3. METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 3. METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai bulan Juli Pengujian dilaksanakan di Laboratorium Mekanisasi Proses, Laboratorium Bioteknologi dan koleksi kultur, Laboratorium Kimia dan Laboratorium instrument Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Jakarta, laboratorium Kimia Hasil Hutan-THH IPB dan Laboratorium Saraswanti, Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan Bahan baku yang digunakan adalah limbah ekstraksi alginat dari rumput laut coklat (Sargassum sp), kapang Trichoderma viride dan khamir Saccharomyces cereviceae. Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam pembuatan media adalah pepton, tween 80, (NH 4 ) 2 SO 4, Urea (H 2 NCONH 2 ), KH 2 PO 4.3H 2 O, CaCl 2.2H 2 O, MgSO 4.7H 2 O dan mineral stok yang terdiri dari HCl 37%, FeSO 4.7H 2 O, ZnCl 2, CoCl 2.6H 2 O. Bahan kimia yang digunakan dalam pembuatan reagen DNS (asam 3, 5- dinitrosalisilat) adalah DNS, NaOH, Na-K tartrat, phenol dan Na-Metabisulphite. Sedangkan bahan kimia lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Potato Dextro Agar (PDA), buffer sitrat 0,2 M, asam sitrat, trisodium sitrat, HCl, NaOH, Na 2 CO 3, glukosa monohidrat dan yeast ekstrak Alat Alat yang digunakan untuk penelitian meliputi : erlemeyer 2 L, water bath, ph meter, bulb, mikropipet µl, tabung reaksi, labu ukur, batang pengaduk, autoklaf, inkubator, dan gelas ukur. Alat-alat yang digunakan untuk analisa meliputi : cawan, oven, furnace, desikator, alumunium foil, erlemeyer, ruang laminar, timbangan digital, waterbath, gelas piala, vortex, penangas air, spektrometer UV/VIS Perkin Elmer, kompor listrik, kuvet, corong pisah, ph meter, dan GC (Gas Chromatography)

2 Tahapan Penelitian Sakarifikasi dan fermentasi simultan (SFS) dengan kultur biakan T. viride dan S. cereviceae dari limbah ekstraksi alginat untuk pembuatan bioetanol terdiri dari dua tahap penelitian yaitu persiapan kultur mikroorganisme dan proses sakarifikasi dan fermentasi simultan. Dua tahap penelitian ini merupakan modifikasi dari Arnata (2009) dan Sari (2010). Tahapan penelitian antara lain meliputi : 1) persiapan kultur dan 2) proses sakarifikasi dan fermentasi simultan (SFS) selama 4 hari dengan dua kali pengulangan. 1) Persiapan kultur Persiapan kultur pada penelitian ini meliputi persiapan kultur kapang T.viride, dimana kultur kapang T. viride sebelum digunakan disegarkan dulu agar dapat memproduksi enzim selulase dengan optimal. Media yang digunakan adalah PDA (Potato Dextrose Agar) yang dibuat miring. Tahapan persiapannya sebagai berikut : PDA ditambah akuades (39g/L), kemudian dipanaskan di atas hotplate dan diaduk sampai larutan berwarna kuning jernih, lalu dituangkan kedalam tabung reaksi sebanyak 7 ml tiap tabung reaksi dan ditutup rapat, kemudian dilakukan sterilisasi dengan autoklaf pada suhu C dan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. Tabung reaksi dimiringkan selama 1 hari. Keesokan harinya dilakukan inokulasi dengan cara menggores secara zig zag menggunakan jarum ose yang dimulai dari dasar tabung. Semua dilakukan dalam kondisi aseptis. Selanjutnya T.Viride diinkubasi pada suhu C selama 7 hari. Skema persiapan kultur T.viride dapat dilihat pada Gambar 2. Persiapan kultur S.cereviceae yang dilakukan dengan cara membiakkan S. cereviceae pada media PDA yang telah ditambah yeast extract dan aquades, kemudian dipanaskan di atas hotplate lalu diaduk sampai larut. Proses persiapan kultur S. cereviceae selanjutnya sama seperti persiapan kultur T.viride. Skema persiapan kultur S. cereviceae dapat dilihat pada Gambar 3.

3 14 Penambahan media PDA sebanyak 39 g dalam 1 L aquades Penuangan ke dalam tabung reaksi sebanyak 7 ml Pemanasan di atas hotplate dan pengadukan sampai larutan berwarna kuning Sterilisasi ke dalam autoklaf pada suhu C dan tekanan 1,5 atm Inokulasi kultur Trichoderma viride secara zig-zag Inkubasi selama 7 hari ( C) Gambar 2 Skema persiapan biakan Trichoderma viride. Penambahan media PDA sebanyak 39 g, yeast ekstrak 1% sebanyak 1 gr dalam 1 L aquades Penuangan ke dalam tabung reaksi sebanyak 7 ml Pemanasan di atas hotplate dan pengadukan Sterilisasi ke dalam autoklaf pada suhu C dan tekanan 1,5 atm Penggoresan kultur Saccharomyces cereviceae secara zig-zag Penginkubasian selama 3 hari ( C) Gambar 3 Skema persiapan biakan Saccharomyces cereviceae.

4 15 2) Proses sakarifikasi dan fermentasi simultan Proses sakarifikai dan fermentasi simultan dilakukan dengan cara memasukkan limbah ekstraksi alginat ke dalam erlemeyer 2 L dan dicampur dengan air sambil diaduk sampai berbentuk bubur (dikuantifikasi jumlah aquades yang diperlukan). Setelah itu dilakukan penambahan media andreoti, pepton dan tween 80 dan dilakukan pengecekan ph media setelah itu ditentukan phnya menjadi 4; 4,5; dan 4,8 dengan penambahan HCL 3M atau NaOH 3M dan ph dijaga dengan larutan buffer Na-sitrat 0,2 M. Kemudian dilakukan proses sterilisasi pada suhu C selama 15 menit. Setelah suhu medianya C, ditambahkan kultur T. viride dan kultur S. cereviceae diinkubasi dalam waterbath pada suhu 30, 34 dan 38 0 C. Pengambilan sampel dilakukan setiap 24 jam selama proses fermentasi dan sakarifikasi simultan berlangsung dengan melakukan pemisahan antara padatan dan cairan (filtrat) selama 4 hari. Skema proses sakarifikasi dan fermentasi simultan dapat dilihat pada Gambar 4. Limbah rumput laut sebanyak 100 gr Air dengan volume 1 L Pemasukkan dalam erlemeyer dengan kapasitas 2 L Pencampuran sampai berbentuk bubur Pengadukan Penentuan ph 4; 4,5; 4,8 dengan penambahan HCL 3M atau NaOH 3M dan ph dijaga dengan larutan Buffer Na-sitrat Penambahan media andreoti, pepton, tween 80 dan dicek ph Pemanasan untuk sterilisasi pada suhu C, 15 Menit Pengadukan Pendinginan sampai suhu C

5 16 Penambahan 10% (v/v) dari jumlah sel suspensi T. viride dan S. cereviceae per 100 ml media Pengukuran suhu, OD, dan ph setiap 24 jam Sakarifikasi dan fermentasi simultan selama 4 hari, pada suhu 30 0 C, 34 0 C dan 38 0 C dalam waterbath Analisa pertumbuhan jumlah mikroorganisme dengan mengukur OD λ = 600 nm, Total Gula Pereduksi (TGP) setiap 24 jam dan Gambar 4 Skema sakarifikasi dan fermentasi simultan. 3.4 Analisis Kimia Analisis yang dilakukan pada penelitian ini dengan mengukur beberapa parameter meliputi kadar air, total gula pereduksi, pertumbuhan mikroorganisme, ph, dan konsentrasi crude etanol Kadar air ( Sari 2010) Pengkuran kadar air pada penelitian ini merupakan modifikasi dari AOAC (1984) yang diacu dalam Sari (2010) yaitu sampel sebanyak 2 g dimasukkan dalam cawan yang telah diketahui bobotnya. Kemudian dikeringkan dalam oven bersuhu C sampai bobot konstan. Setelah itu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Bobot awal Bobot akhir Kadar Air = X 100% Bobot contoh

6 Penetapan total gula pereduksi metode DNS (Miller 1959 diacu dalam Subekti 2006) Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) membentuk senyawa yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm. Penyiapan pereaksi DNS Pereaksi DNS dibuat dengan melarutkan 10,6 g asam 3, 5-dinitrosalisilat dan 19,8 g NaOH dalam 1416 ml air. Setelah itu ditambahkan 306 g Na-K Tartrat, 7,6 g fenol yang dicairkan pada suhu 50 0 C dan 8,3 g Na-Metasulfit. Larutan ini diaduk rata, kemudian 3 ml larutannya dititrasi dengan HCL 0,1 N dengan indikator fenolftalein. Banyaknya titrasi berkisar antara 5-6 ml. Jika kurang dari itu harus ditambahkan 2 g NaOH untuk setiap ml kekurangan HCL 0,1 N. Penentuan kurva standar Kurva standar dibuat dengan mengukur nilai gula pereduksi pada glukosa dengan selang 0,2-0,5 mg/l. Kemudian nilai gula pereduksi dicari dengan metode DNS. Hasil yang didapatkan diplotkan pada grafik secara linear. Penetapan total gula pereduksi Pengujian gula pereduksi menggunakan kurva standar DNS dengan cara: 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 3 ml pereaksi DNS. Larutan tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 5 menit. Dibiarkan sampai dingin pada suhu ruang. Kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm. DNS akan menjaga kestabilan hasil hidrolisis enzim dan mengikat gula pereduksi sebagai indikator terjadinya aktivitas enzim Pertumbuhan Trichoderma viride dan Saccharomyces cereviceae Penentuan pertumbuhan sel fungi atau yeast dilakukan dengan analisis spektrofotometri dengan prinsip turbidimetri. Prinsip turbidimetri ini adalah analisis konsentrasi suatu zat berdasarkan kekeruhannya dibandingkan dengan sampel blanko yang dianggap nilai 0 absorban atau full scale transmitan atau tidak mengandung konsentrasi zat yang dianalisis (Sari 2010).

7 18 Pada penentuan konsentrasi sel fungi atau yeast, kekeruhan disebabkan oleh suspensi sel fungi atau yeast. Blanko yang digunakan adalah larutan medium yang persis sama dengan medium hidrolisis atau fermentasi yang belum digunakan sebagai medium pertumbuhan fungi atau yeast. Analisis dilakukan dengan mengambil data absorbansi dengan menggunakan spektrometer UV/VIS Perkin Elmer dengan α = 600 nm Derajat keasaman (ph) Pengukuran ph dilakukan dengan menggunakan ph meter dimana data ph selama proses fermentasi di ukur setiap 24 jam Konsentrasi etanol (Subekti 2006) Pengukuran konsentrasi etanol dilakukan dengan menggunakan Gas Chromatography (GC). Konsentrasi etanol diperoleh dari perhitungan rasio Area dimana Luas area etanol sampel dibagi dengan luas area n-propanol sampel. Kemudian hasil rasio area tersebut dibagi dengan slope hasil kurva kalibrasi etanol.