REKAYASA GENETIK Nicotiana tabacum SR1 DENGAN GEN glutathione S-transferase 12 (GST12) PURWANTI PRATIWI PURBOSARI

Transkripsi

1 REKAYASA GENETIK Nicotiana tabacum SR1 DENGAN GEN glutathione S-transferase 12 (GST12) PURWANTI PRATIWI PURBOSARI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

2

3 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum SR1 dengan Gen glutathione S-transferase 12 (GST12) adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, November 2015 Purwanti Pratiwi Purbosari NIM G

4 RINGKASAN PURWANTI PRATIWI PURBOSARI. Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum SR1 dengan Gen glutathione S-transferase 12 (GST12). Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan SUHARSONO. Glutathione S-transferase (GST) merupakan enzim antioksidan yang berperan dalam pertahanan tanaman terhadap cekaman biotik dan abiotik. Gen GST12 adalah salah satu anggota dari gen GST. Gen GST12 terlibat dalam pertahanan tanaman terhadap cekaman aluminium dan ph rendah. cdna gen GST12 dari kedelai kultivar Slamet telah berhasil diisolasi dengan ukuran 722 pb. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan vektor ekspresi gen glutathione S-transferase 12 (GST12) dan tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik. Vektor ekspresi gen GST12 telah berhasil dikonstruksi menggunakan metode gateway cloning. cdna GST12 telah berhasil diisolasi dari plasmid pgem-gst12. Hasil isolasi cdna GST12 telah berhasil disisipkan ke dalam vektor pentr TM /D-TOPO menggunakan teknik directional TOPO cloning. Vektor rekombinan pentr-gst12 telah berhasil direkombinasikan dengan vektor ekspresi pgwb502 sehingga gen GST12 tersisip ke dalam vektor ekspresi pgwb502 menjadi vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12. Verifikasi vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12 dengan PCR menggunakan primer GST12-F dan NosT-R, serta pemotongan dengan enzim restriksi HindIII dan EcoR1 mengkonfirmasi bahwa plasmid pgwb502-gst12 yang dihasilkan telah mengandung gen GST12. Vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12 di dalam bakteri E. coli DH5α telah berhasil diintroduksikan ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404 menggunakan metode triparental mating. A. tumefaciens LBA4404 yang mengandung pgwb502-gst12 telah dikonfirmasi dengan PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R. Transformasi genetik tanaman Nicotiana tabacum SR1 melalui perantara A. tumefaciens LBA4404 rekombinan yang dilakukan dengan metode ko-kultivasi menggunakan potongan daun sebagai eksplan telah menghasilkan beberapa tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik. Analisis molekuler dengan PCR menggunakan primer hpt-f and hpt-r telah mengkonfirmasi bahwa tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik mengandung gen hpt. Gen hpt terpaut dekat dengan gen GST12. Oleh karena itu, tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik yang mengandung gen hpt juga mengandung gen GST12. Analisis PCR menunjukkan bahwa gen GST12 yang terintegrasi di dalam genom tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik mengalami delesi. Kata kunci: Agrobacterium tumefaciens, gen glutathione S-transferase 12 (GST12), Nicotiana tabacum (tembakau) SR1, pgwb502, transformasi genetik

5 SUMMARY PURWANTI PRATIWI PURBOSARI. Genetic Engineering of Nicotiana tabacum SR1 with glutathione S-transferase 12 (GST12) Gene. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and SUHARSONO. Glutathione-S-transferase (GST) is an enzyme that involves in plant tolerance to oxidative stress caused by biotic and abiotic factors. GST12 gene is a member of GST gene. GST12 gene involves in plant tolerance to aluminum and low ph stresses. The cdna of GST12 containing 722 bp nucleotides from soybean cv Slamet has been isolated. The objectives of this research were to construct the expression vector of GST12 gene and the Nicotiana tabacum (tobacco) SR1 transgenic. Expression vector of GST12 gene was constructed using gateway cloning system. The cdna of GST12 was successfully isolated from pgem-gst12 plasmid by PCR. The GST12 was successfully inserted into the pentr TM /D- TOPO vector using directional TOPO cloning technique producing recombinant plasmid pentr-gst12. By recombination between pentr-gst12 and pgwb502, GST12 was successfully inserted into pgwb502 producing recombinant pgwb502-gst12 expression vector. Verification by PCR using GST12-F and NosT-R primers and digestion using restriction enzymes HindIII and EcoRI confirmed that pgwb502-gst12 contains GST12 gene. The recombinant pgwb502-gst12 in E. coli DH5α was successfully introduced into the A. tumefaciens LBA4404 using triparental mating method. A. tumefaciens LBA4404 containing recombinant pgwb502-gst12 was confirmed by colony PCR using GST12-F and NosT-R primer. The genetic transformation of Nicotiana tabacum SR1 intermediated by this recombinant A. tumefaciens by co-cultivation method using leaf disc as explants resulted transgenic Nicotiana tabacum SR1 plants. Molecular analysis by PCR using hpt-f and hpt-r primers confirmed that transgenic Nicotiana tabacum SR1 plants contain hpt gene. Since hpt gene is close linked to GST12 gene, so the transgenic Nicotiana tabacum SR1 plants contain also GST12 gene. PCR analysis showed that there is a deletion of GST12 gene integrated into the genome of transgenic Nicotiana tabacum SR1 plants. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, genetic transformation, glutathione S- transferase 12 (GST12) gene, Nicotiana tabacum (tobacco) SR1, pgwb502

6 Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7 REKAYASA GENETIK Nicotiana tabacum SR1 DENGAN GEN glutathione S-transferase 12 (GST12) PURWANTI PRATIWI PURBOSARI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biologi Tumbuhan SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

8 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA

9

10 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta ala atas segala karunia-nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2014 sampai Juli 2015 ini ialah transformasi genetik dengan judul Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum SR1 dengan Gen glutathione S-transferase 12 (GST12). Penelitian ini merupakan bagian dari kegiatan Hibah Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi DIKTI 2014 atas nama Dr Ir Utut Widyastuti, MSi dengan judul Perbaikan Genetik Tumbuhan Kedelai terhadap Cekaman Asam melalui Teknik DNA Rekombinan Gen Antioksidan glutathione S-transferase 12 (GST12) dan peroksidase (per) dengan nomor kontrak: 79/IT /L1/SPK/2014 tanggal 24 Mei Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Utut Widyastuti, MSi dan Prof Dr Ir Suharsono, DEA selaku pembimbing atas arahan dan bimbingannya selama ini. Terima kasih kepada Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA selaku penguji atas saran yang diberikan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima kasih kepada Dr Ir Miftahudin, MSi selaku ketua program studi Biologi Tumbuhan atas masukan dan arahannya. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Ibu Pepi Elvavina, Ibu Nia Dahniar dan Bapak Abdul Mulya selaku laboran dan teknisi di Laboratorium Pusat Pengembangan Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB yang telah membantu penyediaan bahan dalam penelitian ini. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak, Ibu, Iko, Risang dan segenap keluarga atas doa, semangat dan kasih sayangnya. Terima kasih penulis ucapkan kepada sahabat seperjuangan Plant Biology 2012: Mba Destik, Mba Fajri, Mba Efa, Bang Rudi dan Baso, serta segenap keluarga Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Nedherlands (BIORIN) dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST) atas kebersamaan dan semangatnya. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada sahabat dan keluarga besar Rumah Qur an IPB (RQ IPB), keluarga besar Himpunan Mahasiswa Muslim Pascasarjana (HIMMPAS) dan Forum Mahasiswa Pascasarjana (FORUM WACANA) atas doa dan dukungannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, November 2015 Purwanti Pratiwi Purbosari

11 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Tujuan Penelitian 2 Manfaat Penelitian 2 2 TINJAUAN PUSTAKA 2 3 METODE 10 Waktu dan Tempat Penelitian 10 Bahan 10 Metode 10 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 14 Konstruksi Vektor Ekspresi Gen GST12 14 Introduksi Vektor Ekspresi Rekombinan pgwb502-gst12 ke dalam Agrobacterium tumefaciens LBA Transformasi Genetik tanaman Nicotiana tabacum SR SIMPULAN DAN SARAN 20 Simpulan 20 Saran 20 DAFTAR PUSTAKA 20 RIWAYAT HIDUP 23 vi vi

12 DAFTAR TABEL 1 Tipe gen GST pada tanaman kedelai 3 DAFTAR GAMBAR 1 Fungsi seluler Glutathione S-Transferase (GST) 5 2 Integrasi dan disintegrasi fage λ ke dalam kromosom E. coli 6 3 Skema umum kloning gateway 8 4 Proses masuknya T-DNA dari A. tumefaciens ke dalam sel tanaman 9 5 Peta fisik dan situs pengklonan vektor pentr TM /D-TOPO 11 6 Peta fisik plasmid pgwb Hasil PCR cdna gen GST12 dari plasmid pgem-gst12 menggunakan primer GST12pENTER-F dan GST12-R 14 8 Hasil PCR koloni menggunakan primer M13-F dan GST12-R terhadap koloni bakteri E. coli Top10 transforman 15 9 Hasil PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R terhadap koloni bakteri E. coli DH5α transforman yang mengandung vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst Hasil pemotongan vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12 dengan enzim restriksi Hind111 dan EcoR Peta konstruksi vektor ekspresi pgwb502-gst Hasil PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R terhadap koloni bakteri A. tumefaciens LBA4404 transforman Kultur jaringan dari eksplan potongan daun N. tabacum SR1 selama transformasi genetik dengan gen GST Analisis PCR DNA genom tanaman N. tabacum SR1 menggunakan primer hpt-f dan hpt-r Analisis PCR DNA genom tanaman N. tabacum SR1 menggunakan primer aktin-f dan aktin-r, serta primer spesifik 35S-F dan NosT-R 20

13 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Glutathione S-transferase (GST) merupakan salah satu enzim antioksidan yang berperan dalam pertahanan tanaman terhadap cekaman biotik dan abiotik. GST mampu mengkatalis konjugasi antara Glutathione (GSH) dengan berbagai substrat elektrofilik. Hal ini berhubungan dengan sisi katalitik yang dimiliki GST. Pada tumbuhan, GST dapat berupa homodimer maupun heterodimer dengan masing-masing sub unit memiliki dua sisi aktif yang berdekatan, yaitu sisi pengikatan glutathione (G-site) dan sisi pengikatan substrat (H-site) (Dixon et al. 2002). Cekaman biotik dan abiotik dapat menginduksi peningkatan konsentrasi reactive oxygen species (ROS) seperti radikal superoksida (O 2 - ) dan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) (Apel dan Hirt 2002). Meskipun produksi ROS merupakan salah satu bentuk mekanisme pertahanan tanaman terhadap cekaman, akan tetapi tingginya konsentrasi ROS dapat menyebabkan kerusakan oksidatif pada lipid bilayer, DNA dan protein pada tanaman (Gill dan Tuteja 2010). Peningkatan ekspresi gen GST pada tanaman berhubungan dengan peningkatan ROS yang disebabkan oleh adanya cekaman (McGonigle et al. 2000). GST memiliki dua jalur dalam menangani cekaman oksidatif. Pertama, GST mampu mengkatalis reaksi antara GSH dengan senyawa-senyawa toksik yang terbentuk akibat tingginya konsentrasi ROS, seperti 4-hidroksialkenal dan basa propenal. Molekul-molekul yang telah berkonjugasi dengan GSH kemudian ditransfer ke dalam vakuola oleh protein pembawa untuk diproses lebih lanjut. Hal ini bertujuan untuk membatasi efek dari penghambatan produk akhir GST dan melindungi sel dari bahaya lebih lanjut akibat senyawa-senyawa yang berkonjugasi dengan GSH (Dixon et al. 1998). GST juga mampu melakukan fungsi Glutathione Peroksidase (GPX) untuk bereaksi dengan senyawa-senyawa hasil dari peroksidasi lipid secara langsung, serta mampu melindungi membran sel dari kerusakan dengan cara mereduksi H 2 O 2 (Marss 1996). Peranan GST dalam menangani cekaman H 2 O 2 dapat terlihat dari beberapa penelitian. Desikan et al. (1998) melaporkan bahwa pada kultur suspensi Arabidopsis, H 2 O 2 mampu menginduksi ekspresi gen GST. Selain itu, Polidoros et al. (1999) juga menemukan bahwa pemberian H 2 O 2 eksogenus mampu menginduksi ekspresi gen GST1 pada tanaman jagung. Pada Arabidopsis thaliana, ekspresi dari gen GST terinduksi karena adanya peningkatan konsentrasi ROS yang disebabkan oleh cekaman aluminium (Richards et al. 1998). GST juga dilaporkan terlibat dalam mekanisme detoksifikasi xenobiotik, serta perlindungan tanaman terhadap patogen dan herbisida. Pada kondisi tanpa cekaman, GST berperan dalam detoksifikasi toksin dari proses metabolisme sekunder dan transfer flavonoid dari sitosol ke vakuola dengan membentuk kompleks GST-flavonoid (Dixon et al. 2002). Analisis ekspresi gen GST12 pada tanaman kedelai kultivar Slamet yang toleran terhadap cekaman aluminium dan ph rendah menunjukkan bahwa ekspresi gen GST12 terinduksi pada 8 jam setelah perlakuan cekaman (1,6 mm Al dan ph 4,0) dengan peningkatan ekspresi sebesar 44.4%. Pada perlakuan yang sama, gen

14 2 GST8 menunjukkan hasil yang berbeda, yaitu terinduksi pada 8 jam setelah perlakuan dengan peningkatan ekspresi sebesar 4.4% dan pada 24 jam setelah perlakuan dengan peningkatan ekspresi sebesar 14.4%. Akan tetapi, pada kurun waktu 48 jam setelah perlakuan tersebut, gen GST8 tidak lagi terekspresi (Mashuda 2007). Berlainan dengan kultivar Slamet, pada tanaman kedelai kultivar Lumut yang peka terhadap cekaman aluminium dan ph rendah, gen GST12 tidak terinduksi oleh perlakuan cekaman 1,6 mm Al dan ph 4,0 (Sawitri 2007). Hasil analisis ini mengindikasikan adanya keterlibatan gen GST12 dalam pertahanan tanaman terhadap cekaman aluminium dan ph rendah. cdna GST12 dari akar tanaman kedelai kultivar Slamet telah berhasil diisolasi dan diklon ke dalam plasmid pgem-t Easy. Dari hasil pengurutan nukleotida cdna GST12 diketahui bahwa ukuran cdna GST12 adalah sebesar 722 pb dan menyandikan 237 asam amino. Hasil penelusuran daerah asam amino terkonservasi menunjukkan bahwa cdna GST12 memiliki daerah domain asam amino terkonservasi GST_N_Tau dan GST_C_Tau. cdna GST12 dari kedelai kultivar Slamet ini juga memiliki kekerabatan yang dekat dengan GST12 Glycine max (AF243367) (Jaya 2010). Ekspresi berlebih dari gen GST12 dibutuhkan sebagai langkah awal dalam analisis terhadap fungsi gen GST12. Oleh karena itu, perlu adanya suatu vektor ekspresi yang menggabungkan gen GST12 dengan promotor kuat. Daerah T-DNA dari vektor ekspresi rekombinan yang telah membawa gen GST12 selanjutnya dapat diintroduksikan ke dalam tanaman model untuk melihat ekspresi dari gen GST12 tersebut. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan vektor ekspresi gen glutathione S-transferase (GST12) dan tanaman Nicotiana tabacum (tembakau) SR1 transgenik. Manfaat Penelitian Vektor ekspresi gen glutathione S-transferase (GST12) dan tanaman Nicotiana tabacum (tembakau) SR1 transgenik yang dihasilkan dapat dimanfaatkan dalam analisis fungsi gen GST12 serta perbaikan genetik tanaman pertanian terhadap cekaman aluminium dan ph rendah. 2 TINJAUAN PUSTAKA Gen glutathione S-transferase (GST) Gen glutathione S-transferase (GST) merupakan kelompok besar gen yang menyandikan protein Glutathione S-Transferase (GST) yang aktivitas katalitiknya bergantung pada Glutathione (GSH). Dixon et al. (2002) mengelompokkan gen GST berdasarkan identitas sekuen penyusunnya menjadi lima kelompok, yaitu

15 kelas phi, tau, theta, zeta dan lamda. Kelas theta dan zeta selain terdapat pada tanaman juga terdapat pada hewan, akan tetapi kelas lainnya adalah spesifik pada tanaman. Berdasarkan analisis expressed sequenced tag (EST), terdapat keanekaragaman gen GST pada beberapa tanaman pertanian. Pada jagung dilaporkan terdapat 12 sekuen gen GST dari kelas phi, 28 sekuen dari kelas tau dan 2 sekuen dari kelas zeta. Pada kedelai teridentifikasi 4 sekuen dari kelas phi, 1 sekuen dari kelas zeta dan 20 sekuen dari kelas tau. Droog et al. (1995); Board et al. (1997); McGonigle et al. (2000) membagi gen GST pada tanaman ke dalam tiga kelompok, yaitu tipe 1, II dan III. Pengelompokan ini didasarkan pada identitas urutan asam amino dan konservasi penempatan intron-ekson, namun tidak didasarkan pada penerimaan substrat dan reaksi silang antibodi. GST tipe I mengandung 3 ekson dan 2 intron, GST tipe II mengandung 10 ekson dan 9 intron, sedangkan GST tipe III mengandung 2 ekson dan 1 intron. GST tipe I dan III memiliki kemiripan dengan kelas zeta pada mamalia, sedangkan GST tipe II mirip dengan kelas theta pada mamalia (Marrs 1996). Tabel 1 Tipe gen GST pada tanaman kedelai a 3 Tipe GST tipe I GST tipe II GST tipe III a Sumber: McGonigle et al. (2000). Nama GmGST 21 GmGST 22 GmGST 23 GmGST 24 GmGST 25 GH2/4 (Gmhsp26-A or GmGST 1) GmGST 2 GmGST 3 GST a (GmGST 4) GmGST 5 GmGST 6 GmGST 7 GmGST 8 GmGST 9 GmGST 10 GmGST 11 GmGST 12 GmGST 13 GmGST 14 GmGST 15 GmGST 16 GmGST 17 GmGST 18 GmGST 19 GmGST 20 No. Aksesi NCBI AF AF AF AF AF J03197, M20363 Y10820 X68819 AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF AF243375

16 4 McGonigle et al. (2000) telah melakukan pensejajaran dan klasifikasi sekuen lengkap GST pada jagung dan kedelai. Pada jagung ditemukan 42 jenis GST, yaitu 12 GST tipe I, 2 GST tipe II dan 28 GST tipe III. Pada kedelai ditemukan 25 jenis GST yang terdiri dari 4 GST tipe I, 1 GST tipe II dan 20 GST tipe III. Tabel 1 menyajikan jenis GST yang ditemukan pada tanaman kedelai. Namun fungsi gen GST tidak berhubungan dengan klasifikasi yang didasarkan pada kemiripan sekuen dan tidak bisa diprediksi dari struktur dasarnya, melainkan ditetapkan berdasarkan eksperimen (McGonigle et al. 2000). Karakteristik dan Fungsi Seluler Protein Glutathione S-Transferase (GST) Glutathione S-Transferase (GST) merupakan protein dimer dengan masa molekul dari masing-masing sub-unit berkisar antara kda. Titik isoelektrik dari protein ini yaitu pada ph 4-5. Subunit dari kelas GST yang sama dapat mengalami dimerisasi meskipun sekuen asam amino yang dimiliki sangat berbeda. Akan tetapi, sub-unit dari kelas GST yang berbeda tidak dapat mengalami dimerisasi karena faktor inkompatibilitas residu interfasial. Dari penelitian yang dilakukan pada jagung diketahui bahwa isoenzim GST diekspresikan pada jaringan yang berbeda (Goria et al. 1993). Namun, GST terdapat pada setiap tahapan perkembangan tanaman (mulai dari embriogenesis sampai senesens) dan pada setiap jaringan tanaman yang diuji (McGonigle et al. 2000). Pada sebagian besar tanaman pertanian sereal, GST dapat diekspresikan sangat tinggi, yaitu mencapai 2% dari total protein pada dedaunan (Dixon et al. 2002). GST mampu mengkatalis konjugasi antara Glutathione (GSH) dengan berbagai substrat elektrofilik (Marrs 1996) dengan reaksi umum sebagai berikut: GSH + R-X GS-R + HX (Glutathione) (Molekul (Molekul (Produk samping) elektrofilik) terkonjugasi) (Dixon et al. 1998) Beberapa fungsi seluler yang sudah diketahui dari GST di antaranya pada metabolisme sekunder GST mampu mendetoksifikasi toksin dengan mengkatalis konjugasi antara toksin dengan GSH. Beberapa GST dari kelas phi dan tau berperan dalam transport pigmen flavonoid dari sitosol ke vakuola. GST juga mampu mereduksi DNA sitotoksik dan hidroperoksida lipid seperti yang dilakukan oleh Glutathione peroksidase. Selain itu, GST juga berperan dalam perlindungan lebih lanjut tanaman dari kematian sel yang diinduksi oleh bax. Pada sinyal tanaman terhadap cekaman, GST berfungsi dalam menginduksi kalkon sintase setelah tanaman terpapar sinar ultraviolet. Sedangkan pada metabolisme primer, GST bertindak dalam isomerasi maleilasetoasetat (Gambar 1) (Dixon et al. 2002).

17 5 Gambar 1 Fungsi seluler Glutathione S-Transferase (GST) (Dixon et al. 2002) Reactive Oxygen Species (ROS) dan Penanganannya oleh Glutathione S- Transferase (GST) Organisme aerobik akan selalu memproduksi molekul-molekul reactive oxygen species (ROS) seperti radikal superoksida, radikal hidroksil dan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) selama proses konsumsi oksigen. Pada keadaan normal, pertahanan dari antioksidan seperti dismutase superoksida (SOD), katalase, peroksidase dan asam askorbat mampu mengimbangi produksi senyawa-senyawa ROS. Namun selama terjadi cekaman oksidatif, keseimbangan antara produksi ROS dengan peredaman dari antioksidan tidak lagi seimbang. Salah satu efek berbahaya dari tingginya produksi ROS adalah terjadinya peroksidasi lipid membran yang merubah asam lemak menjadi fragmen hidrokarbon seperti 4- hidroksialkenal yang sangat toksik. Senyawa ini dapat menjadi inhibitor yang kuat bagi enzim seperti adenilat siklase dalam sintesis DNA dan protein. Akibat lain dari adanya produksi senyawa ROS adalah terbentuknya basa propenal, produk dari kerusakan oksidatif DNA yang sangat toksik (Marrs 1996). GST mampu mengkatalis reaksi antara GSH dengan senyawa-senyawa toksik yang terbentuk akibat tingginya konsentrasi ROS, seperti 4-hidroksialkenal dan basa propenal. Selain itu, GST juga dilaporkan mampu melakukan fungsi

18 6 Glutathione Peroksidase (GPX) untuk bereaksi dengan senyawa-senyawa hasil dari peroksidasi lipid secara langsung dan untuk mereduksi H 2 O 2 (Marss 1996). Pada kultur suspensi Arabidopsis, H 2 O 2 diketahui menginduksi ekspresi gen GST (Desikan et al. 1998). H 2 O 2 eksogenus juga mampu menginduksi ekspresi gen GST1 pada tanaman jagung hasil persemaian (Polidoros et al. 2005). Metode Kloning Gateway Pada era 1990-an, sangat berkembang teknik konstruksi vektor biner menggunakan bantuan enzim restriksi dan ligase. Pada teknik ini, vektor dan DNA yang akan diklon harus dipotong pada tempat-tempat tertentu menggunakan enzim restriksi, selanjutnya vektor dan insert linier digabungkan dengan bantuan enzim ligase. Namun kenyataannya teknik tersebut membutuhkan waktu yang lama dan pekerjaan laboratorium yang panjang. Untuk mengkonstruksi gen yang dimodifikasi di dalam vektor biner harus dicari situs restriksi yang sesuai antara vektor dengan DNA. Situs restriksi yang sesuai tersebut sering kali terdapat dalam jumlah yang terbatas. Kekurangan tersebut membuat teknik ini sulit menghasilkan keluaran yang tinggi. Namun saat ini telah berkembang suatu teknik yang dapat digunakan untuk mengkonstruksi dan memodifikasi vektor biner dengan lebih efisien, yaitu metode kloning gateway yang dikeluarkan oleh Invitrogen (USA) (Nakagawa et al. 2009). Teknologi kloning gateway merupakan bentuk aplikasi dari reaksi rekombinasi situs spesifik yang terjadi selama intergrasi fage λ ke dalam maupun keluar dari DNA E. coli (Gambar 2). Saat proses integrasi, situs attp (242 pb) dari Gambar 2 Integrasi dan disintegrasi fage λ ke dalam kromosom E. coli (Nakagawa et al. 2009)

19 fage λ dan situs attb (25 pb) dari E. coli berekombinasi menyebabkan genom fage λ terintegrasi ke dalam genom E. coli. Sebagai hasil, genom fage λ terapit oleh situs attl (100 pb) dan attr (168 pb) (BP reaction). Pada reaksi kebalikannya, DNA fage λ keluar dari genom E. coli dengan jalan rekombinasi antara situs attl dan attr (LR reaction). Proses BP reaction membutuhkan dua protein, yaitu protein integrase fage (Int) dan protein E. coli integration host factor (IHF). Pada sistem gateway, campuran dari kedua protein ini disebut BP clonase. Sedangkan pada LR reaction, dibutuhkan protein Int, IHF dan satu jenis protein lainnya, yaitu protein excisionase (Xis). Campuran dari ketiga jenis protein ini disebut LR clonase. Metode gateway cloning memanfaatkan situs att dan clonase ini untuk dapat mengkonstruksi plasmid rekombinan secara in vitro (Hartley et al. 2000; Walhout et al. 2000). Terdapat empat pasang situs att yang dapat dimodifikasi untuk tujuan kloning secara langsung dari sistem gateway. Keempat situs att tersebut adalah attb1 dan attb2, attp1 dan attp2, attl1 dan attl2, serta attr1 dan attr2. Reaksi rekombinasi hanya dapat terjadi antara situs attb1 dengan attp1, attb2 dengan attp2, attl1 dengan attr1 dan antara situs attl2 dengan attr2 (Hartley et al. 2000; Walhout et al. 2000). Pada situs att ini juga terdapat gen ccdb sebagai penanda seleksi dan pemelihara vektor gateway karena protein ccdb mampu menghambat DNA girase. Situs att1 biasanya berlokasi pada ujung 5 dari daerah opening reading frame (ORF), sedangkan situs att2 pada ujung 3. Orientasi ini tetap dipertahankan pada semua tahapan reaksi gateway. Pada kloning gateway secara umum, sekuen attb1 dan attb2 ditambahkan pada ujung 5 dan 3 dari daerah ORF menggunakan adapter PCR sebagai langkah pertama. Produk dari langkah tersebut (attb1-orf-attb2) digunakan dalam BP reaction bersama dengan vektor donor yang memiliki kaset attp1-ccdb-attp2. Karena keberadaan marker seleksi negatif ccdb yang semula terletak diantara attp1 dan attp2 maka hanya bakteri transforman yang mengandung vektor rekombinan dengan kaset attl1-orf-attl2 (entry clone) yang dapat tumbuh pada media seleksi. Bakteri yang mengandung gen ccdb akan segera mati karena protein CcdB bersifat letal untuk kebanyakan strain bakteri E. coli. Selanjutnya ORF dalam entry clone dapat segera ditransfer ke dalam destination vector melalui reaksi LR. Destination vector ini membawa kaset attr1-ccdb-attr2. Setelah rekombinasi, hanya bakteri yang membawa destination vector rekombinan dengan kaset attb1-orf-attb2 (expression clone) yang mampu bertahan dari seleksi. Sedangkan bakteri yang membawa gen ccdb akan mati. Di dalam gateway cloning, situs attb (25 pb) yang merupakan situs att terpendek didesain agar terdapat pada produk akhir yang berupa expression clone. Hal ini bertujuan untuk meminimalisasi panjangnya sambungan kloning setelah reaksi klonase (Gambar 3). Banyak pengembangan yang telah dilakukan pada destination vector untuk memenuhi beberapa tujuan yang berbeda, misalnya vektor untuk ekspresi pada tumbuhan, hewan, bakteria dan mamalia, maupun vektor untuk RNAi (Nakagawa et al. 2009). 7

20 8 Gambar 3 Skema umum kloning gateway (Nakagawa et al. 2009) Transformasi Genetik Diperantarai Agrobacterium tumefaciens Transformasi yang diperantarai A. tumefaciens merupakan teknik yang umum digunakan untuk menyisipkan gen yang diinginkan ke dalam genom tanaman. Di alam, A. tumefaciens merupakan agen penyebab penyakit tumor (crown gall) pada banyak spesies tanaman. Penyakit tumor ini menggambarkan sebuah manifestasi dari transfer dan ekspresi DNA bakteri di dalam sel tanaman (Dandekar dan Fisk 2004). Pemindahan DNA (T-DNA) pada A. tumefaciens di alam membawa gen oncogene dan opine-catabolism yang ketika diekspresikan di dalam sel tanaman akan menyebabkan pertumbuhan neoplastik dari jaringan tanaman transforman, serta menyebabkan produksi opin yang merupakan turunan asam amino yang digunakan oleh bakteri sebagai sumber nitrogen. Strain Agrobacterium rekombinan di mana T-DNA yang dimiliki telah diganti dengan gen yang diinginkan merupakan sarana yang paling efisien saat ini untuk mengintroduksikan gen asing ke dalam genom tanaman dan untuk memproduksi spesies tanaman transgenik (Tzfira dan Citovsky 2006). Perlengkapan molekuler yang dibutuhkan dalam penyisipan T-DNA ke dalam sel tanaman terdiri dari beberapa protein yang disandi oleh seperangkat kromosomal bakteri (chv) dan gen Ti-plasmid virulence (vir). Selain itu, berbagai protein yang dimiliki oleh sel host juga dilaporkan ikut berperan dalam proses

21 transformasi genetik tersebut. Daerah vir yang terdapat pada plasmid Ti menyandi sebagian besar protein Vir yang digunakan oleh bakteri untuk menyiapkan T- DNA dan memindahkannya ke dalam sel tanaman. Pada Agrobacterium yang sudah tidak berbahaya, di mana daerah T-DNA asli yang dimiliki telah dihilangkan dari plasmid Ti, daerah T-DNA rekombinannya biasanya berada pada plasmid biner yang terpisah dari Ti plasmid (Tzfira dan Citovsky 2006). Gambar 4 menunjukkan tahapan yang terjadi ketika proses transformasi. Proses transformasi tersebut dimulai dengan penempelan bakteri pada tanaman (Gambar 4, tahap 1), diikuti induksi dari ekspresi daerah gen vir oleh sinyal spesifik dari sel tanaman (Gambar 4, tahap 2 dan 3). Molekul T-DNA utas tunggal (T-strand) (Gambar 4, tahap 4) kemudian dihasilkan dari aksi kombinasi protein VirD1 dan VirD2. Di dalam sel bakteri, satu molekul VirD2 berikatan kovalen dengan utas tunggal T-DNA pada bagian ujung 5 membentuk kompleks proteinssdna. Kompleks ini bersama protein Vir yang lain ditransfer ke dalam sel tanaman (Gambar 4, tahap 5) oleh sistem sekresi VirB/D4 tipe IV. Tahapan ini membutuhkan interaksi T-pilus bakteri dengan sedikitnya satu protein spesifik dari sel tanaman. Di dalam sitoplasma sel tanaman, T-DNA diproses lebih lanjut menjadi komplek T matang (T-complex) di mana seluruh bagian molekul T-strand diliputi oleh banyak molekul VirE2. Molekul VirE2 ini memberikan struktur dan proteksi yang dibutuhkan T-DNA saat ditransfer ke dalam nukleus sel tanaman. Tahapan selanjutnya adalah pengangkutan di dalam sitoplasma (Gambar 4, tahap 6), pengangkutan melewati membran nukleus (Gambar 4, tahap 7), pengangkutan di dalam nukleus (Gambar 4, tahap 8), pelepasan mantel berupa molekul VirE2 dari T-DNA (Gambar 4, tahap 9) dan integrasi (Gambar 4, tahap 10) (Tzfira dan Citovsky 2006). 9 Sinyal tanaman sitoplasma nukleus Daerah vir Reseptor bakteri dan tanaman Kompleks-T Immature belum T-complex matang Saluran VirB/D4T4SS Kompleks-T matang T-DNA terintegrasi Agrobacterium k Sel tanaman Gambar 4 Proses masuknya T-DNA dari A. tumefaciens ke dalam sel tanaman (Tzfira dan Citovsky 2006)

22 10 3 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan dari bulan Maret 2014 hingga Juli 2015 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-the Netherland (BIORIN) dan Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor. Bahan cdna GST12 diperoleh dari plasmid pgem-gst12 dalam bakteri E. coli DH5α (Jaya 2010). Plasmid pentrtm/d-topo dan pgwb502 (Invitrogen, USA) masing-masing berfungsi sebagai entry vector dan destination vector dalam metode gateway. Bakteri E. coli Top10 dan E. coli DH5α digunakan untuk memperbanyak vektor rekombinan. Plasmid helper prk2013 dalam bakteri E. coli DH1 berperan dalam introduksi vektor rekombinan pgwb502-gst12 dari bakteri E. coli DH5α ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404. Bakteri A. tumefaciens LBA4404 digunakan dalam proses introduksi gen GST12 ke dalam genom tanaman N. tabacum (tembakau) SR1. Potongan daun N. tabacum SR1 yang diambil dari kultur jaringan digunakan sebagai sumber eksplan. Metode Amplifikasi cdna gen GST12 cdna gen GST12 diperoleh dengan cara mengamplifikasi plasmid pgemgst12 (Jaya 2010) dengan PCR menggunakan pasangan primer GST12pENTERdan GST12-R (5 F (5 -CACCATGGTGAAGGCTGTGGT-3 ) ACTAGTATATATCATTCTGTGGCAGAAG-3 ). Primer forward GST12pENTER-F didesain dengan menambahkan sekuen CACC pada ujung 5. Komposisi reaksi PCR yang digunakan adalah 40 ng template plasmid pgemgst12, 10 pmol primer forward pentr-gst12f, 10 pmol primer reverse GST12R, 2 mm dntp mix, 5X High Fidelity PCR Buffer (Invitrogen, USA), 1 U Taq DNA High Fidelity Polymerase (Invitrogen, USA) dan ddh2o hingga volume reaksi mencapai 50 µl. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan kondisi prapcr 94⁰C, 5 menit; denaturasi 94⁰C, 1 menit; penempelan primer 55⁰C, 30 detik; pemanjangan 72⁰C, 1 menit; pasca PCR 72⁰C, 7 menit dan pendinginan 25⁰C, 10 menit. Produk hasil PCR dielektroforesis untuk mengetahui konsentrasinya. Purifikasi terhadap produk hasil PCR dilakukan dengan cara elusi dari gel agarosa mengikuti prosedur kit elusi dari Geneaid. Penyisipan cdna gen GST12 ke dalam vektor pentrtm/d-topo Hasil purifikasi cdna gen GST12 diligasikan dengan vektor pentrtm/dtopo (Invitrogen, USA) pada daerah situs pengklonan vektor tersebut (Gambar 5). Proses ligasi dilakukan dengan teknik Directional TOPO Cloning sesuai protokol manual dari Invitrogen. Komposisi dari reaksi tersebut adalah 1 μl (15

23 ng) cdna GST12, 1 μl (1.2 M NaCl dan 0.06 M MgCl 2 ) salt solution, 1 μl (15-20 ng) TOPO vector dan 3 μl ddh 2 O. Setelah inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang, hasil ligasi diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli Top10 kompeten menggunakan metode heat shock (Sambrook et al. 1989). Bakteri E. coli transforman ditumbuhkan pada media seleksi Luria Bertani (LB) padat yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/l. Verifikasi terhadap koloni yang tumbuh dilakukan dengan PCR koloni menggunakan primer M13-F (5 - GTAAAACGACGGCCAG-3 ) dan GST12-R (5 -ACTAGTATATATCATTC TGTGGCAGAAG-3 ). Kondisi PCR yang digunakan sama dengan kondisi PCR saat amplifikasi cdna gen GST12. Koloni yang positif membawa plasmid pentr-gst12 disubkultur selama jam dalam media LB cair yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/l. Plasmid dari bakteri tersebut diisolasi menggunakan Geneaid Plasmid Minipreps Kit. 11 Gambar 5 Peta fisik dan situs pengklonan vektor pentr TM /D-TOPO (Invitrogen, USA) Penyisipan cdna gen GST12 ke dalam vektor ekspresi pgwb502 Penyisipan cdna gen GST12 ke dalam vektor ekspresi pgwb502 (Gambar 6) dilakukan dengan bantuan enzim LR clonase. Vektor rekombinan pentr- GST12 direaksikan dengan vektor ekspresi pgwb502 sesuai protokol gateway cloning (Invitrogen, USA). Komposisi dari reaksi tersebut adalah 2 μl (300 ng) vektor pgwb502, 2 μl (300 ng) vektor rekombinan pentr-gst12, 1 μl 5X LR Clonase reaction buffer dan 1 µl TE Buffer. Hasil reaksi diintroduksikan ke

24 12 dalam E. coli DH5α kompeten kemudian bakteri tersebut ditumbuhkan pada media LB padat yang mengandung spektinomisin 50 mg/l. Koloni yang tumbuh diverifikasi menggunakan PCR koloni dengan primer GST12-F (TCTAGACCATAGCAATGGCAGAGCAAG-3 ) dan NosT-R (5 CTCATAAATAACGTCATGCATTAC-3 ). Komposisi reaksi PCR tersebut adalah 3 μl DNA template, 5 μl Dream Taq Green Master Mix PCR (Thermo scientific), 10 pmol primer forward GST12-F, 10 pmol primer reverse NosT-R dan ddh2o sampai volume reaksi mencapai 10 μl. Sebagai langkah verifikasi berikutnya, plasmid pgwb502-gst12 dari koloni E. coli DH5α transforman diisolasi menggunakan Geneid Plasmid Minipreps Kit. Plasmid tersebut kemudian dipotong menggunakan enzim restriksi HindIII dan EcoRI. Gambar 6 Peta fisik plasmid pgwb502 Introduksi vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12 ke dalam bakteri Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Introduksi vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12 dari bakteri E. coli DH5α ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404 dilakukan menggunakan metode triparental mating (Anggraito 2012) dengan bantuan plasmid helper prk2013. Koloni bakteri E. coli DH5α yang positif membawa pgwb502-gst12 ditumbuhkan pada 5 ml media LB cair yang mengandung 50 mg/l spektinomisin selama jam pada suhu 37⁰C dengan penggoyangan 220 rpm. Bakteri E. coli DH1 yang membawa plasmid prk2013 ditumbuhkan pada 5 ml media LB cair yang mengandung 50 mg/l kanamisin selama jam pada suhu 37⁰C dengan penggoyangan 220 rpm. Bakteri A. tumefaciens LBA4404 ditumbuhkan pada 5 ml media LB cair yang mengandung 50 mg/l spektinomisin selama dua hari dalam ruangan gelap pada suhu 28⁰C dengan penggoyangan pada kecepatan 220 rpm. Dari ketiga kultur bakteri di atas, masing-masing diambil 20 μl dan dicampurkan di atas media LB padat tanpa antibiotik untuk selanjutnya diinkubasi selama dua hari dalam kondisi gelap, suhu 28⁰C. Koloni bakteri yang tumbuh diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dilarutkan ke dalam 500 μl LB cair. Dari larutan bakteri tersebut, diambil sebanyak 5 μl dan ditambahkan ke dalam 495 μl LB cair. 80 μl hasil pengenceran bakteri disebar di atas media LB padat yang mengandung 50 mg/l spektinomisin dan 50 mg/l streptomisin. PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R dilakukan untuk verifikasi bakteri A. tumefaciens LBA4404 yang membawa pgwb502-gst12. Persiapan eksplan tanaman Nicotiana tabacum SR1 Sterilisasi permukaan biji N. tabacum SR1 dilakukan dengan mencelupkan biji di dalam larutan alkohol 70%, disertai penggoyangan menggunakan tangan selama 5 menit. Biji dicuci menggunakan air steril kemudian direndam di dalam

25 13 larutan pemutih-disinfektan bayclin (NaClO 5, 25%) 20% dengan penggoyangan selama 10 menit. Pembilasan dilakukan menggunakan air steril sebanyak enam kali. Biji kemudian ditanam pada media Murashige dan Skoog (MS0) yang mengandung garam MS, vitamin MS, 30 g/l sukrosa dan 3 g/l agar di dalam ruangan bersuhu 26-27⁰C. Tanaman yang tumbuh yang telah berumur 1 bulan disubkultur ke media yang baru. Transformasi genetik tanaman Nicotiana tabacum SR1 Daun N. tabacum SR1 hasil perbanyakan in vitro yang berumur 8 minggu dipotong dengan ukuran 1 x 1 cm. Potongan daun tersebut direndam dalam suspensi A. tumefaciens yang membawa vektor rekombinan pgwb502-gst12 (OD ) selama 15 menit untuk proses ko-kultivasi dengan penggoyangan 100 rpm pada suhu ruang. Eksplan dikeringkan menggunakan kertas tissue steril dan ditanam pada media kokultivasi padat (MS 4.33 g/l + vitamin MS + sukrosa 30 g/l + BA 0.5 mg/l + IAA 0.1 mg/l + agar gelrite 2.8 g/l + 40 mg/l asetosiringon) selama 3 hari di ruang gelap. Setelah proses kokultivasi, eksplan dicuci menggunakan air steril sebanyak tiga kali kemudian dilanjutkan dengan air steril yang sudah ditambah antibiotik cefotaxime 200 mg/l selama 10 menit. Eksplan kembali dikeringkan menggunakan kertas tissue steril kemudian ditanam dalam media induksi tunas (MS 4.33 g/l + vitamin MS + BA 2 mg/l + IAA 0.5 mg/l + cefotaksim 100 mg/l + sukrosa 30 g/l+ agar gelrite 2.8 g/l) selama 1012 hari. Kalus transgenik selanjutnya diseleksi dengan cara dipindahkan ke media regenerasi tunas yang sekaligus berfungsi sebagai media seleksi yang mengandung 30 mg/l antibiotik higromisin. Setelah hari, tunas yang kuat dipindahkan ke media MS0 (MS 4.33 g/l + vitamin MS + sukrosa 30 g/l + agar gelrite 2.8 g/l) hingga terbentuk akar. Identifikasi tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik Identifikasi tanaman N. tabacum SR1 transgenik dilakukan dengan PCR terhadap DNA genom yang diisolasi dari daun N. tabacum SR1. Isolasi DNA genom dilakukan dengan metode CTAB (Sambrook et al. 1989). 0.1 g sampel daun N. tabacum SR1 digerus menggunakan 300 μl buffer CTAB 2% (20 g/l CTAB, 100 ml 1 M Tris ph 7.5, 20 ml 0.5 M EDTA ph 8, 140 ml 5 M NaCl). Sebanyak 1,2 μl β-mercapto etanol 0.2% ditambahkan ke dalam hasil gerusan dan diinkubasi pada suhu 65⁰C selama 30 menit. Hasil inkubasi ditambahkan dengan 300 μl larutan CI (chloroform:isopropanol; 24:1) dan disentrifugasi selama 10 menit pada suhu ruang dengan kecepatan rpm. Supernatan yang dihasilkan ditambahkan dengan 600 μl larutan PCI (phenol:chloroform:isopropanol; 25:24:1) dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 10 menit pada suhu 25⁰C. Supernatan diambil dan ditambah dengan etanol absolut sebanyak 2 kali volume dan sodium asetat ph 5.4 sebanyak 0.1 kali volume. Larutan tersebut diinkubasi selama 12 jam pada suhu -20⁰C. Hasil pengendapan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan rpm pada suhu 4⁰C. Pelet ditambahkan dengan etanol 70% sebanyak 500 μl dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 5 menit pada suhu 4⁰C. Pelet yang terbentuk dikeringkan dengan vacuum dryer selama menit kemudian dilarutkan dalam 20 μl ddh2o steril dan ditambah dengan 4 μl RNAse 1 mg/l. Inkubasi untuk aktivasi RNAse dilakukan pada suhu 37⁰C selama 10 menit,

26 14 dilanjutkan inaktivasi RNAse dengan cara inkubasi pada suhu 70⁰C selama 10 menit. PCR dilakukan terhadap hasil isolasi genom tersebut. Primer yang digunakan adalah aktin-f (5 -CCTCTTAACCCGAAGGCTAA) dan aktin-r (5 GAAGGTTGGAAAAGGACTTC)-3, hpt-f (5 -GATGGTTGGCGACCTCGTA TT-3 ) dan hpt-r (5 -ACTATCGGCGACTACTTCTACA-3 ), serta 35SF (5 AAACCTCCTCGGATTCCATT-3 ) dan NostR. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Konstruksi Vektor Ekspresi Gen GST12 Tahapan dalam mengkonstruksi vektor ekspresi gen GST12 meliputi tiga langkah utama yang saling berurutan, yaitu isolasi cdna GST12, penyisipan cdna GST12 ke dalam entry vector pentrtm/d-topo, dilanjutkan dengan penyisipan cdna GST12 ke dalam destination vector pgwb502. Proses penyisipan cdna gen GST12 ke dalam entry vector dan destination vector dilakukan menggunakan metode gateway. cdna gen GST12 diisolasi dari plasmid pgem-gst12 (Jaya 2010) melalui PCR menggunakan pasangan primer spesifik GST12pENTER-F dan GST12-R. Ujung 5 dari primer forward GST12pENTER-F didesain dengan menambahkan sekuen CACC dengan tujuan agar cdna gen GST12 dapat tersisip pada situs pengklonan vektor pentrtm/d-topo dengan orientasi yang benar. Fragmen hasil PCR ini berujung tumpul (blunt end). Ukuran fragmen yang dihasilkan dari proses PCR tersebut adalah sekitar 722 pb (Gambar 7). Ukuran ini sesuai dengan ukuran cdna gen GST12. Purifikasi dilakukan terhadap fragmen hasil PCR dengan cara elusi dari gel agarosa. M 750pb pb 750 Gambar 7 1 GST12 GST12 (722 pb) Hasil PCR cdna gen GST12 dari plasmid pgem-gst12 menggunakan primer GST12pENTER-F dan GST12-R. M: marka 1 kb, 1: GST12 Hasil purifikasi cdna gen GST12 telah disisipkan ke dalam vektor pentrtm/d-topo menggunakan prosedur directional TOPO cloning (Invitrogen, USA). Bagian overhang berupa sekuen GTGG dari vektor pentrtm/d-topo menginvasi dan berpasangan dengan sekuen CACC pada ujung 5 dari cdna gen GST12. Proses ini melibatkan enzim topoisomerase I yang memutus ikatan fosfodiester pada salah satu utas DNA (bagian GTGG) dari cdna gen GST12. Akibatnya, sekuen GTGG dari cdna gen GST12 dapat

27 15 dihilangkan dan posisinya digantikan oleh sekuen GTGG dari vektor pentrtm/d-topo. Adanya penempelan yang spesifik ini meminimalisasi kemungkinan terjadinya kesalahan orientasi dalam penyisipan fragmen cdna gen GST12 ke dalam vektor pentrtm/d-topo. Efisiensi penyisipan insert ke dalam vektor dengan orientasi yang benar melalui metode ini dapat mencapai 90% atau lebih (Invitrogen, USA). Vektor rekombinan yang dihasilkan (pentr-gst12) juga telah diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli Top10 kompeten. Vektor pentrtm/dtopo memiliki gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin. Bakteri yang tumbuh pada media seleksi yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/l diduga merupakan bakteri E. coli Top10 yang membawa vektor rekombinan pentr-gst12. Verifikasi lebih lanjut dilakukan terhadap koloni yang tumbuh menggunakan PCR koloni dengan pasangan primer M13-F dan GST12-R. Produk PCR berukuran sekitar 856 pb (Gambar 8). Hasil tersebut menunjukkan bahwa cdna gen GST12 telah tersisip secara tepat ke dalam vektor pentrtm/dtopo. Fragmen cdna gen GST12 tersebut diapit oleh situs attl1 dan attl2 di dalam vektor pentrtm/d-topo. M 750 pb GST12 (856 pb) Gambar 8 Hasil PCR koloni menggunakan primer M13-F dan GST12-R terhadap koloni bakteri E. coli Top10 transforman. M: marka 1 kb, 1-13: koloni E. coli Top10 yang tumbuh pada media seleksi cdna GST12 yang dibawa oleh vektor pentrtm/d-topo selanjutnya disisipkan ke dalam vektor ekspresi pgwb502. Proses ini melibatkan enzim LR clonase mix (Invitrogen, USA) yang membantu terjadinya rekombinasi situs spesifik antara kedua vektor tersebut. Situs attl1 dari vektor rekombinan pentrgst12 berekombinasi dengan situs attr1 dari vektor ekspresi pgwb502, sedangkan situs attl2 dari vektor rekombinan pentr-gst12 berekombinasi dengan situs attr2 dari vektor ekspresi pgwb502. Reaksi rekombinasi tersebut menyebabkan cdna gen GST12 dapat berpindah dari vektor pentrtm/dtopo ke dalam vektor ekspresi pgwb502. Sementara itu, gen ccdb yang dibawa oleh pgwb502 akan berpindah menggantikan posisi cdna gen GST12 pada pentrtm/d-topo. Gen ccdb berfungsi sebagai penanda seleksi negatif yang memproduksi protein toksin yang akan bersifat letal pada kebanyakan strain E. coli seperti TOP10 dan DH5α (Traore dan Zhao 2011). Protein CcdB akan menghambat kerja DNA girase pada E. coli (Bernard dan Couturier 1992) sehingga DNA girase tidak akan mampu menghilangkan ketegangan pada struktur superheliks positif akibat kerja helikase (Yusuf 2001). Sistem ini memudahkan proses seleksi bakteri bukan target karena sel bakteri yang terintroduksi dengan unreacted vector pgwb502 (pgwb502 yang tidak mengalami rekombinasi) tidak akan mampu melakukan replikasi DNA, begitu pula dengan sel bakteri yang

28 16 membawa molekul produk samping berupa vektor pentr TM /D-TOPO yang telah mengandung gen ccdb. Sedangkan sel E. coli yang membawa vektor ekspresi rekombinan akan mampu melakukan replikasi DNA dan memperbanyak diri. Vektor ekspresi rekombinan yang dihasilkan disebut vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12. Vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12 juga telah diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli DH5α kompeten. Koloni bakteri yang tumbuh pada media seleksi LB padat yang mengandung antibiotik spektinomisin 50 mg/l diverifikasi menggunakan PCR koloni dengan primer GST12-F dan NosT-R. Pita DNA yang dihasilkan dari PCR koloni tersebut berukuran sekitar 972 pb (Gambar 9). Hal ini menunjukkan bahwa cdna gen GST12 telah tersisip secara tepat ke dalam vektor ekspresi pgwb502. Verifikasi lebih lanjut juga telah berhasil dilakukan, yaitu dengan cara memotong vektor ekspresi pgwb502-gst12 hasil isolasi dari E. coli DH5α transforman menggunakan enzim restriksi HindIII dan EcoRI sehingga menghasilkan dua fragmen dengan ukuran pb dan pb (Gambar 10). M pb GST12 (972 pb) Gambar 9 Hasil PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R terhadap koloni bakteri E. coli DH5α transforman yang mengandung vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12. M: marka 1 kb, 1-2: koloni E. coli transforman M pb pgwb pb GST12 (1.065 pb) Gambar 10 Hasil pemotongan vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12 dengan enzim restriksi Hind111 dan EcoR1. M: marka 1 kb, 1: kontrol pgwb502-gst12 tidak dipotong, 2: pgwb502-gst12 dipotong dengan enzim HindIII dan EcoRI Gambar 11 menampilkan peta konstruksi vektor ekspresi gen GST12 pada daerah T-DNA. Gen GST12 berada di bawah kendali promoter kuat 35S CaMV, sedangkan gen hygromycin phosphotransferase (hpt) yang bertanggungjawab atas ketahanan terhadap antibiotik higromisin berperan sebagai penanda seleksi.

29 pb Gambar 11 Peta konstruksi vektor ekspresi pgwb502-gst12. RB: right border, P35S CaMV: promotor 35S CaMV, GST12: gen GST12, TNos: terminator nopaline synthase, hpt: gen hygromycin phosphotransferase, PNos: promotor nopaline synthase, LB: left border Metode gateway cloning ini telah banyak digunakan dalam pembuatan vektor ekspresi. Tidak hanya untuk tanaman, beberapa penelitian telah berhasil mengaplikasikannya untuk jenis organisme lain. Toews et al. (2004) mendesain vektor ekspresi untuk fungi dan mengintroduksikannya pada Aspergillus nidulans. Deplancke et al. (2004) mendesain vektor ekspresi untuk yeast, sedangkan Nyabi et al. (2009) berhasil membuat vektor ekpsresi dan mengintroduksikannya pada kultur sel stem embrionik tikus. Introduksi Vektor Ekspresi Rekombinan pgwb502-gst12 ke dalam Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12 dalam bakteri E. coli DH5α telah berhasil diintroduksikan ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404 melalui metode triparental mating (TPM). Metode ini memungkinkan terjadinya proses konjugasi antara kedua strain bakteri tersebut dengan bantuan plasmid helper prk2013 yang dibawa oleh bakteri E. coli DH1. Koloni bakteri yang tumbuh pada media seleksi LB padat yang mengandung 50 mg/l antibiotik spektinomisin dan 50 mg/l streptomisin diduga merupakan bakteri A. tumefaciens LBA4404 yang membawa vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12. Verifikasi terhadap koloni yang tumbuh dilakukan menggunakan PCR koloni dengan primer GST12-F dan NosT-R. Pita DNA hasil PCR koloni dengan ukuran sekitar 972 pb (Gambar 12) menunjukkan bahwa vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12 telah berhasil diintroduksikan ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404. M K pb GST12 (972 pb) Gambar 12 Hasil PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R terhadap koloni bakteri A. tumefaciens LBA4404 transforman. M: marka 1 kb, K+: kontrol positif (plasmid pgwb-gst12), 1-3: koloni A. tumefaciens transforman

30 18 Transformasi Genetik Tanaman Nicotiana tabacum SR1 Transformasi genetik tanaman N. tabacum SR1 dengan gen GST12 dilakukan dengan bantuan bakteri A. tumefaciens LBA4404 yang membawa vektor ekspresi rekombinan pgwb502-gst12. Potongan daun N. tabacum SR1 direndam dalam suspensi A. tumefaciens LBA4404 rekombinan sebagai langkah kokultivasi. Seleksi tanaman transgenik dilakukan dengan menumbuhkan eksplan pada media regenerasi tunas yang mengandung 30 mg/l higromisin. Pada selang waktu tiga sampai empat minggu setelah transformasi, eksplan yang dikokultivasi mulai menghasilkan tunas yang tumbuh di sekitar daerah bekas pelukaan. Daerah bekas pelukaan tersebut sebelumnya terlihat menebal. Eksplan kontrol berupa potongan daun N. tabacum SR1 yang tidak dikokultivasi dalam suspensi A. tumefaciens LBA4404 rekombinan terlihat mulai berwarna kecoklatan kemudian memucat setelah tiga sampai empat minggu ditanam di media seleksi. Tunas dari eksplan transforman yang sudah beregenerasi dan terlihat kuat disubkultur ke media baru untuk pengakaran (Gambar 13). Pada vektor ekspresi pgwb502-gst12 yang digunakan dalam transformasi genetik N. tabacum SR1 ini, posisi gen hpt berada dekat dengan gen GST12 sehingga kedua gen tersebut akan dintegrasikan ke dalam genom tanaman secara bersama. Oleh karena itu, tanaman transgenik yang resisten terhadap antibiotik higromisin juga mengandung gen GST12 yang terintegrasi di dalam genomnya. 1 cm 1 cm 1 cm (a) (b) (c) 1 cm 1 cm (d) (e) Gambar 13 Kultur jaringan dari eksplan potongan daun N. tabacum SR1 selama transformasi genetik dengan gen GST12. (a) Eksplan yang tidak ditransformasi terlihat berwarna kecoklatan kemudian memucat pada media seleksi yang mengandung 30 mg/l higromisin, (b) Eksplan yang ditransformasi bertahan pada media seleksi yang mengandung 30 mg/l higromisin, (c) tunas mulai terbentuk dan muncul pada daerah sekitar bekas pelukaan, (d) Tunas yang semakin membesar dan beregenerasi, (e) Tunas yang telah berakar berkembang menjadi tanaman yang lengkap dan disebut sebagai tanaman transgenik putatif

31 Verifikasi lebih lanjut terhadap tanaman N. tabacum SR1 transgenik yang tahan terhadap higromisin dilakukan dengan PCR menggunakan pasangan primer hpt-f dan hpt-r serta 35S-F dan NosT-R. Pita produk PCR terhadap gen hpt (Gambar 14) dengan ukuran sekitar 600 pb menunjukkan bahwa gen hpt telah tersisip ke dalam genom tanaman N. tabacum SR1 transgenik. M NT bp hpt (600 pb) Gambar 14 Analisis PCR DNA genom tanaman N. tabacum SR1 menggunakan primer hpt-f dan hpt-r. M: marka 1 kb+, NT: N. tabacum SR1 non transgenik, 1-3: tanaman transforman Pita produk PCR menggunakan primer 35S-F dan NosT-R yang terlihat setelah elektroforesis (Gambar 15) juga mengindikasikan bahwa gen GST12 telah terintroduksi ke dalam genom tanaman N. tabacum SR1 transgenik, tetapi ukuran pita hasil PCR dari genom tanaman N. tabacum SR1 (1000 pb) transgenik lebih pendek dari pada ukuran pita hasil PCR terhadap kontrol plasmid pgwb502- GST12 (1300 pb). Hal ini kemungkinan terjadi karena adanya delesi pada bagian gen GST12 tersebut. Penyebab delesi yang dialami oleh gen GST12 belum diketahui mekanismenya. Salah satu kemungkinan yang dapat menjadi faktor penyebabnya adalah akibat adanya enzim DNA nuklease yang memotong bagian gen yang tidak terlindungi oleh molekul protein VirE2 saat proses transfer T-DNA dari sel bakteri menuju ke sel tanaman. NT M K+ NT bp PCR primer aktin-f dan aktin-r 1300 pb 1000 pb PCR primer 35S-F dan NosT-R Gambar 15 Analisis PCR DNA genom tanaman N. tabacum SR1 menggunakan primer aktin-f dan aktin-r, serta primer spesifik 35S-F dan NosT- R. NT: N. tabacum SR1 non transgenik, 1-4: N. tabacum SR1 transgenik, M: marka 1 kb+, K+: kontrol plasmid pgwb502- GST12, 5-6: N. tabacum SR1 transgenik, 7: N. tabacum SR1 nontransgenik, 8: N. tabacum SR1 transgenik Menurut Zambryski (1992), T-DNA yang ditransfer dari sel bakteri ke dalam sel tanaman harus melintasi beberapa bagian, yaitu membran sel bakteri,dinding sel bakteri, dinding sel tanaman, serta membran sel dan inti sel