SOFHIANI DEWI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI PEPTIDA GURIH DAN SENYAWA BERNITROGEN SERTA KARAKTERISASI SENSORI SENYAWA BERNITROGEN YANG BERKONTRIBUSI TERHADAP RASA GURIH EKSTRAK IKAN ASIN JAMBAL ROTI SOFHIANI DEWI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2005

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Identifikasi Peptida Gurih dan Senyawa Bernitrogen serta Karakterisasi Sensori Senyawa Bernitrogen yang Berkontribusi terhadap Rasa Gurih Ekstrak Ikan Asin Jambal Roti adalah karya saya sendiri dibawah bimbingan Dr. Ir. Anton Apriyantono, M.S dan Dr. Ir. Feri Kusnandar M.Sc. Tesis ini belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, November 2005 Sofhiani Dewi NRP F

3 ABSTRAK SOFHIANI DEWI. Identifikasi Peptida Gurih dan Senyawa Bernitrogen serta Karakterisasi Sensori Senyawa Bernitrogen yang Berkontribusi terhadap Rasa Gurih Ekstrak Ikan Asin Jambal Roti. Dibimbing oleh ANTON APRIYANTONO dan FERI KUSNANDAR. Ekstrak air ikan asin jambal roti yang mengandung peptida berberat molekul rendah (dibawah 1000 Da) hasil ultrafiltrasi dengan MWCO 1000 Da, telah difraksinasi dengan Sephadex G-10 dan menghasilkan 5 fraksi ekstrak ikan asin jambal roti yang mempunyai rasa gurih, khususnya fraksi 1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jenis peptida serta peranan senyawa-senyawa bernitrogen yang terdapat pada masing-masing fraksi terhadap pembentukan rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti. Identifikasi peptida dilakukan menggunakan LC-MS/MS terhadap Fraksi 1, 3, 4 dan 5. Fraksi 2 tidak dianalisa karena merupakan fraksi garam. Sebelum identifikasi dengan LC-MS/MS, Fraksi 1 difraksinasi menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) dengan fase diam C-18 sehingga menghasilkan 9 fraksi (Fraksi Tidak Tertahan (FTT), F-A, F-B, F-C, F-D, F-E, F-G, dan F-H) yang berbeda tingkat kepolarannya. Fraksi 2, 3, 4 dan 5 langsung dianalisa. Identifikasi senyawa bernitrogen dilakukan menggunakan Capillary Electrophoresis (CE) terhadap kelima fraksi. Pada senyawa yang teridentifikasi dilakukan karakterisasi sensori oleh orang panelis terlatih menggunakan uji skoring rasa gurih dan asin dengan skala Pengujian dilakukan menggunakan omission test terhadap 3 model dasar yaitu (1) larutan MSG 4 mm, (2) larutan NaCl 80 mm dan (3) campuran MSG 4 mm dan NaCl 80 mm. Identifikasi LC-MS/MS menunjukkan bahwa pada Fraksi 1 terdapat peptida yang mengandung L-Glutamat (Glu) dan L-Aspartat (Asp) yaitu peptida yang terdapat pada FTT (BM Da) dan F-A (BM Da). Peptida lainnya adalah peptida yang hanya mengandung Glu yaitu pada Fraksi 1 [ F-B (BM 465.1), F-E (BM 364.0) dan F-G (BM 365.0)], Fraksi 3 (BM dan 378.5) dan Fraksi 5 (BM 377.9). Peptida-peptida ini diduga berkontribusi terhadap pembentukan rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti. Berdasarkan hasil CE, Fraksi 1 mengandung L-Histidin (His) dan dipeptida anserin/karnosin. Pada Fraksi 2 terdapat kreatinin dan L-Fenilalanin (Phe), sedangkan pada Fraksi 4 terdapat L-Tirosin (Tyr), Phe dan kreatinin. Adapun Fraksi 5 mengandung Phe dan L-Triptofan (Trp). Hasil uji sensori menunjukkan bahwa campuran kreatinin, Phe dan Tyr pada konsentrasi di bawah nilai threshold-nya (1.5 mm) berpengaruh terhadap peningkatan rasa gurih campuran MSG dan NaCl. Kreatinin berperan terhadap peningkatan rasa gurih campuran MSG, Tyr dan Phe. Sedangkan Phe berpengaruh terhadap peningkatan rasa gurih campuran NaCl, Tyr, kreatinin dan campuran MSG, NaCl, Tyr, kreatinin. Campuran Phe (1 mm) dan Trp (1 mm) tidak berpengaruh terhadap rasa gurih dan asin larutan MSG, NaCl dan campurannya. Dapat disimpulkan bahwa rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti dipengaruhi oleh senyawa bernitrogen seperti kreatinin, Phe dan Tyr pada konsentrasi di bawah nilai thresholdnya. Adanya peptida yang mengandung glutamat dan asparat pada Fraksi 1, diduga turut berperan terhadap pembentukan rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti.

4 IDENTIFIKASI PEPTIDA GURIH DAN SENYAWA BERNITROGEN SERTA KARAKTERISASI SENSORI SENYAWA BERNITROGEN YANG BERKONTRIBUSI TERHADAP RASA GURIH EKSTRAK IKAN ASIN JAMBAL ROTI SOFHIANI DEWI Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pangan SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2005

5 Judul Tesis Nama NRP : Identifikasi Peptida Gurih dan Senyawa Bernitrogen serta Karakterisasi Sensori Senyawa Bernitrogen yang Berkontribusi terhadap Rasa Gurih Ekstrak Ikan Asin Jambal Roti : Sofhiani Dewi : F Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Anton Apriyantono, M.S. Ketua Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc Anggota Diketahui Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, M.S. Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc Tanggal Ujian: 14 November 2005 Tanggal Lulus:

6 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2004 ini adalah identifikasi peptida gurih, dengan judul Identifikasi Dan Karakterisasi Peptida Gurih Dari Ekstrak Ikan Asin Jambal Roti. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Anton Apriyantono, M.S. dan Bapak Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc. selaku pembimbing, serta Ibu Prof. Dr. Ir. Winiati Puji Rahayu, M.S. selaku dosen penguji yang telah banyak memberi saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Diana Hermawati, M.S. beserta staf dari Balai Pengujian Mutu Produk Peternakan atas bantuannya mengijinkan penulis menggunakan alat untuk identifikasi peptida. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami, anak-anak (Dzaky dan Nissa), mama, bapak serta seluruh keluarga tercinta, atas dukungan, doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, November 2005 Sofhiani Dewi

7 RIWAYAT HDUP Penulis dilahirkan di Cimahi pada tanggal 20 Pebruari 1976 dari ayah K. Surya Permana dan ibu Titi Sumiati. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara. Tahun 1994 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Cimahi dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN). Penulis memilih Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian dan lulus pada tahun Setelah itu, penulis bekerja sebagai Penanggung Jawab Praktikum pada Program Studi Supervisor Jaminan Mutu Pangan (D3), Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pangan IPB hingga tahun Pada 2002, penulis melanjutkan studi di Sekolah Pascasarjana pada Program Studi Ilmu Pangan dengan biaya sendiri. Penulis telah menikah dengan seorang pria bernama Herdianto pada tahun 1999 dan dikaruniai 2 orang putra yaitu Muhammad Sajid Dzaky (5 tahun) dan Syarifah Syahmina Khairunnisa (2,5 tahun).

8 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... v DAFTAR GAMBAR... vii DAFTAR LAMPIRAN... xii PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA... 4 Peptida Pemberi Rasa Gurih... 4 Sumber Peptida Pemberi Rasa Gurih... 6 Teknik Isolasi Peptida... 8 Identifikasi Peptida BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Metode PEMBAHASAN Identifikasi Peptida Karakterisasi Sensori (Omission Test) SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 80

9 DAFTAR TABEL Halaman 1 Peptida-peptida yang mempunyai rasa gurih pada ph Sistem pengacakan sampel pada uji segitiga rasa asam-pahit dan asin-gurih Jenis dan konsentrasi larutan sampel untuk uji rangking pada pelatihan panelis Senyawa-senyawa yang teridentifikasi dari ekstrak ikan asin jambal roti dengan menggunakan CE Ion-ion yang terbentuk sebagai dasar penentuan dugaan kandungan asam amino peptida yang diduga mempunyai rasa gurih Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada FTT Fraksi 1 ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi A Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi B Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi C Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi D Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi E Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi F Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan

10 Halaman 13 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi G Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi H Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi 3 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi 4 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi 5 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan

11 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Skema isolasi peptida pemberi rasa gurih Skema komponen-komponen utama pada sistem Capillary Electrophoresis Skema proses ionisasi elektrospray Pola fragmentasi peptida (Harrison et al. 2000) Cara isolasi peptida dari fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti menggunakan teknik Solid Phase Extraction (SPE) Electropherogram senyawa standar secara berurutan : kreatinin, karnosin, anserin, arginin, histidin, SI, kreatinin, kreatin, triptofan, metionin, fenilalanin, tirosine dan hipoksantin Electropherogram fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak : a) Spektrum UV peak pada waktu retensi menit, b) menit,c) menit Electropherogram fraksi 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak: a) spektrum UV pada waktu retensi menit, b) menit, c) menit Electropherogram fraksi 3 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak : a) spektrum UV pada peak dengan waktu retensi menit, b) menit, c) menit, d) menit dan d) menit Electropherogram fraksi 4 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak, a: spektrum UV peak dengan waktu retensi menit, b) menit dan c) menit Electropherogram fraksi 5 ekstrak ikan asin jambal roti goreng yang telah difraksinasi menggunakan kromatografi gel, Sephadex G 10 dan spektrum UV masing-masing peak, a) spektrum UV peak dengan waktu retensi menit dan b) menit... 30

12 Halaman 12 Kromatogram FTT hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1ikan asin jambal roti goreng (14 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram FTT hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (16.3 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (23.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (7.8 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi B hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (16.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi B hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (8 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram F-C hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (0 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi C hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (1.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit... 44

13 Halaman 20 Kromatogram Fraksi D hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (2.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi D hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (8 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi E hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (7.5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi E hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1ml/menit Kromatogram Fraksi F hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (7 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi F hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (3 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi G hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (1 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi G hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (6 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit 52

14 Halaman 28 Kromatogram Fraksi H hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi H hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi 3 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (2 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi 3 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (6.2 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi 4 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi 4 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Kromatogram Fraksi 5 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng (4.1 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1ml/menit Kromatogram Fraksi 5 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng (5 mg/ml) menggunakan kolom C8, elusi gradien 2% ACN yang mengandung 0.1% asam format hingga 50% ACN yang mengandung 0.1% asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 ml/menit Pengaruh penambahan histidin (His) 1 mm terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG, NaCl dan campuran MSG dan NaCl, oleh 10 panelis terlatih. Skor:

15 37 Halaman Pengaruh penambahan kreatinin (crn) 1.5 mm dan fenilalanin (phe) 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG (4 mm), NaCl (80 mm) dan campuran keduanya, oleh 10 panelis terlatih dengan skor Pengaruh penghilangan L-Phe pada campuran kreatinin (crn) 1.5 mm dan L-Phe 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG (4 mm), NaCl (80 mm) dan campuran keduanya, oleh 10 panelis terlatih. Skor: Pengaruh penambahan kreatinin (crn) terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG, NaCl dan campuran MSG dan NaCl, oleh 10 panelis terlatih. Skor: Pengaruh penambahan kreatinin (crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG, NaCl dan campuran MSG dan NaCl, oleh 10 panelis terlatih. Skor: Pengaruh penghilangan tirosin (tyr) terhadap skor rasa gurih dan asin dari campuran MSG, NaCl, kreatinin (crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm, oleh 10 panelis terlatih. Skor: Pengaruh penghilangan fenilalanin terhadap skor rasa gurih dan asin dari campuran MSG, NaCl, kreatinin (crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm, oleh 10 panelis terlatih. Skor enghilangan fenilalanin (phe) dan tirosin (tyr) terhadap skor rasa gurih dan asin dari campuran MSG, NaCl, kreatinin (crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm, oleh 10 panelis terlatih. Skor: penghilangan kreatinin (crn) terhadap skor rasa gurih dan asin dari campuran MSG, NaCl, kreatinin (crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm, oleh 10 panelis terlatih. Skor: Pengaruh penambahan fenilalanin (phe) dan triptofan (trp) terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG, NaCl, dan campuran MSG dan NaCl, oleh 10 panelis terlatih. Skor: Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) 1 mm terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG 4 mm, NaCl 80 mm, dan triptofan (trp) 1 mm, oleh 10 panelis terlatih. Skor: Pengaruh penambahan triptofan (trp) 1 mm terhadap skor rasa gurih dan asin dari MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran MSG,NaCl, oleh 11 panelis terlatih. Skor:

16 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Format isian uji rasa dasar Format isian uji segitiga rasa asam-pahit Format isian uji segitiga rasa asin-gurih Format isian uji rangking rasa asin/gurih Format isian uji skoring/pengujian sampel untuk rasa gurih dan asin 84 6 Hasil seleksi panelis untuk uji rasa dasar Hasil seleksi panelis untuk uji segitiga rasa Hasil pelatihan panelis yang telh lolos seleksi dengan menggunakan uji peringkat rasa asin dan rasa gurih Hasil uji skoring rasa gurih pada pelatihan panelis dengan menggunakan sampel ekstrak kecap ikan berberat molekul kurang dari 1000 Da Hasil uji skoring rasa asin pada pelatihan panelis dengan menggunakan sampel ekstrak kecap ikan berberat molekul kurang dari 1000 Da Spektrum UV senyawa-senyawa standar untuk identifikasi dengan Capillary Electrophoresis Contoh spektrum massa peptida berberat molekul Da (waktu retensi 16.1 menit) yang terdapat pada FTT Fraksi 1 ulangan 1, (a) spektrum massa pada MS1 dan (b) fragmentasi lebih lanjut (MS2) dari ion dengan m/z Contoh spektrum massa peptida berberat molekul Da (waktu retensi 26.7 menit) yang terdapat pada FTT Fraksi 1 ulangan 2 (a) spektrum massa pada MS1 dan (b) fragmentasi lebih lanjut (MS2) dari ion dengan m/z Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi Tidak Tertahan (FTT) hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)... 94

17 Halaman 15 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi Tidak Tertahan (FTT) hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Spektrum massa (pola fragmentasi pada MS1) peptida berberat molekul yang terdapat pada Fraksi Tidak Tertahan (FTT) hasil fraksinasi Fraksi 1, (a) peptida dengan waktu retensi 27.7 (ulangan 1) dan 26.7 menit(ulangan 2), (b) peptida dengan waktu retensi 44.7 (ulangan 1) dan 45.3 menit (ulangan 2) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi B hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi B hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi C hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi D hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi D hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi E hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)

18 Halaman 25 Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi E hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi F hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi G hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi G hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi H hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi H hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti goreng menggunakan SPE (Solid Phase Extraction) Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi 3 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi 4 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi 4 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi 5 ulangan 1 ekstrak ikan asin jambal roti Identifikasi berat molekul dan dugaan kandungan asam amino peptida pada Fraksi 5 ulangan 2 ekstrak ikan asin jambal roti Pengaruh penambahan Histidin (His) 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran MSG, NaCl

19 Halaman 37 Uji sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penambahan histidin 1 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran keduanya Pengaruh penambahan kreatinin (Crn) 1.5 mm dan fenilalanin (phe) 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran MSG, NaCl Uji sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penambahan kreatinin (crn) 1.5 mm dan fenilalanin (phe) 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran keduanya Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) pada campuran kreatinin (Crn) 1.5 mm dan fenilalanin (phe) 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran MSG, NaCl Uji sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm, kreatinin (crn) 1.5 mm dan fenilalanin (phe) 1.5 mm Pengaruh penambahan creatinin (Crn) 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran MSG, NaCl Uji sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penambahan creatinin 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran keduanya Pengaruh penambahan Kreatinin (Crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran MSG, NaCl Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penambahan kreatinin (crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campurannya Pengaruh penghilangan tirosin (tyr) terhadap skor rasa gurih dan asin campuran MSG 4 mm, NaCl 80 mm, kreatinin (Crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm

20 Halaman 47 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penghilangan tirosin (tyr) 1.5 mm terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm fenilalanin (phe) 1.5 mm dan creatinin 1.5 mm Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) terhadap skor rasa gurih dan asin campuran MSG (4 mm), NaCl (80 mm), kreatinin (Crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) 1.5 mm terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm, kreatinin (crn) 1.5 mm, fenialalanin (phe) dan tirosin (tyr) 1.5 mm Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) dan tirosin (tyr) terhadap skor rasa gurih dan asin campuran MSG (4 mm), NaCl (80 mm), kreatinin (Crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan creatinin 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm Pengaruh penghilangan kreatinin (crn) terhadap skor rasa gurih dan asin campuran MSG (4 mm), NaCl (80 mm), kreatinin (Crn) 1.5 mm, fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penghilangan kreatinin (crn) 1.5 mm terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80, kreatinin (crn) 1.5 mm, mm fenilalanin (phe) 1.5 mm dan tirosin (tyr) 1.5 mm Pengaruh penambahan fenilalanin (phe) 1 mm dan triptofan (trp) 1 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran MSG, NaCl Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penambahan fenilalanin (phe) 1 mm dan triptofan (trp) 1 mm terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campurannya Pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) 1 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan triptofan (trp) 1 mm

21 Halaman 57 Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penghilangan fenilalanin (phe) 1 mm terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm, triptofan (trp) 1 mm dan fenilalanin (phe) 1 mm Pengaruh penambahan triptofan (trp) 1 mm terhadap skor rasa gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campuran MSG, NaCl Analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan pengaruh penambahan triptofan (trp) 1 mm terhadap skor gurih dan asin larutan MSG 4 mm, NaCl 80 mm dan campurannya

22 PENDAHULUAN Latar Belakang Telah diketahui bahwa peptida-peptida yang mempunyai berat molekul kurang dari 1000 Da mempunyai kontribusi terhadap rasa dan flavor bahan pangan, dimana salah satunya adalah memberikan rasa umami (Yamasaki dan Maekawa, 1978). Rasa umami adalah rasa yang ditimbulkan oleh senyawa monosodium glutamate (MSG) dan 5 nukleotida seperti 5 -inosine monophosphate (IMP) dan 5 -guanosine monohosphate (GMP) (Maga, 1994). Rasa umami ini menjadi penting karena ternyata sejak lama telah dijadikan sebagai dasar dari pemilihan makanan (McBride, 1991). Dalam penelitian ini, rasa umami diasumsikan dengan rasa gurih, karena rasa gurih merupakan rasa yang paling dekat dengan umami dan merupakan rasa yang lebih dikenal oleh masyarakat Indonesia. Isolasi terhadap peptida-peptida yang berkontribusi terhadap pembentukan flavor bahan pangan, khususnya rasa gurih, masih perlu dilakukan. Hal ini dikarenakan senyawa-senyawa pemberi rasa umami yang telah dikomersialisasi secara luas baru dilakukan pada MSG diikuti oleh IMP dan GMP. Dengan adanya senyawa lain dari golongan peptida yang juga dapat berfungsi sebagai pemberi rasa gurih, diharapkan dapat dijadikan alternatif ingredient pangan selain juga menambah nilai nutritif dari makanan tersebut. Peptida-peptida yang mempunyai rasa umami pada umumnya terdapat pada bahan pangan yang mempunyai kadar protein tinggi seperti hidrolisat protein ikan (Fujimaki et al., 1973), daging sapi (Yamasaki dan Maekawa, 1978) dan kacang kedelai (Apriyantono et al., 2003 dan Lioe et al., 2003). Sedangkan peptida umami yang pertama kali berhasil diisolasi dan diidentifikasi adalah oktapeptida (Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala) yang dikenal sebagai delicious peptide atau Beefy Meaty Peptide (BMP) yang berasal dari kaldu daging sapi (Yamasaki dan Maekawa, 1978). Sumber-sumber pangan lainnya yang diduga mempunyai potensi mengandung peptida gurih adalah produk pengolahan hasil perikanan seperti ikan

23 asin jambal roti, ikan peda putih dan kecap ikan (Saleha, 2003). Produk-produk ini disukai oleh masyarakat di Indonesia karena rasanya gurih. Hasil fraksinasi menggunakan Sephadex G-10 dari ekstrak air ikan asin jambal roti dan kecap ikan berberat molekul kurang dari 1000 Da menghasilkan fraksi-fraksi yang mempunyai rasa gurih (Priliandari 2004 dan Rahmawaty 2004) berberat molekulrasa gurih pada produk-produk tersebut salah satunya diduga berasal dari peptida yang merupakan hasil hidrolisis protein secara enzimatis pada saat fermentasi. Tujuan Tujuan penelitian ini secara umum adalah melakukan isolasi, identifikasi dan karakterisasi peptida gurih dari ekstrak larut air ikan asin jambal roti. Sedangkan secara khusus, penelitian ini bertujuan untuk : 1. Mendapatkan fraksi peptida dari Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti berberat molekul kurang dari 1000 Da yang telah difraksinasi dengan kromatografi gel (Sephadex G-10). 2. Mendapatkan identitas peptida dan asam amino yang terdapat pada fraksifraksi ikan asin jambal roti dengan menggunakan Capillary Electrophoresis (CE) dan Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LC-MS). 3. Mendapatkan karakterisasi sensori asam amino dan peptida yang teridentifikasi terhadap pembentukan rasa gurih dan asin dengan menggunakan teknik ommision test. Hipotesa Pada fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Da diduga terdapat peptida yang mempunyai rasa gurih pada ikan asin jambal roti. Peptida-peptida tersebut bersama komponen-komponen lain yang ada dalam fraksi seperti asam amino bebas, garam, gula, asam organik, nukleotida, mineral dan ion-ion klorida dan fosfat, diduga saling berinteraksi dalam memberikan rasa gurih.

24 Manfaat Penelitian Penelitian mengenai peptida yang mempunyai rasa gurih akan sangat bermanfaat terhadap pengembangan bahan tambahan pangan, khususnya bahan penambah rasa gurih. Selain itu, hasil penelitian ini akan memperkaya pengetahuan, khususnya pada bidang flavor, mengenai bagaimana peranan komponen-komponen berberat molekul rendah yang larut air terhadap pembentukan karakteristik rasa gurih ekstrak ikan asin jambal roti.

25 TINJAUAN PUSTAKA Peptida Pemberi Rasa Gurih Pada umumnya, peptida yang mempunyai rasa gurih mengandung asam amino glutamat (Glu) dan aspartat (Asp) seperti terlihat pada Tabel 1. Adanya residu asam amino asam ini sangat penting untuk menghasilkan rasa dari peptidapeptida yang ada dalam bahan pangan (Tamura et al. 1989). Akan tetapi, bukan berarti rasa gurih dari suatu peptida hanya ditentukan oleh kedua jenis asam amino tersebut. Asam amino yang bersifat hidrofilik seperti serin (Ser), threonin (Thr), glisin (Gly) dan glutamin (Gln) apabila diikat melalui ikatan peptida bersama dengan asam amino glutamat dan aspartat, juga menghasilkan rasa gurih (Noguchi et al 1975). Rasa gurih dari suatu peptida juga dipengaruhi oleh urutan asam amino penyusunnya dan jenis garam yang ditambahkan untuk mencapai ph 6 (Nakata et al, 1995). Di-peptida Asp-Glu mempunyai rasa gurih dengan nilai threshold 3.32 mm, sedangkan di-peptida Glu-Asp mempunyai rasa asin dengan nilai threshold 1.74 mm. Tamura et al. (1989) menemukan bahwa posisi Asp dan Glu dalam garam sodium peptida asam merupakan faktor yang sangat penting untuk menghasilkan rasa gurih. Contohnya adalah garam sodium dipeptida Asp-Glu.2 Na menghasilkan rasa gurih yang lebih kuat dibandingkan Glu-Asp.2Na. Selain itu, ia juga menduga bahwa suatu peptida yang menghasilkan rasa gurih dan asin memiliki kation dan anion yang berdekatan. Selain di- dan tripeptida sintetik yang mempunyai rasa gurih, juga terdapat oktapeptida yang berhasil diisolasi dari kaldu daging sapi oleh Yamasaki dan Maekawa (1978) yang mempunyai rasa gurih. Urutan asam amino penyusun oktapeptida ini adalah H-Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala-OH yang sering disebut sebagai delicious peptide atau beefy meaty peptide (BMP). Rasa gurih yang dihasilkan oleh oktapeptida ini disebabkan oleh interaksi antara fragmen basa (Lys-Gly) dan fragmen asam (Asp-Glu-Glu) (Tamura et al dan Nakata et al. 1995). Selain berpengaruh terhadap rasa, kedua fragmen ini juga berpengaruh terhadap intensitas rasa yang dihasilkan. Timbulnya rasa gurih ini

26 Tabel 1 Peptida-peptida yang mempunyai rasa gurih pada ph 6 Peptida ph a Na + b Nilai threshold (mm) Asp-Glu* Glu-Glu* Asp-Asp-Glu* Asp-Glu-Asp* Asp-Glu-Glu* Glu-Glu-Asp* Glu-Glu-Glu* Asp-Glu-Ser** c Glu-Ser** c Thr-Glu** c Glu-Gly-Ser** c Ser-Glu-Glu** c Glu-Gln-Glu** c Asp-Asp*** Glu-Asp*** Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala**** a ph pada saat sebelum ditambahkan NaOH b jumlah ion sodium (mol) yang ditambahkan hingga mencapai ph 6 (mm) c satuannya : mg% * sumber: Nakata et al. (1995) ** sumber: Noguchi et al. (1975) *** sumber: Kuramitsu et al. (1996) **** sumber: Yamasaki dan Maekawa (1978) diduga dihasilkan oleh lokalisasi kation pada fragmen basa dan anion pada fragmen asam (Nakata et al. 1995). Faktor lainnya yang berperan dalam pembentukan rasa gurih suatu peptida adalah ph larutan dan jenis garam yang ditambahkan. Rasa gurih dari BMP mempunyai intensitas tertinggi pada ph 6.5, kemudian menurun pada ph 9.5. Sedangkan pada ph asam (3.5) tidak menghasilkan rasa gurih (Wang et al. 1996). Adapun jenis garam yang dapat menimbulkan suatu peptida mempunyai rasa gurih adalah garam sodium (Nakata et al. 1995). Kuramitsu et al. (1996) menemukan bahwa penambahan garam Na pada larutan dipeptida Asp-Asp, Asp- Glu, Glu-Asp dan Glu-Glu hingga ph larutan menjadi 6.0 akan menghasilkan rasa gurih/asin, sedangkan jika ph larutan menjadi 5.0 atau 7.0, rasa gurih/asin akan hilang.

27 Sumber Peptida Pemberi Rasa Gurih Seperti disebutkan di atas, peptida yang mempunyai rasa gurih, pertama kali diisolasi dari kaldu daging sapi oleh Yamasaki dan Maekawa (1978). Berawal dari penemuan ini, banyak dilakukan penelitian mengenai keberadaan peptida gurih pada bahan pangan yang mempunyai rasa gurih seperti hidrolisat protein ikan, keju dan moromi dari kacang kedelai. Konsentrat Protein Ikan Pada tahun 1973, Fujimaki et al. melakukan hidrolisis konsentrat protein ikan dengan menggunakan enzim pronase dan kemudian difraksinasi untuk mengetahui hubungan antara distribusi berat molekul dengan sifat organoleptik hidrolisat protein ikan. Senyawa yang bertanggung jawab terhadap rasa gurih hidrolisat protein ikan adalah peptida asam yang memiliki residu asam amino hidrofilik, dimana peptida ini mempunyai berat molekul di bawah 1000 dalton. Keju Keju merupakan bahan pangan yang disukai oleh kebanyakan orang, karena rasanya yang gurih dan mempunyai mouthfeel yang enak. Pengujian terhadap kandungan dan kontribusi peptida yang terdapat pada fraksi larut air terhadap flavor berbagai jenis keju telah dilakukan, yaitu keju Cheddar yang difermentasi selama 9 bulan (Fernandez et al. 1998), keju yang terbuat dari susu sapi, domba dan kambing (Molina et al. 1999) dan keju Bouton de Culotte-BC dan Crottin de Chavignol-CC yang terbuat dari susu kambing (Salles et al. 2000). Pada umumnya, peptida-peptida yang berperan dalam pembentukan karakteristik rasa dan flavor keju adalah peptida yang mempunyai berat molekul kurang dari 1000 Da. Akan tetapi penelitian-penelitian itu menunjukkan bahwa peptida yang terdapat dalam fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Da dan 500 Da tidak berkontribusi secara langsung terhadap pembentukan flavor keju, demikian pula terhadap rasa umami keju. Peptida yang terdapat pada keju berperan secara sinergis dengan mineral untuk menurunkan rasa pahit (Engel et al. 2000).

28 Kacang Kedelai Sumber peptida gurih lainnya adalah kacang kedelai. Protein kacang kedelai dapat langsung dihidrolisis baik secara enzimatik, hidrolisis dengan asam ataupun dengan cara hidrolisis enzimatik yang direaksikan dengan glukosa melalui pemanasan menghasilkan Hydrolyzed Vegetable Protein (HVP) yang mempunyai rasa gurih (Aaslyng et al. 1998). Selain itu, peptida gurih dapat diambil dari fermentasi kacang kedelai dalam bentuk moromi yang merupakan salah satu tahap dalam pembuatan kecap, dimana penelitian mengenai hal ini telah dilakukan oleh Apriyantono et al. (2003). Mereka menemukan bahwa peptida yang berkontribusi terhadap rasa gurih kecap adalah peptida berberat molekul kurang dari 500 Da yang dihasilkan dari proses ultrafiltrasi ekstrak moromi. Selanjutnya Lioe et al. (2003) melakukan fraksinasi fraksi yang mengandung peptida kurang dari 500 Da dengan kromatografi filtrasi gel dan menghasilkan 4 fraksi. Dari keempat fraksi yang diuji, fraksi ke 2 mengandung asam glutamat dalam jumlah yang paling besar (15.48%), akan tetapi kandungan asam glutamat bebasnya hanya 1.43% (b/b). Hal ini menunjukkan bahwa asam glutamat yang ada didalam fraksi 2 berada terikat dalam suatu peptida yang menghasilkan rasa gurih. Produk Olahan Ikan Tradisional Hasil olahan produk-produk perikanan secara tradisional seperti ikan asin, ikan peda dan kecap ikan dikenal sebagai produk yang mempunyai cita rasa yang khas khususnya untuk rasa asin dan gurihnya. Berdasarkan hasil penelitian Saleha (2004) terhadap berbagai jenis ikan asin, ikan peda dan kecap ikan, diketahui bahwa ekstrak ikan asin jambal roti goreng, ekstrak ikan peda putih goreng dan ekstrak kecap ikan cap ikan merah, merupakan produk-produk yang mempunyai rasa gurih tertinggi. Penelitian selanjutnya menemukan bahwa fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Da mempunyai rasa gurih tertinggi daripada fraksifraksi berberat molekul lebih dari 1000 Da. Hal ini menunjukkan bahwa

29 senyawa-senyawa yang berperan terhadap rasa gurih ketiga ekstrak adalah senyawa-senyawa berberat molekul kurang dari 1000 Da. Keberadaan peptida yang mempunyai rasa gurih pada ekstrak ikan asin jambal roti goreng (Rahmawaty 2004) dan ekstrak kecap ikan cap ikan merah (Priliandari 2004) diketahui setelah dilakukan fraksinasi lebih lanjut menggunakan kromatografi gel dengan kolom Sephadex G 10. Penggunaan kolom ini dapat menghasilkan 5 fraksi peptida yang terpisah dengan garamnya, dimana pada umumnya garam terdapat pada fraksi 2. Dugaan adanya peptida yang mempunyai rasa gurih pada ketiga ekstrak adalah tingginya skor rasa gurih pada fraksi 1. Fraksi 1 ini tidak mengandung garam dan mempunyai proporsi asam glutamat bebas per total asam glutamat yang kecil, sehingga diduga asam glutamat terikat dalam bentuk peptida yang memberikan rasa gurih. Teknik Isolasi Peptida Tahap-tahap yang dilakukan untuk mengisolasi peptida yang memberikan rasa gurih secara umum adalah ekstraksi, filtrasi dan fraksinasi hingga mendapatkan satu fraksi yang berpotensi mengandung peptida gurih. Setelah itu dilakukan pemurnian dengan teknik elektroforesis untuk mendapatkan senyawa tunggal (peptida gurih). Tahap akhir adalah identifikasi untuk mendapatkan struktur primer peptida gurih. Skema isolasi peptida yang mempunyai rasa gurih dapar dilihat pada Gambar 1. Ekstraksi peptida gurih cukup mudah tergantung dari bentuk bahan pangannya yaitu padatan, cairan atau campuran keduanya. Pelarut yang biasa digunakan adalah air karena peptida merupakan senyawa yang larut air. Untuk mengekstrak peptida dari bahan yang masih mengandung protein yang belum terhidrolisis seperti daging sapi, ekstraksi dilakukan dengan menggunakan air panas (Yamasaki dan Maekawa 1978). Akan tetapi bahan pangan yang telah melalui proses pengolahan yang menyebabkan proteinnya terhidrolisis menjadi peptida-peptida kecil, misalnya proses fermentasi, ekstraksi cukup dengan menggunakan air dingin seperti pada keju (Salles et al. 2000). Kacang kedelai yang telah melalui fermentasi oleh kapang dan garam yang sering disebut moromi

30 mempunyai bentuk campuran cairan dan padatan, sehingga untuk mengekstrak peptidanya cukup dengan menghomogenisasi moromi dan memerasnya hingga didapat ekstrak moromi (Apriyantono et al.2003 dan Lioe et al 2003). Senyawasenyawa lain yang ikut terekstrak seperti lemak, karbohidrat dan lain sebagainya, dapat dihilangkan dengan cara sentrifugasi. Tahap isolasi selanjutnya adalah penyaringan ekstrak larut air dengan menggunakan teknik ultrafiltrasi. Pada umumnya, ultrafiltrasi dilakukan hingga mendapatkan fraksi peptida dengan berat molekul kurang dari 1000 Da (Salles et al. 2000; Molina et al dan Mojarro-Guerra et al. 1991), akan tetapi Apriyantono et al (2003) dan Lioe et al. (2003) melakukannya hingga mendapatkan fraksi berberat molekul kurang dari 500 Da. Selain dengan menggunakan teknik ultrafiltrasi, penyaringan juga dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel dengan menggunakan kolom sephadex G- 25 (Yamasaki dan Maekawa 1978) dan sephadex G-15 (Oka dan Nagata (1974). Setelah didapat fraksi-fraksi peptida berberat molekul tertentu, dilakukan fraksinasi terhadap fraksi-fraksi dengan menggunakan teknik kromatografi. Teknik kromatografi yang umum digunakan adalah kromatografi filtrasi gel dan kromatografi pertukaran ion. Proses fraksinasi dapat dilakukan dengan menggabungkan teknik-teknik kromatografi ini, seperti Oka dan Nagata (1974) melakukan tiga kali fraksinasi dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion, dimana masing-masing menggunakan kolom yang berbeda-beda sehingga dapat memisahkan fraksi non ionik, asam, basa dan netral. Yamasaki dan Maekawa (1978) menggabungkan teknik kromatografi filtrasi gel dengan kolom sephadex G-25 dengan kromatografi pertukaran ion yang menggunakan kolom Dowex 50 x 4. Peneliti lainnya, Mojarro-Guerra et al. (1991) menggabungkan teknik kromatografi pertukaran ligan dan pertukaran ion dengan kolom aminex. Teknik lainnya yang telah digunakan adalah re-kromatografi fraksi dengan teknik kromatografi filtrasi gel (kolom Sephadex G-25) (Fernandez et al. 1998). Adanya perbedaan penggunaan teknik kromatografi yang digunakan, tergantung dari jenis-jenis peptida yang terdapat pada ekstrak.

31 Bahan pangan Ekstraksi Air panas Enzimatis Ultrafiltrasi Fraksi 1 Fraksi 2.. Fraksi n Fraksi tergurih Fraksinasi dengan kromatografi Fraksi A Fraksi B Fraksi n Fraksi tergurih Identifikasi : Elektroforesis, LC-MS, peptide sequencer untuk mendapatkan fraksi terpilih dapat dilakukan dengan beberapa teknik kromatografi Gambar 1 Skema isolasi peptida pemberi rasa gurih

32 Profil peptida yang terdapat pada fraksi berpotensi hasil fraksinasi dapat diketahui dengan menggunakan teknik elektroforesis, baik elektroforesis kertas (Yamasaki dan Maekawa, 1978 dan Oka dan Nagata, 1974) maupun Capillary Electroforesis (Lioe et al. 2003). Teknik lainnya adalah dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Mojarro-Guerra et al. 1991; Fernandez et al dan Molina et al. 1999). Tahap akhir dari isolasi peptida adalah menentukan urutan asam amino penyusun peptida tersebut yang dapat dilakukan dengan metode degradasi Edman untuk menentukan urutan N terminal dan metode Carboxypeptidase A (Cpase A) untuk menentukan urutan C-terminal terpisah (Yamasaki dan Maekawa 1978). Metode lainnya adalah gas phase isothiocyanate degradation yang merupakan modifikasi degradasi Edman (Mojarro-Guerra et al. 1991). Cara lain yang lebih mudah dan cepat adalah dengan menggunakan peptide sequencer (Wassenar et al. 1995) atau asam amino analyzer (Fernandez et al. 1998). Identifikasi Peptida Capillary Electrophoresis (CE) Peptida maupun asam amino merupakan senyawa yang dapat mengion dalam larutan, dimana jenis ion yang terbentuk sangat tergantung dari ph larutan. Sifat inilah yang menyebabkan analisis terhadap kedua senyawa ini banyak dilakukan menggunakan Capillary Electrophoresis (CE). Adapun prinsip kerjanya adalah kolom kapiler yang berisi buffer ditempatkan pada 2 bejana buffer dan dialiri medan listrik. Hal ini menyebabkan pembentukan ion-ion pada kapiler sehingga mengakibatkan perpindahan ion-ion analit yang didasarkan oleh electrophoretic mobility masing-masing komponen (Sorensen et al. 1999). Sistem peralatan pada CE dapat dilihat pada Gambar 2.

33 Gambar 2 Skema komponen-komponen utama pada sistem Capillary Electrophoresis Mode pemisahan yang dapat digunakan untuk peptida adalah Capillary Zone Electrophoresis (CZE), Capillary Isoelectric Focusing (CIF), Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC) dan Capillary Gell Electrophoresis (CGE). Akan tetapi, yang banyak digunakan adalah mode CZE karena mempunyai efisiensi yang tinggi terhadap molekul-molekul kecil, mudah diotomatisasi, memungkinkan untuk kuantifikasi secara langsung (Schoneich et al. 1993). Kolom kapiler dalam mode ini terdiri dari fused silica yang permukaannya bermuatan negatif karena terionisasinya gugus silanol (SiO - ), dimana derajat muatannya tergantung dari ph larutan dalam kapiler (Sorensen et al. 1999). Pemisahan senyawa pada CE, idealnya disebabkan oleh perbedaan mobilitas elektroforetik, dimana suatu peptida mempunyai mobilitas elektroforesis tertentu yang bersifat konstan tergantung dari muatan, viskositas larutan dan radius ion (Messana et al. 1997). Masalah utama pada peptida adalah adanya beberapa peptida dan protein yang berinteraksi kuat dengan permukaan silanolsilanol kapiler yang mengandung fused-silica. Interaksi ini menghasilkan penyimpangan bentuk peak dan ireprodusibiliti waktu elusi dan kuantifikasi. Untuk mencegahnya perlu penggunaan buffer ber-ph rendah sehingga kondisi

34 ionisasi permukaan silanol akan ditekan sehingga interaksi peptida bermuatan positif (ph<pi) akan diminimisasi (Schöneich et al. 1993). Detektor yang dapat digunakan untuk mendeteksi peptida adalah Diode Array Detector dengan menerapkan absorbansi UV/VIS sehingga didapat informasi spektral yang sangat penting dalam identifikasi dan purifikasi (Kitagishi 1997). Adanya peptida dapat dideteksi dengan menggunakan panjang gelombang 215 nm yang merupakan daerah penyerapan ikatan peptida, selain itu panjang gelombang 230 atau 254 nm juga sering digunakan (Bailey 1992). Untuk asam amino aromatik seperti L-Phe, L-Tyr dan L-Trp dapat dilakukan pendeteksian pada panjang gelombang 280 nm (Bailey 1992). Dari 20 asam amino, hanya 3 asam amino inilah yang dapat menyerap sinar UV secara nyata (Cancalon 1997). Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Liquid Chromatography tandem MS (LC-MS/MS) merupakan alat yang banyak digunakan untuk mengidentifikasi campuran beberapa peptida baik hasil sintesis maupun yang berasal dari sampel biologi. Di dalam reviewnya, Mehlis dan Kertscher (1997), memperlihatkan luasnya aplikasi LC-MS/MS untuk analisis peptida yaitu telah melebihi 100 peptida dan protein yang terdaftar pada review biannual (1994/95). Person et al. (2004) telah berhasil melakukan identifikasi dan karakterisasi peptida berberat molekul rendah (di- dan tripeptida) dari minuman anggur dengan menggunakan LC-MS/MS tanpa memerlukan persiapan sampel yang rumit yaitu hanya dengan ultrafiltrasi hingga MWCO 1000 Da. Untuk sampel peptida yang berasal dari bahan-bahan biologi yang diekstrak dengan air harus melalui tahap persiapan sampel sebelum disuntikkan ke LC-MS/MS. Hal ini disebabkan sampel hanya mengandung peptida dalam jumlah kecil sehingga perlu dilakukan pengkayaan (enrichment) yang dapat dilakukan dengan menggunakan teknik SPE (Solid Phase Extraction) (Heraiz dan Casal 1995) dan mengandung garam yang tinggi (Mehlis dan Kertscher 1997). Garam dapat mengganggu sistem MS jika terdeposit di dalamnya. Sedangkan untuk menganalisa peptida sintetis tidak memerlukan persiapan sampel karena sudah mengandung peptida murni seperti yang dilakukan oleh Petitris et al. (2002) yang menganalisis campuran 23 peptida