lainnya. Berat kering blanko dari masing-masing perlakuan dicatat sebagai Wb Penghitungan nilai persentase kelarutan oil sludge Nilai persentase kelarutan oil sludge dari masing- masing perlakuan dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Dimana: Wot = berat oil sludge terlarut (g) Wb = berat blanko perlakuan (g) Wop = berat oil sludge perlakuan (g) Sedangkan berat oil sludge terlarut dihitung menggunakan rumus berikut: Dimana: Wot = berat oil sludge terlarut (g/volume total) Wt = berat kertas saring + oil sludge terlarut (g/ml) Wo = berat kertas saring (g)

13 Analisis Data Penelitian Data yang didapat dalam penelitian ini adalah karakteristik dari biosurfaktan dalam supernatan kultur Acinetobacter sp. P2(1), larutan produk kasar biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1), larutan surfaktan sintetis Tween-20 pada konsentrasi sama dengan CMC serta crude enzyme (ekstrak kasar) lipase Micrococcus sp. L II 61, yaitu nilai tegangan permukaan (TP) (mn/m) serta aktivitas emulsifikasi (AE) (%) terhadap solar setelah 1 jam dan 24 jam. Aktivitas enzimatik crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61. Serta data kelarutan oil sludge (%) oleh biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) konsentrasi sama dengan CMC dan atau crude enzyme lipase Micrococcus sp. L II 61. Data perolehan produk kasar, nilai tegangan permukaan dan aktivitas emulsifikasi dari biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) terhadap solar dianalisis untuk mengetahui adanya produk biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1). Data kelarutan oil sludge (%) dianalisis secara statistik, langkah pertama data diuji berdistribusi normal dengan menggunakan uji One sample Kolmogorov-Smirnov. Pengujian selanjutnya untuk mengetahui asumsi data memiliki varians bersifat homogen digunakan uji Levene test. Data kelarutan oil sludge (%) berdistribusi normal dan memiliki varians homogen, dilanjutkan dengan uji One-way Analysis of Varians (ANOVA) (derajat signifikasi 5%) pada program Statistical Package For Social Science (SPSS) menunjukkan beda nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan karena datanya homogen yang bertujuan untuk mengetahui pasangan kelompok perlakuan mana yang memiliki nilai kelarutan oil sludge berbeda signifikan.