III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT 1. Bahan Bahan baku utama dalam penelitian ini adalah tongkol jagung manis kering yang diperoleh dari daerah Leuwiliang, Bogor. Kapang yang digunakan untuk proses delignifikasi adalah fungi pelapuk putih jenis Phanerochaete chrysosporium yang diperoleh dari Laboratorium Patologi, Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB. Kapang lain yang digunakan adalah kapang selulolitik Aspergillus niger dan Trichoderma viride yang diperoleh dari Laboratorium Bioindustri, Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian IPB. Bahan-bahan lain yang digunakan dalam proses delignifikasi dan hidrolisis tongkol jagung antara lain, media PDA (Potato Dextrose Agar), PDB (Potato Dextrose Broth), bekatul, spiritus, alkohol, akuades, glukosa, dan sumber mineral untuk media yang meliputi KH 2 PO 4, MgSO 4.7H 2 O, CaCl 2.H 2 O, FeCl 3.6H 2 O, ZnSO 4.7H 2 O, CuSO 4.5H 2 O. Bahan untuk analisis hasil delignifikasi dan hidrolisis adalah air destilata, heksan, H 2 SO 4, NaOH, akuades, fenol, DNS (Dinitrosalisilat), natrium sulfit, Cetyl Trimethyl Amonium Bromida, pereaksi Neutral Detergent Fiber (NDF), enzim α-amilase, bufer fosfat, dan bahan-bahan lain. 2. Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain hammer mills, disc milling cutter, neraca analitik, penyaring 40-60 mesh, oven, otoklaf, inkubator, jarum Ose, plastik wrap, tabung reaksi, cawan petri, labu ukur, labu Erlenmeyer, aluminium foil, desikator, labu didih, tabung Soxhlet, kertas saring, sudip, penjepit, pengaduk kaca, gelas penyaring, kain saring, magnetic stirrer, gelas kimia, pipet, sumbat kapas, ruang asap, pompa vakum, pembakar Bunsen, clean bench, dan orbital shaker. B. METODE PENELITIAN 1. Karakterisasi Bahan Baku Bahan baku berupa tongkol jagung dijemur dan dikeringkan untuk memudahkan proses pengolahan. Selanjutnya tongkol jagung kering dikecilkan ukurannya menggunakan hammer mill hingga ukuran ± 20 mesh dan dilanjutkan dengan disc milling cutter hingga ± 40 mesh. Pada tahap awal ini dilakukan uji proksimat, yaitu uji kadar air, protein kasar, lemak kasar, abu, serat kasar, serta penghitungan karbohidrat (by difference). Selain itu juga dilakukan analisis komponen serat yaitu selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Prosedur analisis untuk karakterisasi bahan baku disajikan pada Lampiran 1. 12
2. Delignifikasi Secara Biologis a. Persiapan Substrat Tongkol jagung berukuran 40 mesh dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan selanjutnya diberi tambahan mineral (Tabel 2) untuk persiapan pertumbuhan P. chysosporium. Tabel 2. Komponen mineral untuk pertumbuhan P.chrysosporium Komponen Jumlah (g/150 ml) KH 2 PO 4 7.20 MgSO 4.7H 2 O 1.50 CaCl 2.H 2 O 0.30 FeCl 3.6H 2 O 0.045 ZnSO 4.7H 2 O 0.023 CuSO 4.5H 2 O 0.015 MnSO 4.H 2 O 0.03 Sumber : Fadillah et al., (2008) Larutan mineral selanjutnya ditambahkan ke dalam bahan dengan perbandingan 1.5 ml/g bahan padatan tongkol jagung. Campuran tongkol jagung dan mineral disterilisasi menggunakan otoklaf dengan suhu 121 o C selama 15 menit. b. Penyiapan Inokulum Kultur yang baik dijadikan inokulum adalah kultur yang segar. Untuk menyegarkan dan menumbuhkan kultur kapang yang telah disimpan sebagai stok kultur dalam cawan petri maka perlu dilakukan peremajaan kultur. Biakan Phanerochaete chrysosporium diremajakan dengan cara menginokulasikan kultur pada media agar miring Potato Dextrose Agar (PDA) yang sebelumnya telah disterilkan pada otoklaf selama 30 menit pada suhu 121 o C. Selanjutnya kultur diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang (30 o C). Untuk melihat pertumbuhan kapang pada media dilakukan pengamatan secara visual karena penampakan miselia pada media terlihat dengan jelas. Media yang digunakan untuk perbanyakan kultur adalah media cair Potato Dextrose Broth. Medium sebanyak 225 ml disiapkan, disterilisasi pada suhu 121 o C selama 15 menit dalam otoklaf, dan diinokulasi kapang segar setelah suhunya < 30 o C. Inokulasi dilakukan dengan mengambil 1-2 Ose isolat agar miring dan dicampurkan ke dalam media Potato Dextrose Broth (PDB). Inkubasi dilakukan pada shaker dengan kecepatan 140 rpm selama 6 hari. 13
c. Proses Kultivasi Sebanyak 150 g tongkol jagung yang telah tercampur dengan 225 ml larutan mineral disiapkan dalam keadaan steril untuk kultivasi. Media steril diinokulasi setelah suhunya di bawah 38 o C. Inokulasi inokulum cair dilakukan dengan perbandingan 0.25 ml/g tongkol jagung kering, sehingga suspensi kapang P. chrysosporium yang diinokulasi adalah sebanyak 37.5 ml untuk 150 g bahan kering. Proses kultivasi dilakukan pada suhu 30 o C selama 20 hari. Pertumbuhan kapang dihentikan dengan sterilisasi bahan dalam otoklaf bersuhu 121 o C selama 30 menit dan sterilisasi sinar ultraviolet selama 2 jam. d. Proses Hilir Tongkol jagung hasil delignifikasi diberi perlakuan pencucian dengan akuades bersuhu 60 o C untuk melarutkan lignin yang terlepas dan meregangkan ikatan lignoselulosa. Volume air yang digunakan untuk mencuci lignin adalah 500 ml/150 g tongkol awal. Tongkol jagung terdelignifikasi selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 50 o C selama 48 jam. Tongkol jagung hasil pencucian dan pengeringan disebut sebagai tongkol jagung terdelignifikasi. Bahan ini selanjutnya dianalisis untuk mengetahui perubahan yang terjadi terhadap kadar air, protein kasar, lemak kasar, abu, serat kasar, total gula, gula pereduksi, lignin, selulosa, dan hemiselulosa. Prosedur analisis tongkol jagung terdelignifikasi disajikan pada Lampiran 1. Diagram alir proses delignifikasi dapat dilihat pada Gambar 7 dan Lampiran 2. 3. Hidrolisis Oleh Kapang Selulolitik a. Persiapan Substrat Bahan yang digunakan untuk proses hidrolisis selulolitik adalah tongkol jagung yang sebelumnya telah melalui proses delignifikasi sebanyak 75 g. Serbuk limbah tongkol jagung tersebut dimasukkan dalam wadah plastik, ditambah air sampai kadar 67 %, diberi perlakuan penambahan urea atau penambahan amonium sulfat 3 % (b/b). Selanjutnya bahan disterilisasi dalam otoklaf dengan suhu 121 o C selama 15 menit. b. Penyiapan Inokulum Biakan Aspergillus niger dan Trichoderma viride segar diperoleh dengan peremajaan pada media Potato Dextrose Agar (PDA) yang sebelumnya telah disterilkan di otoklaf selama 15 menit pada suhu 121 o C. Selanjutnya kultur diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang (30 o C). Media yang digunakan pada perbanyakan kultur untuk penyiapan inokulum adalah media bekatul. Sebanyak 67.5 g bekatul kering direndam dalam 200 ml akuades selama 24 jam dan ditiriskan kemudian dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disumbat kapas. Media disterilisasi pada suhu 121 o C selama 15 menit dalam otoklaf selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang (30 o C) selama beberapa jam sampai siap diinokulasi kapang. Inokulasi kultur A. niger dan T. viride diawali dengan menambahkan 10 ml akuades steril ke dalam biakan (dalam PDA). Selanjutnya miselia dan spora tercampur dalam akuades 14
dan dituang merata ke dalam media bekatul. Inokulum selanjutnya diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang. Pada kondisi tersebut terlihat adanya pertumbuhan spora pada permukaan bekatul. c. Proses Kultivasi Inokulasi dilakukan setelah suhu media tongkol jagung steril berada di bawah 30 o C. Inokulum yang akan digunakan sebelumnya diaduk terlebih dahulu untuk meratakan kultur kapang yang tumbuh di dalam media. Inokulum T. viride dan A. niger diinokulasi masingmasing pada media yang berbeda sesuai dengan perlakuan yang digunakan. Inokulum yang diinokulasi adalah 15 % (b/b) dari bobot tongkol jagung hasil delignifikasi yang digunakan. Kultivasi dilakukan pada inkubator suhu ruang (± 25 o C) selama 9 hari d. Proses Hilir Tongkol jagung yang telah dikultivasi selama 9 hari selanjutnya dikeringkan untuk menghindari terjadinya perubahan komposisi bahan akibat aktivitas kapang. Selanjutnya tongkol jagung dianalisis kadar air, protein kasar, abu, lemak kasar, serat kasar, total gula, gula pereduksi, lignin, selulosa, hemiselulosa, dan daya cerna bahan secara in vitro. Prosedur analisis bahan hasil hidrolisis disajikan pada Lampiran 1. Diagram alir proses hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 8 dan Lampiran 3. 4. Rancangan Percobaan Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial 3 x 2 dengan dua ulangan. Faktor pertama menunjukkan jenis sumber nitrogen, yaitu perlakuan penambahan urea [(CO(NH 2 ) 2 ], perlakuan penambahan amonium sulfat (ZA=[(NH 4 ) 2 SO 4 ]), dan perlakuan tanpa penambahan sumber nitrogen. Faktor kedua adalah waktu pengambilan sampel dalam kultivasi yaitu hari ke-0 dan hari ke-9. Model Rancangan Percobaan Acak Kelompok adalah sebagai berikut (Mattjik et al. 2006) : Y ijk = u + A i + Bj + AB ij + k(ij) Y ijk = variable respon dari hasil observasi ke-k yang terjadi karena pengaruh taraf faktor ke-i faktor jenis sumber nitrogen dan tarat ke-j waktu u = nilai tengah populasi A i = efek dari taraf ke-i faktor jenis sumber nitrogen Bj = efek dari taraf ke-j faktor waktu AB ij = efek interaksi antara taraf ke-i faktor jenis sumber nitrogen dan taraf ke-j faktor waktu k(ij) = galat percobaan dari perlakuan jenis sumber nitrogen ke-i dan perlakuan waktu ke-j pada pengamatan ke-k. Perlakuan rancangan percobaan dilakukan pada tahap hidrolisis tongkol jagung dengan pemanfaatan dua jenis kapang yang berbeda. Kapang yang pertama adalah Aspergillus niger 15
dan yang kedua adalah Trichoderma viride. Pengamatan dilakukan terhadap pembentukan oligosakarida (total gula) dan perubahan kadar protein. Data tersebut kemudian diolah dengan menggunakan program SPSS 15.0 untuk melihat keragaman yang terjadi pada setiap perlakuan dan interaksi antara perlakuan. Uji lanjut Duncan dilakukan jika terjadi pengaruh yang signifikan antara bahan pada perlakuan yang berbeda, sehingga dapat diketahui perbedaan yang terjadi antar level. Biakan P. chrysosporium Tongkol jagung kering (40 mesh) Campuran mineral Penyegaran P. chrysosporium (agar cawan petri, suhu 30 o C, 6 hari) Delignifikasi (inkubasi suhu 30 o C, selama 20 hari) Pembuatan inokulum (media PDB, 6 hari) Sterilisasi (suhu 121 o C selama 30 menit) Inokulum cair P. chrysosporium (25 % v/b) Pencucian dengan akuades bersuhu 60 o C Tongkol jagung hasil delignifikasi Analisis proksimat, lignin, hemiselulosa, selulosa, gula pereduksi, total gula, daya cerna in vitro Gambar 7. Diagram alir proses delignifikasi tongkol jagung dengan kapang Phanerochaete chrysosporium 16
Tongkol jagung hasil delignifikasi Biakan T. viride / A. niger Hidrolisis selulosa Penyegaran (agar miring, suhu 30 o C, 6 hari) Inokulasi untuk inokulum (media bekatul, 10 hari) (A.niger, T.viride), (urea 3% (b/b), ZA 3% (b/b), dan tanpa sumber nitrogen tambahan) Suhu kamar, 9 hari, aerobik Kadar air 67 % (v/b) inokulum padat (15 % b/b) Pengeringan (Oven suhu 50 o C, 48 jam) Analisa proksimat, lignin, ADF, NDF, gula pereduksi, total gula, dan daya cerna in vitro Gambar 8. Diagram alir proses hidrolisis tongkol jagung terdelignifikasi dengan kapang selulolitik. 17