PENAPISAN BAKTERI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS

Transkripsi

1 1 PENAPISAN BAKTERI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Haliclona sp. DAN DETEKSI GEN PENYANDI POLIKETIDA SINTASE DAN PEPTIDA SINTASE NONRIBOSOM MEGASARI DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

2 2 PENAPISAN BAKTERI PENGHASIL SENYAWA ANTIMIKROB YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Haliclona sp. DAN DETEKSI GEN PENYANDI POLIKETIDA SINTASE DAN PEPTIDA SINTASE NONRIBOSOM MEGASARI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

3 i ABSTRAK MEGASARI. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan Spons Haliclona sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan Peptida Sintase Nonribosom. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK. Spons tergolong dalam Filum Porifera memiliki kemampuan bersimbiosis dengan mikroorganisme. Simbiosis tersebut menghasilkan produk alami yang menguntungkan seperti poliketida dan peptida nonribosom yang memiliki aktivitas antimikrob. Poliketida dan peptida nonribosom masing-masing dibentuk oleh gen Polyketide Synthase (PKS) dan Non-Ribosomal Peptide Synthase (NRPS). Keduanya merupakan enzim multifungsional yang terlibat dalam biosintesis senyawa bioaktif yang penting dalam bidang farmasi dan industri. Penelitian ini bertujuan menapis bakteri asal spons penghasil senyawa antimikrob dan mendeteksi gen yang berperan dalam biosintesis senyawa bioaktif tersebut. Sebanyak 18 isolat bakteri yang diisolasi dari spons Haliclona sp. dan diuji aktivitas antimikrobnya, didapatkan 12 isolat bakteri yang menghambat pertumbuhan empat bakteri patogen, yaitu Staphylococcus aureus, Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Pseudomonas aeruginosa, Vibrio harveyi, dua bakteri nonpatogen, yaitu Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan dua cendawan patogen, yaitu Candida albicans, dan Candida tropicalis. Deteksi gen penyandi PKS dan NRPS dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer spesifik yang masing-masing menghasilkan amplikon berukuran 700 pb dan 1000 pb. Satu isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik dan memiliki kedua gen penyandi PKS dan NRPS yaitu Iso 10 dipilih untuk analisis homologinya. Fragmen DNA dari genom Iso 10 KS (700 pb) yang telah berhasil diklon ke dalam plasmid pgemt dan disekuen, menyatakan homologinya dengan domain KS sekitar 49-51%. Keyword: senyawa bioaktif, antimikrobial, PKS, NRPS, spons ABSTRACT MEGASARI. Screening of Bacteria Producing Antimicrobial Compounds which is Associated with Haliclona sp. Sponge and Detection Its Encoding Peptide Synthase and Non-ribosomal Polyketide Synthase Gene. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and NISA RACHMANIA MUBARIK. Sponges are classified in the Porifera phylum have the ability to symbiosis with microorganisms. The symbiont produced useful natural products such as polyketides and nonribosomal peptides that possessed antimicrobial activities. Each polyketide and non-ribosomal peptide are synthesized by the Polyketide Synthase (PKS) dan Non-Ribosomal Peptide Synthase (NRPS) gene. Both of them are multifunctional enzymes that involved in the biosynthesis bioactive compounds that are important in pharmaceutical and other industries.the aims of study was to screened the bacteria producing antimicrobial compounds which is associated with sponge and detect the genes that play a role in the biosynthesis of bioactive compounds. A total of 18 isolates bacteria that associated with Haliclona sp. was tested their antimicrobial activity and finally 12 isolates bacteria that inhibited four pathogenic bacteria growth that consist of Staphylococcus aureus, Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Pseudomonas aeruginosa, Vibrio harveyi, and two non-pathogenic bacteria that consist of Bacillus subtilis, Escherichia coli, and the two pathogenic fungus Candida albicans and Candida tropicalis. Detection of PKS and NRPS encoding gene performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) using specific primers, producing 700 bp and 1000 bp amplicon. One isolate that possessed the best antimicrobial activities and both of PKS and NRPS gene which is Iso 10 are selected for homology test. DNA fragment from Iso 10 KS genome (700 bp) that have been successfully cloned into plasmid pgemt and sequenced and its homology with other KS domain sequences of about 49-51%. Keyword: bioactive compounds, antimicrobial, PKS, NRPS, sponge

4 ii Judul Nama NIM : Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan Spons Haliclona sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan Peptida Sintase Nonribosom : Megasari : G Disetujui: Pembimbing I, Pembimbing II, (Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.) (Dr.Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.) NIP NIP Diketahui: Ketua Departemen Biologi Institut Pertanian Bogor (Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.) NIP

5 iii PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus karena dengan berkat, kuasa, dan roh kudus-nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan menyusun skripsi ini. Tema penelitian ini yaitu Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antimikrob yang Berasosiasi dengan Spons Haliclona sp. dan Deteksi Gen Penyandi Poliketida Sintase dan Peptida Sintase Nonribosom. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari sampai Oktober 2010 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. dan Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing atas saran dan bimbingannya dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih disampaikan kepada Ibu Dr. Ir. Raden Roro Dyah Perwitasari, M.Sc. sebagai wakil komisi pendidikan atas saran dan diskusi yang diberikan. Terima kasih juga kepada Bang Yonathan Banoet, Mbak Rika Astuti, Mbak Ari untuk saran dan bantuannya selama penelitian di laboratorium. Selain itu, ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada teman-teman terdekat, keluarga besar laboratorium mikrobiologi FMIPA IPB, keluarga perwira 52, Komisi Literatur PMK IPB, serta teman-teman seperjuangan di Biologi 43 yang tidak dapat disebutkan satu per satu, atas segala bantuan dan semangat yang telah diberikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Mama, Papa, Robby Sutady, Angela Meliana, atas do`a, dukungan, semangat, dan segala cinta yang diberikan. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat. Bogor, November 2010 Megasari

6 iv RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Mei 1988 dari Bapak Wijaya Sutady dan Ibu Lenny. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2006 penulis lulus dari SMU TARAKANITA 1 JAKARTA dan lolos seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai anggota Unit Kegiatan Mahasiswa Persekutuan Mahasiswa Kristen Institut Pertanian Bogor (UKM PMK IPB) dan aktif sebagai anggota Komisi Literatur pada tahun serta pernah menjabat sebagai Sekretaris Komisi Literatur PMK IPB pada tahun Penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Botani Umum pada tahun Penulis melakukan Praktik Kerja Lapang di Laboratorium Iradiasi Pangan, Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Nuklir Nasional (PATIR- BATAN) dari bulan Juli sampai Agustus 2009 dengan judul Pengaruh Iradiasi pada Kandungan Gizi Nasi.

7 v DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL vii DAFTAR GAMBAR.... vii DAFTAR LAMPIRAN.... vii PENDAHULUAN Latar Belakang. 1 Tujuan... 1 Waktu dan Tempat Penelitian.. 2 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat... 2 Metode. 2 Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri Pengujian Bakteri Penghasil Senyawa Antifungi Isolasi DNA Genom 2 Amplifikasi Domain KS dan Domain A. 2 Kloning Domain KS dan Domain A ke dalam Sel E. coli DH5α Analisis Bioinformatika HASIL Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri... 3 Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antifungi Amplifikasi Domain KS dan Domain A... 5 Kloning Domain KS dan Domain A dalam Sel E. coli DH5α.. 6 Verifikasi Hasil Kloning Domain KS dan Domain A 6 Analisis Bioinformatika. 6 PEMBAHASAN 7 SIMPULAN 8 DAFTAR PUSTAKA 8 LAMPIRAN 9

8 vi DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil penapisan bakteri yang berasosiasi dengan spons yang memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi Analisis homologi sekuen Iso 10 KS terhadap sekuen domain KS asal GenBank... 7 DAFTAR GAMBAR 1 Zona bening di sekitar koloni terhadap (a) B. subtilis, (b) E. coli, ( c) P. aeruginosa, Halaman (d) EPEC. 4 2 Zona bening di sekitar koloni terhadap (a) C. albicans dan (b) C.tropicalis (b) C.tropicalis Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain KS untuk 12 isolat yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. Ket: (L) 1 Kb Ladder, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain A untuk 12 isolat yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. Ket: (L) 1 Kb Ladder, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso Koloni putih E.coli DH5α pada isolat Iso 10 yang diduga membawa plasmid rekombinan 6 6 Elektroforesis agarosa 1% dari pgemt-easy-10-ks dipotong dengan EcoRI 6 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi macam-macam media yang digunakan dalam proses penapisan bakteri yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp Bahan-bahan dan media yang digunakan dalam proses transformasi Sekuen dari Iso 10 KS (dalam bentuk FASTA) Homologi antara sekuen-sekuen domain KS dengan Iso 10 KS

9 1 Latar Belakang PENDAHULUAN Mikrob dapat berinteraksi dengan organisme laut, seperti spons, dan menghasilkan berbagai produk alami. Produk alami yang berasal dari metabolit sekunder mikrob berperan penting dalam penelitian medis dan pengembangan obat. Produk alami tersebut dapat secara lansung menjadi obat atau menjadi struktur dasar sintesis obat kimia baru (Bahkuni et al. 2005). Sejak tahun 1981, dilaporkan bahwa sekitar 40% produk kimia berasal dari turunan produk alami mikrob (Lanen & Shen 2006). Keuntungan dari produk alami sebagai senyawa bioaktif karena dapat memiliki aktivitas antimikrob, antiviral, antimalaria, antikanker, antitumor, bahkan memiliki aktivitas cytotoxic. Spons yang sudah diteliti dan menghasilkan senyawa bioaktif antara lain Jaspis sp., Stelleta tenuis, Halicondria rugosa, Dysidea avara, Craniella australiensis, dan Haliclona sp. Kennedy et all. (2008, 2009) melaporkan, pada Haliclona simulans ditemukan sekitar delapan filum bakteri. Filum yang paling banyak ditemukan ialah filum Proteobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, dan Firmicutes. Metabolit yang diisolasi dari bakteri yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp., misalnya: sterol, steroid, alkaloid, avarol, nukleosida, peptida, dan poliketida (Blunt et al. 2007). Peptida nonribosom sebagai salah satu senyawa bioaktif memiliki kemampuan untuk menjadi antibiotik hingga racun. Oleh karena itu, investigasi biosintesis peptida sangat menarik untuk pembentukan obat baru dalam bidang farmasi modern. Selain peptida nonribosom, poliketida juga memiliki peran penting dalam industri agrokimia, farmasi, dan bioteknologi (Schwarger et al. 2003, Kennedy et al. 2008). Peptida nonribosom atau poliketida masing-masing dibentuk oleh enzim besar yang multifungsional dengan kelompok situs katalitik yang terkoordinasi, yaitu Polyketide Synthase (PKS) dan Non-Ribosomal Peptide Synthase (NRPS) (Zhao et al. 2007). NRPS terdiri atas organisasi modular, yaitu serangkaian situs aktif terkoordinasi yang dapat dideteksi untuk analisis genetik bakteri yang berasosiasi dengan spons. Setiap modul terdiri atas domain minimal dan domain opsional. Domain minimal adalah domain dengan jumlah minimum yang diperlukan untuk seluruh proses sintesis peptida nonribosomal, terdiri atas domain adenylation (A), domain peptydyl carrier protein (PCP), domain condensation (C), dan domain thioesther (TE). Sedangkan domain opsional terdiri atas domain cyclization (Cy), domain methyltransferase (MT), dan domain epimerization (Er) (Shen et al. 2004). Seperti halnya NRPS, PKS juga merupakan enzim besar yang multifungsional dengan organisasi modular. Persyaratan minimal yang dibutuhkan oleh PKS ialah tiga domain, yaitu domain acyl transferase (AT), domain ketosynthase (KS), dan domain acyl carier protein (ACP) (Otsuka et al. 2004, Xiao et al. 2006, Zucko et al. 2007). Domain KS dan domain A masingmasing memiliki peran penting dalam sintesis poliketida dan peptida nonribosomal. Domain A berperan dalam tugas inti yaitu mengaktifkan dan memilih asam amino yang sama asal dari kelompok substrat bebas dalam pembentukan nonribosomal peptida (Schwarger et al. 2003, Shen et al. 2004, Zhao et al. 2007). Sedangkan Domain KS bertanggung jawab untuk kondensasi unit luar yang ditambahkan pada rantai poliketida selama biosintesis poliketida (Xiao et al. 2006, Zucko et al. 2007). Menurut Shen (2004), modifikasi NRPS dengan pengubahan substrat pada domain A akan menjadi rekayasa sintesis peptida baru. Seperti halnya domain A, keragaman struktur poliketida dapat dilakukan dengan pengubahan starter, perluasan unit, dan jumlah kondensasi pada modifikasi domain KS (Otsuka et al. 2004). Selain itu, persamaan domain KS dan domain A yaitu keduanya lebih sesuai dalam analisis filogenetik keanekaragaman PKS dan NRPS (Zhang et al. 2008, 2009). Oleh karena itu, analisis domain KS dan domain A memudahkan penelitian untuk mendeteksi gen yang berperan dalam pembentukan senyawa bioaktif yang berperan penting dalam bidang farmasi dan industri. Tujuan Penelitian ini bertujuan menapis bakteri yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. yang menghasilkan senyawa antimikrob serta mendeteksi gen yang berperan dalam biosintesis senyawa antimikrob tersebut.

10 2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret hingga Oktober 2010 di Laboratorium Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Bahan BAHAN DAN METODE Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah 16 bakteri endofit (HAL 87, Iso act 6, Iso 40, Iso 46, Iso 8, Iso 47, Iso 67, Iso 95, Iso act 1, Iso act 16, Iso act 2, Iso 53, Iso 20, Iso 23, Iso 100, dan Iso 10), dan 2 bakteri permukaan (HAA 02, HAA 06) yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. asal Pulau Wigeo, wilayah Raja Ampat, Provinsi Papua Barat (Tokasaya 2010), dua bakteri uji nonpatogen (Bacillus subtilis, Escherichia coli), empat bakteri uji patogen (Staphylococcus aureus, Vibrio harveyi, Pseudomonas aeruginosa, Enteropathogenic Escherichia coli [EPEC]), dan dua fungi uji patogen (Candida albicans, Candida tropicalis). Metode Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri. Teknik lapis ganda (bilayer) digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri. Teknik ini dilakukan dengan cara mengkulturkan bakteri uji, baik yang patogen (S. aureus, V. harveyi, P. aeruginosa, EPEC) maupun nonpatogen (B. subtilis dan E. coli) pada media sea water complete (SWC) cair (Lampiran 1), kemudian diinkubasi selama 18 jam. Kultur cair bakteri uji diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml media agar-agar SWC steril. Campuran antara kultur bakteri dan media SWC dijadikan sebagai lapisan kedua. Selanjutnya, sebanyak 15 ml campuran dituangkan ke dalam cawan petri yang telah berisi dengan media agar-agar SWC yang telah padat (lapisan pertama). Setelah padat, 18 isolat bakteri asal spons masing-masing digoreskan pada permukaan media SWC yang telah mengandung kultur bakteri uji, kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37 0 C. Senyawa bioaktif antibakteri diindikasikan dengan terbentuknya zona jernih di sekitar koloni. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antifungi. Metode yang dilakukan sama dengan pengujian antibakteri yaitu dengan teknik lapis ganda. Kultur cair Candida yang telah diinkubasi selama 24 jam dalam potato dextrose broth (PDB), diambil sebanyak 1ml kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml media potato dextrose agar (PDA) steril (Lampiran 1). Campuran antara kultur fungi dan media PDA dijadikan sebagai lapisan kedua. Selanjutnya, sebanyak 15 ml campuran dituangkan ke dalam cawan petri yang telah berisi dengan media PDA yang telah padat (lapisan pertama). Setelah padat, 18 isolat bakteri asal spons masing-masing digoreskan pada permukaan media PDA yang telah mengandung kultur fungi, lalu diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37 0 C. Senyawa bioaktif antifungi diindikasikan dengan terbentuknya zona jernih di sekitar koloni. Isolasi DNA Genom. DNA genom dari bakteri yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. diisolasi dengan menggunakan metode cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) yang diacu dari Sambrook dan Russel (2001). Amplifikasi Domain KS dan Domain A. Domain KS (700 pb) dan domain A (1000 pb) diamplifikasi dengan PCR. PCR diawali dengan pembuatan larutan campuran PCR. Larutan campuran PCR dibuat dengan mencampurkan berturutturut 12,5 µl bufer GC II, 4 µl dntps (2,5 mm), 0,25 µl (5 unit/µl) enzim La taq DNA Polymerase, 1 µl (50 pmol) primer spesifik (forward dan reverse) untuk masing-masing PKS dan NRPS, 3,25 µl ddh 2 O, 3 µl sampel DNA genom. Sekuen primer spesifik untuk domain KS yaitu forward: 5 - GCSATGGAYCCSCARCARCGSVT-3 ; reverse : 5 -GTSCCSG-TSCCRTGS-SCYT- CSAC-3. Sedangkan sekuen primer spesifik untuk domain A yaitu forward : 5 -AARD- SIGGIGSIGSITAYBICC-3 ; reverse : 5 - CKRWAICCICKIAIYTTIAYYTG-3. Sekuen primer yang digunakan adalah primer yang dirancang khusus untuk gen PKS dan NRPS. Primer tersebut diacu dari Schirmer et al. (2005). Reaksi PCR untuk kedua pasang primer dilakukan sebanyak 35 siklus, tiap siklus terdiri atas predenaturasi, denaturasi, annealing, dan elongasi. Tahap awal dalam reaksi PCR adalah predenaturasi pada suhu 94 0 C selama 5 menit. Selanjutnya denaturasi kedua dilakukan pada suhu 94 0 C selama 1 menit, annealing pada suhu 50 0 C

11 3 selama 1 menit, dan elongasi pada suhu 72 0 C selama 1 menit. Tahap terakhir dilakukan pada suhu 72 0 C selama 10 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1 % (b/v) menggunakan tegangan 70 volt selama ±30-40 menit. Proses selanjutnya ialah purifikasi produk PCR dari gel menggunakan Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Geneaid Biotech. Ltd., Taiwan). Kloning Domain KS dan Domain A ke dalam Sel E. coli DH5α. Amplikon diligasi ke dalam vektor kloning pgemt- Easy. Ligasi fragmen pengkode DNA domain KS dan domain A ke plasmid pgemt-easy dilakukan dengan mencampurkan berturut-turut 5 µl 2x Rapid Ligation Buffer (Promega), 2 µl (60 ng domain KS dan 72 ng domain A) DNA sisipan, 1µl (3 Weiss units/µl) enzim T4 DNA ligase (Promega), 1 µl (50 ng) vektor kloning pgemt-easy. Campuran kemudian dilarutkan dengan ddh 2 O hingga volume reaksi 10 µl dan diinkubasi semalam (±24 jam) dengan suhu 4 O C. Proses transformasi hasil ligasi dilakukan ke dalam E. coli DH5α, yang terlebih dahulu disiapkan menjadi sel kompeten. Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan mengkulturkan satu koloni E. coli ke media LB selama 16 jam. Kemudian kultur diambil 500 µl dan dikulturkan kembali ke dalam media LB baru selama 2 jam. Hasil kultur E. coli diambil sebanyak 1,5 ml dan diinkubasi di dalam es selama 10 menit. Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm (372,29 g) selama 10 menit, kemudian pelet sel E. coli diresuspensi dengan Transformation Buffer (TFB) sebanyak 250 µl (Lampiran 2). Hasil resuspensi diinkubasi ke dalam es selama 20 menit. Proses resuspensi dengan TFB diulang kembali dan diinkubasi kembali ke dalam es selama 10 menit. Plasmid DNA rekombinan sebanyak 10 µl dicampur dengan E. coli dan diinkubasi kembali ke dalam es selama 45 menit. Campuran diberi perlakuan renjatan panas (heat shock). Proses renjatan panas dilakukan dengan memasukan campuran ke dalam penangas air yang bersuhu 42 0 C selama 45 detik dan segera dimasukkan ke dalam es selama 5 menit. Kemudian campuran ditambahkan TFB sebanyak 100 µl dan diinkubasi dalam penangas air dengan suhu 37 0 C selama menit. Setelah itu campuran disebar dalam media luria agar (LA) yang di dalamnya terkandung ampisilin, X-gal, dan IPTG kemudian diinkubasi dengan suhu 37 O C selama 16 jam (Lampiran 2). Koloni putih yang tumbuh dikulturkan dalam media LA yang mengandung ampisilin sebagai simpanan dan dikulturkan juga ke media LB. Kultur dalam media luria broth (LB) diisolasi plasmid rekombinannya. Plasmid rekombinan (pgemt-easy- KS dan pgemt-easy-a) yang telah diisolasi selanjutnya dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI. Visualisasi hasil restriksi dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1 % (b/v). Plasmid rekombinan selanjutnya disekuen dan dilakukan analisis bioinformatika. Analisis Bioinformatika. Sekuen dari domain KS dan domain A pada plasmid rekombinan dianalisis dengan menggunakan program Bioedit dan BLAST dari National Center for Biotechnology Information (NCBI). Sekuen dicari homologinya dengan sekuen domain KS yang sudah dipublikasi dengan menggunakan CLUSTAL W (ncbi.nlm.nih.gov). HASIL Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antibakteri Sebanyak 18 isolat bakteri yang berasosiasi dengan Iso act 6 spons diuji aktivitas antibakterinya terhadap bakteri uji, baik yang patogen (S. aureus, V. harveyi, P. aeruginosa, dan EPEC K-11) maupun nonpatogen (B. subtilis dan E. coli). Hasil dari penapisan bakteri didapatkan beberapa isolat bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Hal ini ditandai dengan zona bening di sekitar goresan bakteri pada permukaan media yang mengandung bakteri uji (Tabel 1). Bakteri endofit dapat menghambat sekitar 2-4 bakteri uji. Bakteri uji yang dapat dihambat bakteri endofit ialah B. subtilis, E. coli, S. aureus, dan P. aeruginosa. Bakteri permukaan dapat menghambat sekitar 2-5 bakteri uji. Bakteri uji yang dapat dihambat bakteri permukaan ialah B. subtilis, E. coli, S. aureus, V. harveyi, dan P. aeruginosa. EPEC merupakan bakteri uji yang tidak dapat dihambat pertumbuhannya, sedangkan bakteri uji V. harveyi hanya dapat dihambat oleh satu bakteri permukaan.

12 4 Iso 8 (a) Iso 8 (b) Iso 95 40, Iso 46, Iso 8, Iso 47, Iso 67, Iso 95,Iso act 1, Iso act 16, Iso act 2, Iso 53, Iso 20, Iso 23, Iso 100, dan Iso 10). Demikian pula bakteri permukaan HAA 02 dan HAA 06 hanya dapat menghambat pertumbuhan C. albicans. Baik bakteri endofit ataupun bakteri permukaan tidak ada yang dapat menghambat pertumbuhan C. tropicalis. (Gambar 2, Tabel 1). Iso 23 Iso 10 c) (d) HAA 06 Gambar 1 Zona hambatan di sekitar koloni bakteri pada pengujian dengan (a) S. aureus, (b) V. harveyi, (c) P. aeruginosa, dan (d) EPEC. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Antifungi Hasil penapisan bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan Candida albicans yaitu bakteri endofit (HAL 87, Iso act 6, Iso Iso 10 (a) (b) Gambar 2 Zona hambatan di sekitar koloni bakteri pada pengujian dengan (a) C. albicans, dan (b) C. tropicalis. Berdasarkan uji aktivitas antimikrob didapatkan 12 isolat bakteri yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri Tabel 1 Hasil penapisan bakteri yang berasosiasi dengan spons yang memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi Isolat Bakteri Uji Fungi Uji B. subtilis E. coli EPEC P. aeruginosa S. aureus V. harveyi C. albicans C. tropicalis HAA Iso act Iso Iso Iso Iso Iso Iso iso act Iso act Iso act Iso HAA Iso HAL Iso Iso Iso Keterangan ukuran zona bening = (+): 1-5 mm, (++): 5-10 mm, (+++): mm, (++++): mm; (-): tidak menunjukkan adanya aktivitas HAA : Isolat yang diisolasi dari permukaan Iso, HAL : Isolat yang diisolasi dari endofit

13 5 uji dan fungi uji yang lebih baik. Isolatisolat bakteri tersebut ialah HAA 02, Iso act 6, Iso 8, Iso act 2, Iso 95, Iso act 1, Iso 40, HAA 06, HAL 87, Iso 23, Iso 20, dan Iso 10. Amplifikasi Domain KS dan Domain A DNA genom dari 12 isolat bakteri diamplifikasi dengan proses polymerase chain reaction (PCR). Hasil amplifikasi domain KS dan domain A pada gel agarosa 1% (b/v) menunjukkan pita berukuran sekitar 700 pb untuk domain KS (Gambar 3) dan sekitar 1000 pb untuk domain A (Gambar 4). Hasil amplifikasi domain KS dan domain A dari 12 isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons tersebut menunjukkan bahwa ke-12 isolat tersebut memiliki domain KS dan domain A. L pb 1000 pb 750 pb domain KS (700 pb) Gambar 3 Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain KS untuk 12 isolat yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. Ket: (L) 1 Kb Ladder, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10. L pb 1000 pb domain A (1000 pb) Gambar 4 Elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) hasil amplifikasi domain A untuk 12 isolat yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. Ket: (L) 1 Kb Ladder, (1) HAA 02, (2) Iso act 6, (3) Iso 8, (4) Iso act 2, (5) Iso 95, (6) Iso act 1, (7) Iso 40, (8) HAA 06, (9) HAL 87, (10) Iso 23, (11) Iso 20, (12) Iso 10.

14 6 Koloni putih Kloning Domain KS dan Domain A Dalam Sel E. coli DH5α Dua isolat dipilih untuk proses pengklonan domain KS dan domain A ke dalam sel E.coli DH5α, yaitu isolat Iso 10 dan HAA 02. Iso 10 menjadi contoh dari bakteri endofit dan HAA 02 menjadi contoh dari bakteri permukaan. Keduanya memiliki aktivitas antimikrob. Selain itu Iso 10 dan HAA 02 juga memiliki domain KS dan domain A berdasarkan hasil verifikasi dengan elektroforesis. Hasil klon domain KS dari Iso 10 menunjukkan adanya koloni putih dan koloni biru (Gambar 5), sedangkan hasil klon dari domain A dari isolat Iso 10 tidak terdapat koloni putih dan biru. Hasil klon domain KS dan domain A dari isolat HAA 02 tidak menunjukkan adanya koloni putih. Hal ini menandakan proses pengklonan domain KS dan domain A dari isolat HAA 02 tidak berhasil. Gambar 5 Koloni putih E. coli DH5α pada isolat Iso 10 yang diduga membawa plasmid rekombinan. Verifikasi Hasil Kloning Domain KS dan Domain A Koloni putih dari Iso 10 untuk domain KS dipilih untuk proses isolasi plasmid. Plasmid rekombinan hasil isolasi plasmid dari beberapa koloni putih E.coli DH5α diduga ialah pgemt-easy-10-ks. Plasmid yang diduga rekombinan dipotong dengan enzim EcoRI dan menghasilkan dua pita dengan ukuran yang berbeda. Pita pertama berukuran 3000 pb yang menunjukkan ukuran pgemt-easy, sedangkan pita kedua berukuran 700 pb yang sesuai dengan ukuran domain KS berdasarkan Schirmer et al. (2005) (Gambar 6). Hal ini menunjukkan bahwa pengklonan domain KS Iso 10 berhasil disisipkan pada E. coli DH5α. Selain itu, plasmid rekombinan yang membawa domain KS tersebut telah terpotong oleh enzim EcoRI. Koloni biru 3000 pb 750 pb Gambar 6 Elektroforesis gel agarosa 1% dari pgemt-easy-10-ks yang dipotong dengan EcoRI. Analisis Bioinformatika Palsmid rekombinan dari isolat Iso 10 yang diduga membawa domain KS selanjutnya dilakukan sekuensi (Lampiran 3). Hasil analisis didapatkan sekuen Iso 10 KS tidak sesuai dengan domain KS. Berdasarkan hasil dari amplifikasi PCR dan verifikasi hasil restriksi Iso 10 sesuai dengan domain KS, sehingga sekuen Iso KS dihomologikan dengan sekuen dari uncultured bacteria yang telah dipublikasikan dan dinyatakan telah memiliki domain KS (Lampiran 4). Accesion number dari sekuen-sekuen uncultured bacteria tersebut, yaitu, AAW84218,, dan. Proses ini digunakan untuk mendapatkan homologi antara sekuen Iso KS dengan sekuen domain KS lainnya. Hasil analisis didapatkan bahwa 49-51% dengan sekuen-sekuen domain KS lainnya (Tabel 2). pgemt-easy domain KS (700 pb)

15 7 Tabel 2 Analisis homologi sekuen Iso 10 KS terhadap sekuen domain KS asal GenBank Accesion Number Organisme Homologi (%) Uncultured bacteria 51 % AAW84218 Uncultured bacteria 50 % Uncultured bacteria 49 % Uncultured bacteria 49 % PEMBAHASAN Proses penapisan bakteri yang berasosiasi dengan Haliclona sp. dilakukan dengan menguji adanya aktivitas antibakteri dan antifungi. Penapisan dilakukan terhadap bakteri yang terdapat pada bagian endofit dan permukaan dari spons Haliclona sp. yang berasal dari Pulau Waigeo, wilayah Raja Ampat, Provinsi Papua Barat (Tokasaya 2010). Sebanyak dua isolat bakteri permukaan dan 16 isolat bakteri endofit yang digunakan dalam proses penapisan bakteri. Isolat bakteri endofit adalah bakteri yang berasal dari bagian mesohyl, yaitu lapisan yang luas dari jaringan ikat spons bagian dalam. Umumnya bakteri yang berasal dari mesohyl terdapat dalam jumlah yang berlimpah. Hal ini karena aliran air yang mengandung partikel makanan dialirkan ke dalam mesohyl oleh sel yang berflagella (choanocytes). Berlimpahnya nutrisi menjadikan mesohyl sebagai tempat tinggal komunitas bakteri yang padat (Taylor et al. 2007). Isolat bakteri endofit berbeda dengan bakteri yang terdapat pada bagian permukaan spons. Bakteri permukaan terdapat dalam jumlah yang lebih sedikit dibandingkan bakteri mesohyl. Ketersediaan nutrisi yang lebih sedikit pada bagian permukaan dibandingkan dengan bagian mesohyl dapat menjadi penyebabnya (Taylor et al. 2007). Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu P. aeruginosa adalah bakteri aerob, berbentuk batang, dan termasuk bakteri Gram negatif. Isolat ini termasuk dalam bakteri patogen oportunistik, yaitu bakteri yang dapat mengeksploitasi inang saat pertahanan inangnya melemah. Bakteri patogen yang lain yaitu S. aureus, adalah bakteri Gram positif yang sering ditemukan dalam bagian pernapasan manusia. Hal ini menjadikan S. aureus sebagai penyebab beberapa infeksi serius pada manusia seperti, pneumonia dan meningitis. Bakteri V. harveyi merupakan bakteri patogen terhadap udang dan ikan, sedangkan EPEC merupakan bakteri yang patogen terhadap manusia. EPEC dapat menyebabkan diare dan banyak ditemukan pada negara berkembang (Madigan et al. 2006). Fungi uji yang digunakan ialah C. albicans dan C. tropicalis, keduanya merupakan khamir patogen pada manusia. C. albicans menyerang bagian mulut, organ pencernaan, dan organ kelamin, sedangkan C. tropicalis menyerang kulit, bagian pencernaan, organ kelamin wanita, dan kerongkongan (Calderone & Fonzi 2001). Hasil uji aktivitas antibakteri, menunjukkan isolat-isolat bakteri dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji bakteri patogen (P. aeruginosa, S. aureus, dan V. harveyi) dan nonpatogen (B. subtilis dan E. coli). Zona bening di sekitar koloni yang merupakan zona hambatan berukuran rata-rata mm (Gambar 1). Bakteri uji yang dapat dihambat bakteri endofit ialah B. subtilis, E. coli, S. aureus, V. harveyi, dan P. aeruginosa. Bakteri uji yang dapat dihambat bakteri permukaan ialah B. subtilis, E. coli, S. aureus, dan P. aeruginosa. Bakteri uji yang tidak dapat dihambat pertumbuhannya ialah EPEC, sedangkan bakteri uji V. harveyi hanya dapat dihambat oleh satu bakteri permukaan. Zona bening yang terdapat pada V. harveyi berukuran rata-rata 5-10 mm (Gambar 2). Seperti dilaporkan pada penelitian Abubakar (2009), isolat bakteri endofit yang berasosiasi dengan Jaspis sp. dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji lebih baik dibanding isolat bakteri permukaan. Hasil uji aktivitas antifungi menunjukkan, bakteri endofit hanya dapat menghambat pertumbuhan C. albicans. Baik bakteri endofit ataupun bakteri permukaan tidak ada yang dapat menghambat pertumbuhan C. tropicalis (Gambar 2). Seperti yang dilaporkan Tokasaya (2010), dalam penelitiannya menguji aktivitas antifungi, sebanyak 6 isolat dari 31 isolat bakteri endofit yang mampu menghambat pertumbuhan C. tropicalis. Selain itu, hanya 5 isolat dari 8 isolat bakteri permukaan yang mampu menghambat pertumbuhan C. tropicalis. HAL 87 merupakan isolat bakteri

16 8 endofit yang sama digunakan dalam penelitian ini dan dalam penelitian Tokasaya (2010). Hasilnya didapatkan bahwa HAL 87 memang tidak dapat menghambat pertumbuhan C. tropicalis. Selain itu, isolat bakteri permukaan yang digunakan dalam penelitian ini sama dengan penelitian Tokasaya (2010) ialah HAA 02 dan HAA 06. Namun hasil penelitian Tokasaya HAA 02 dan HAA 06 dapat menghambat pertumbuhan C. tropicalis, sedangkan dalam penelitian ini tidak. Diduga bahwa khamir C. tropicalis yang digunakan berasal dari galur yang berbeda. Hasil penapisan 18 isolat bakteri didapatkan 12 isolat (66,67%) yang memiliki potensi sebagai penghasil senyawa antimikrob (Tabel 1). Isolat-isolat bakteri tersebut memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi dengan spektrum luas. Salah satu contoh isolat bakteri yang memiliki aktivitas antimikrob dengan spektrum luas ialah HAA 02. HAA 02 dapat menghambat pertumbuhan tiga bakteri uji dan satu fungi uji. Selain HAA 02, terdapat lima isolat bakteri lain yang dapat menghambat pertumbuhan tiga bakteri uji dan satu fungi uji. Isolat-isolat bakteri tersebut ialah Iso act 6, Iso 8, Iso act 2, Iso 23, dan Iso 10. Isolat bakteri lainnya hanya dapat menghambat pertumbuhan sekitar dua sampai tiga bakteri uji. Radjasa (2007) menyatakan bahwa, bakteri yang berasosiasi dengan Haliclona sp. memiliki spektrum aktivitas antimikrob yang luas. Sehingga bakteri asosiasi dengan Haliclona sp. dapat dimungkinkan sebagai sumber senyawa antimikrob untuk mengendalikan bakteri patogen. Senyawa bioaktif dari bakteri yang berasosiasi dengan spons laut mungkin memiliki gen biosintesis metabolit sekunder yaitu PKS dan NRPS. Proses PCR dapat dilakukan untuk melihat ada atau tidaknya gen PKS dan NRPS pada suatu bakteri. Metode PCR dapat menjadi suatu cara untuk memperkirakan kekayaan produsen metabolit sekunder hasil asosiasi dengan spons Haliclona sp. dan mempelajari keragaman gen bakteri pada spons lain (Radjasa et al. 2007). Sebanyak 12 genom dari isolat bakteri diuji dengan PCR. Primer PCR dirancang secara khusus untuk domain KS dan domain A. Primer degeneratif tersebut diacu berdasarkan Schirmer (2005). Hasil amplifikasi domain KS dan domain A pada gel agarosa 1% (b/v) menunjukkan pita berukuran sekitar 700 pb untuk domain KS (Gambar 3) dan sekitar 1000 pb untuk domain A (Gambar 4). Hal ini menunjukkan bahwa 12 isolat tersebut memiliki domain KS dan domain A. Hal ini memungkinkan 12 isolat memiliki gen hibrid PKS-NRPS (Gambar 3 & 4). Hibrid PKS-NRPS dapat terjadi dengan kombinasi domain pada modul NRPS dengan domain pada modul PKS dalam satu open reading frame. Gen hibrid PKS-NRPS dapat menghasilkan senyawa bioaktif dengan struktur hibrid (Ansari et al. 2004, Zhu et al. 2009) Sebanyak dua isolat dipilih dari 12 isolat untuk pengklonan domain KS dan domain A ke dalam sel E. coli DH5α yaitu HAA 02 dan Iso 10. Isolat Iso 10 untuk domain KS menghasilkan koloni putih dan biru (Gambar 5). Isolat Iso 10 memiliki domain KS. Hal tersebut didukung dengan verifikasi hasil isolasi plasmid dan proses pemotongan plasmid (restriksi) dengan EcoRI. Hasil verifikasi mendapatkan dua pita dengan ukuran yang berbeda berukuran 3000 pb dan 700 pb (Gambar 6). Pengklonan domain A untuk Isolat Iso 10 dan HAA 02 tidak menghasilkan koloni putih dan biru. Hal ini diduga proses pengklonan domain A pada Iso 10 dan HAA 02 tidak berhasil. Hasil analisis dengan BLAST diidentifikasikan Iso 10 tidak memiliki domain KS. Iso 10 memiliki maximum identity sebesar 92% sebagai putative transcriptional regulator (Stenotrophomonas maltoph). Berdasarkan hasil amplifikasi PCR dan verifikasi hasil pemotongan plasmid (restriksi) didapatkan ukuran pita dari plasmid Iso 10 sesuai dengan domain KS. Hasil analisis didapatkan bahwa Iso 10 memiliki kemiripan sekitar 49-51% dengan sekuensekuen domain KS. Sekuen domain KS yang mirip merupakan organisme uncultured bacteria yang telah dipublikasikan (Lampiran 4). Seperti dilaporkan dalam penelitian Schirmer (2005), sebanyak 256 sekuen dari isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki tingkat homologi yang cukup rendah. Tingkat kehomologian untuk sekuen KS berdasarkan database yang ada termasuk rendah, yaitu sekitar 49-79%. Berdasarkan hal tersebut, isolat Iso 10 berhomologi dengan domain KS walaupun hanya 49-51%.

17 9 SIMPULAN Dua belas isolat bakteri dari 18 isolat asal spons Haliclona sp. (66,67%) menghasilkan senyawa bioaktif dengan aktivitas antibakteri dan antifungi. Sepuluh isolat termasuk bakteri endofit dan dua isolat berasal dari bagian permukaan spons. Kedua belas isolat diduga mengandung domain Ketosynthase (KS) dari Polyketide Synthase (PKS) dan domain Adenyl (A) dari Non-Ribosomal Peptide Synthase (NRPS). Homologi antara isolat Iso 10 KS dengan sekuen domain KS lainnya sekitar 49-51%. DAFTAR PUSTAKA Abubakar E Bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. : analisis penghasil senyawa antimikrob dan keragaman genetiknya [tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Ansari MZ, Yadav G, Gokhale RS, Mohanty D NRPS-PKS: a knowledgebased resource for analysis of NRPS/PKS megasynthases. Nuc Acids Res 32: Bahkuni DS, Rawat DS Bioactive Marine Natural Product. New Delhi: Anamaya Publishers. Blunt JW, Copp BR, Hu WP, Munro MH, Prinsep MR Marine natural products. Nat Prod Rep 24 : Calderone RA, Fonzi WA Virulence factors of Candida albicans. Trends Microbiol 9: Kennedy J, Codling CE, Jones BV, Dobson ADW, Marchesi JR Diversity of microbes associated with the marine sponge, Haliclona simulans, isolated from Irish water and identification of polyketide synthase genes from the sponge metagenome. Appl Environ Microbiol 10: Kennedy J, Baker P, Piper C, Cotter PD, Walsh M. et al Isolation and analysis of bacteria with antimicrobial activities from the marine sponge Haliclona simulans collected from Irish waters. Mar Biotechnol 11: Lanen SGV, Shen B Microbial genomics for the improvement of atural product discovery. Sci Direct 9: Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP Brock Biology of Microorganisms. Ed ke-12. San Fransisco: Pearson Education. Otsuka M, Ichinose K, Fujii I, Ebizuka Y Cloning, sequencing, and functional analysis of an iterative type I polyketide synthase gene cluster for biosynthesis of the antitumor chlorinated polyenone neocarzilin in Streptomyces carzinostaticus. Antimic Agents Chemoter 9: Pangan ACG, Uy FA, Oclarit JM Antimicrobial properties of some marine sponges (porifera) from Mactan, Cebu, Philiphines. Philip Sci 44: Piel J Metabolites from symbiotic bacteria. Nat Prod Rep 21: Radjasa OK, Kencana DS, Sabdono A, Hutagalung RA, Lestari ES Antibacterial activity of marine bacteria associated with sponge Aaptos sp. against Multi Drugs Resistant (MDR) strains. J Mat Sains 12: Sambrook J, Russel DW Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Vol 1. Ed-3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schirmer et al Metagenomisc analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta. Appl Environ Microbiol 8: Shen QT, Chen XL, Sun CY, Zhang YZ Dissecting and exploiting nonribosomal peptide synthase. Acta Biochim Biophys Sinica 36: Schwarger D, Finking R, Marahiel MA Nonribosomal peptides: from genes to products. Nat Rep Prod 20: Thomas TRA, Kavlekar DP, Lokabharathi PA Marine drugs from spongemicrobe association. Mar Drugs 8:

18 10 Tokasaya P Sponge-associated bacteria producing antimicrobial compounds and their genetic diversity analysis [tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Zhang W, Li Z, Miao X, Zhang F The screening of antimicrobial bacteria with diverse novel non-ribosomal peptide synthase (NRPS) genes from South China Sea sponges. Mar Biotechnol 11 : Zhang W, Zhang F, Li Z, Miao X, Zhang X Investigation of bacteria with polyketide synthase genes and antimicrobial activity isolated from South China Sea sponges. J Appl Microbiol 107 : Zhao J, Yang N, Zeng R Phylogenetic analysis of tipe I polyketide synthase and nonribosomal peptide synthase genes in antartic sediment. Extremophiles 12 :97-10 Zhu, Peng, Zheng Y, Yan X, Shao J Molecular phylogeny and modular structure of hybrid NRPS/PKS gene fragmet og Pseudoteromonas sp. NJ6-3-2 isolated from marine sponge Hymeniacidon perleve. J Microbiol Biotechnol 19 : Zucko J, Skunca N, Curk, Zupans B, Long PF. et al Polyketide synthase genes and the natural products potential of Dyctiostelium discoideum. Bioinformatic 23 : Xiao HC, Vater J, Piel J, Franke P, Scholz R. et al Structural and functional characterization of three polyketide synthase genes clusters in Bacillus amyloliquefaciens FZB 42. J Bacteriol 188 :

19 LAMPIRAN 11

20 12 Lampiran 1 Komposisi macam-macam media yang digunakan dalam proses penapisan bakteri yang berasosiasi dengan spons Haliclona sp. Media Sea Water Complete (SWC) Komposisi Bacto Peptone Yeast Extract Bacto Agar Air laut Aquades Jumlah 5 g 1 g 15 g 750 ml 1000 ml Media Potato Dextrose Agar (PDA) Komposisi Jumlah Agar-agar 20 g Dekstrosa 20 g Kentang 300 g Aquades 1000 ml Media Potato Dextrose Broth (PDB) Komposisi Jumlah Potato Dextrose Broth 24 g Aquades 1000 ml Lampiran 2 Bahan-bahan dan media yang digunakan dalam proses transformasi Transformation Buffer (TFB) Komposisi Jumlah CaCl 2 0,1 M MgCl 2 5 mm Tris-Cl (ph 7) 5 mm NaCl 10 g Media Luria Agar (LA) Komposisi Yeast Extract Bacto Trypton NaCl Bacto Agar Jumlah 5 g 10 g 10 g 15 g

21 13 Lampiran 3 Sekuen dari Iso 10 KS (dalam bentuk FASTA) GCATGCTCCC GGCCGCCATG GCGGCCGCGG GAATTCGATT GCCATGGACC CCCAGCAGCG GCTGGAAGGG GTGCGGGCCG CCGGCAAGGC GCGTGGCCGC CTGCGCCAGC TGAGCGTGGT GCCGGGCGAT TTCTCGGTGG AATCCGGGCA TGCCGCGGCC GTGGCGCTGC TGGCCGATGC GTCGGCGCCG ACCGCAGTCT TCTGCTTCAG CGACCAGATG GCGCTGGGTG CGCTGGCGGC CTGCCGCGAT CTGGGCATCC GCGTGCCGGA CGAGTTGTCC ATCGTCGGTT TCGATGACCT GGCGTCTTCG CGTTACCTCA CGCCGCCGCT GACGACCATC CGGCAGCCGA TGCGGGAGAT CGGCGCGCGC GCGGTCAACC TGCTGCTCGC CATCGTTGAA CAGGTGGATG TTCCGCTTCA ACAGACGCTG GATTTCAGCC TGATGGTGCG GGGGTCGACG GCGGCACCTG GGCCCAGGTG AGGCCAGGGA CGCTGCAGGT TCGAGTCCTT GATCCCGAAT TGACGTAAAG CTGTCAGACT CACGACAGGC AGCCCGGCAG GGGCCGGGGT GGAACGTGCG ATCGCGCAAG GGGGTCGGCA ATGCCGTTCT TGACTGACTC GACGGAGGTC GCGGTCGAGG GCCACGGCAC GGGGACAATC ACTAGTGAAT TCGCGGCCGC CTGCAGGTCG ACCAT Lampiran 4 Homologi antara sekuen-sekuen domain KS dengan Iso 10 KS 1. Homologi antara sekuen domain KS AAW84218 dengan Iso 10 KS AAW GCCATGG-ATCCGCAGCAACGGGTGCTGCTGGAGAC GCATGCTCCCGGCC...CGG...G.G..TTC.-AT...CATG AAW84218 CACCTGGCAGGCGCTCGAGGACGCGGGAATCGATCCCGGCACGCTGAGGG.-..CA...CG...G..A.GG.T.C.GGC A.GC.C.T AAW84218 GCGGCC-GCGCCGGGGTGTACGCGGGACTGGGTGGAAGCG----AGTACC..C...T...A.C-..AG..T..TG.C...C.ATTT.TCGGTG.A.T AAW84218 GGGACGTGATCGCGCTCGGCGGCAAGGAGGTCGGGTATCTCGGAACCGCG C..G.A..-C...GC..-T...GCT.CT.G.C.A.GCG...CG...AC AAW84218 GGAAGCGT CGCGGTCGGACGGGTGGCCTT---TGCGCTGG-- C.C..TC.----TCTG.TTCAG..AC.A.A...GC.GGG...CG AAW84218 GACTGTCGGGACC--GGCGATGGCGCTGGACATGACCTGCGCATCGTCCC.C...C..C..T.TG...ATCC...TGCCGG.C..GT..TC...GG AAW84218 TGGCCGCGATGCACCAGGCCGCGGTGGGCCTGGAGCG----TGGCGAGGT.TT.GAT..CCTGG.GTCTTCGC..TAC.TCACGC..CCGC..A...CCA AAW84218 GGACGTGGCCCTCGCGGGTGGCGTGCACGCGGTTCTGTCTCCCGGAGTGA

22 14 TCCG.CA...GAT...A.ATCG..G...-CG.G...AA..T.C-..C AAW84218 CGAAGTTCATGGCGGAGCTGGGACTGCTG--TCGGCGAGCGGTCGTTGCC TCGCCA..G.T.AAC..G...ATG.T.C.CT..AA.AGA..C.G.A.TT AAW84218 GCCCCTTCGGAGCGGACGCGGACGGCTTCGTGCGTGGCGAGGGTTGCGGG AG..TGAT..T...GG.TC...GG.ACCT.G.C.C...TGA.GCCA AAW84218 ATGGTGGTTCTGAAGCGGCTCGCCGAAGCGGAGGCGGACGGCGACCGGAT GG.AC.C.G.A.GTT..AG..CTT..TC.C..-ATT...TAA.G.-TG AAW84218 CTGGGCCGTGCTCCGCGGTTCGGCGGTGGATCAGAGCGGGGCGAGCGCGG.A.ACT.AC.ACAG..A.CC...A.-..GC.G.G.T..AA..T...ATC AAW84218 GGCTCACGGTGCCGAACGGGCCGGCGCAGGAGCGGGTGATCGAGGAGGCG.CGCA.G..G.T..GCAAT...TTCTT.ACTGACTC..CG...TC AAW84218 TTGTCCCGGGCGGGGAT-CGCGCCTTGCGA--GGTGGACTACGTCGAAGC --...GA...CAC.GCA..G.GACAATC.CTA...A.T.-..CG.CC AAW84218 GCATGGGACCGGCAC CTGCA..T.GAC..T 2. Homologi antara sekuen domain KS dengan Iso 10 KS GCGATGGACCCGCAGCAGCGCCTACTGCTCGAGACCAGTTGGGAGG---C ATGCTC..G..C..CAT.G.GG.C..GG..ATT.GA...CC.T.GAC TCTGGAGGATGCCGGGATGGATCCTGCTCAGCTCAGAGGCAGCCGGACCG C.CA.CA.CG..T..A.G..G.G.G.GC.GC.GGCA...GCGT..C.GC GAGTTTTCGTCGGA-ATTACGACGAACGATTACCGCGACTTGATTC---T CT.CGCCA.CT.AGCG.GGT.C..GG...-T.T..GTGGA..C.GGGC CTTCAGCGGGGAGGATGTTGCCGGCGTCACCGTGGCTGCGGGAAACAG-C A.G.C...CCGT.GC.C...T...CGATG...C.GC..C.ACCG...T.

23 GGCGGCTCGGCGGTCGGGAGGGTGGCGTTCACGCTGG--GACTGGAGGGG TT.T...TCAGC.A.CA..T..C.CT.GGTG...CG.C...CC.C.A CCAGTGATTCCGGTCGAC--ACCGCTTGTTCTTCCTC---TCTGGTCGCC T.T.G.CA...CGT.C.GG..GAG...C.A..G..GGT.TC.A.GA GTGCATCAGGCGGTGACCGGACTGCAGCGA-GGCGA--GGCCGAT--CTG TG..G..TTCGC..T...TC..GC.GC..CT.A...CCAT...GCAG.C GCGCTAGCGGGCGGTGTGAACGCAGT------GCTGCT-GCCAGCGATGA AT..GG.A.AT...C.C.CG...G..CAACCT...C...T..T CCAAG-GAATTCGCAGCAGTCGGA-ATGCTGGCTTCCGACG-GAAGGTGC A..G.T.G..GTT.C..TTCAAC.G.C...A..T.AG.CT..T AAGGTGTTCGATTCTTCTGCGGACGGTTATGTGCGAGGAGAGGGCTGTGG GG..--G...--.GG.G..ACCT..GCCCAG.T...CC...AC.CT CATTGTCGCGCTCAAGCGCCTGAGC-GACGCGGAAGCCGACGGCGACCCG..GGT...A.TC.TT.AT..C..ATT...TA-...T.T.A.--..T.A ATCTGGGGAGTGATTCGAGGTTCCGCGGTGAATCAC---AACGGG-ATGG CGACA..C..CCCGG.AG-.GG...G...G.A.GTGCG.T..C.C.A GCGCAAGCCTCGCCGTCCCCAA-TGGTCCGGCGCAAGAGCGAGTGATCGA.G.TCG..AAT...T.TTG.C..ACT..A GTC.C.G GGAGGCCTTGGCAAGGGGCGGGATCGAGCCGTCTGAGGTGGACTACGTGG AC...C A.AA..ACTA...A.T.-..C AGGCCCACGGCACCGGCAC CC...TG.A.GT.GAC..T

24 16 3. Homologi antara sekuen domain KS AAW84293 dengan Iso 10 KS GCGATGGATCCGCAACAGCGGGTGATGCTGGAAACCACTTGGGAGG---C..ATGCTCC.G..CG.CAT..CG.CC..G...TT.GA...CC.T.GAC TCTCGAGGATGCGGGCATGGATCCGGATCGGCTGAAGGGCA----GCCGC C.CA.CA.CG..T..A.G..G.G...GC..C.G.C.A...GCGTG AC---CGGGGTATACACCGGGATCAGCAACGAC------GAATACAGG-A CTGCG.CA.C.GAG.GTG.T.CCGG..G.TTT.TCGGTG...C.G..C TGCTG--GTAGTGGAGTCAAGGA--AACCTGCCGAGGCCGCCTCATGTCT...C.CG.CC...C.CTGCT.GCCG.TGC.T..GC...A.CGCA C---TATGCTCTGAGCGGCACGAACCTGAACGGTACCAGCGGACGGGTCT ----.C...TC-...A.CA..TGGC.CTG...G.--..T.G...-C CTTTCGTGCTGGGCCTCATGGGACCGGCGAAGGCAGTGGACGCCGCATGC GCCG..AT...A..CGC.TG...ACG..TTGTCCAT..T..GT.T G------CGTCGTCCATGGTGTCGGTCCACGACGCGGTGGCAGACC-TGC.ATGACCT.G...T-.C.C..TACCT...C...C.CT.AC...A.C AGCAG--GGCAAGGCGGATCTGGCCAT-TGCAGGCGGTGTGCAG---GCC G...CC.ATGC..GA...G.CG.GCGC..G.T.AACC...T.CTC ATC-CTGAACAGTCGCATTTTCGAACTCCGTGCGGATGCGATGATGCTGT...GT...GT.G..G...CGCT..AA--.A..C..TGGAT.T.A.C CTCCGGACG-GGCAGTGCAAAACGTTCGATGAGTCTGCGAACGGTTACGT..GAT.GT.C..GG..CG.CGG..GCACC..G.C.CAG.TGA..CC.G.G GCGCGGCGAAGGTTGCGGCGTCGTTATCCTGA-AGCGGCTGAGCGAGGCC A...T AGTC.T.G...C..-.TT.A.---.TA.A..-

25 GAGGAGGATGGCGATCGG-ATCTGGGGGGTGATCCGAGGCTCGGCGGTGA TGTC..AC.CA...CA..C.G.CC..CA.-.GG...G..TGGAA..TGCG ATAACGGCGGGCCCGGCACCGGACTGACCGTACCGCACATCCCCGCATTG..CG..CAA GTC.G.AA.G...TT.T.GA.T.AC.C GAACAGGTGATGGAAGCGGCCCTGTCCCAGGCCGGAGTTCCTGCTTCGGA ACGG...CGC..TC.A..G..ACGG.AC..GGAC.A.CA..A TGTGGATTACGTCGAAGCCCACGGCACCGGCAC -...A...-..CG.CC...TG.A.GT.GAC..T 4. Homologi antara sekuen domain KS dengan Iso 10 KS GCCATGGACC GCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATT CGCAGCAGCGCCTGATGCCGGAA--ACCAGCTGGCAGGCGCTCGAAGACG.C...G...GAAGG..TGCGGG.C..C...A.-..G..TG.C CCGGCATCGACCCGGACACCTTACAGGGCAGCCGCATCGGCGTGTACGGG..T..GC.AG.T-.AG.GTGG.G.C...GATTT.-...T.-.A.TCC GGCAT-CAGCAACAACGACTACCGCGGGCTGGTGC-TGGAAGCCGGCGAT...G.C..GG.CGT.G.-G.T..T...C.A...G.C.GC...A.CGC CCCGCTGGACCTGCCTCCA-GCCTGTATGCGGTCAGCGGTAGTTCCTACA AGTCT----T...T..AGC.A.CAG...GC.CTG.GT.CGC.GG.GG.C ACACGGCCATTGGGCGGGTGGCCTTCGCACTTGGCTTCCGGGGTCCGGCG TGC..CGATC...ATCC.CGTGC..G..GA.TTG...A----T..T..

26 ATTGCGATCGACACCGCCTGCTCGTCGTCACTCGTCGCCATCCATCAGGC G..T CTG..G.CT T..CTCA...GC.--G.T.A GGTGACCGGCTTGCGGCAGGGCGAGGCCGACCTGGCCCTGGCCGGCGGCG.ACC.T.C.GCA..C.AT.C.G...AT..G.GC.CG.GC..T.AA.CTGC TGCACACCATCCTGTCCGGGCGGCTGATGGCATTGCGCGCCAACGCCGGC...T.G...G.---T.AA.A.G..--.ATG..C...TT...A----G ATGCTGGCGCCCGACG-GGCGCTGCAAGACGTTCGATGCCGCCGCCAACG.C...ATTT.AG.CT.AT.G...GG.--.G...C.G..G.A..TGG GCTACGTGCGGGGGGAGG-GCTGCGGCATCCTGGTGCTCAAACGGCTGCG C.C.G...A..CCA.G.AC...A.-G.T.GA..C..TG.T.CCGA-AT TGAGGCGGAGGCGGACGGCGACCGCATCTGGGGCGTCATCCGGGGCTCCG...C.TAA..C-T.T.A.-ACT.A.GA.A..CAGCC.GG.A.-..GC.G CGCTAAACCAGGACGGTGCCAGCACGGGGCTGACGGTGCCGAGCGAAGAG G.TGG...--.TG..A.CG.GCA.G...TC.G.AA...TT.TTGACT GCACAGGAGCAGGTCATTGTGGATGCCCTCCGGCGGTCCGGGGTACTGCC.ACTC.AC.G...GCG..C..G.G..----A...CA A.A CTCGCAGGTGGACTACGTCGAGGCCCACGGCACCGGGAC A..A.TA...A.T.-..CG.CC...TG.A.GT.GACC.T Keterangan: nukleotida Iso 10 yang conserved dengan sekuen-sekuen domain KS ditampilkan dengan tanda titik (.)