DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DENGAN PRIMER PROMOTER inha DARI DNA METAGENOMIK SPUTUM PASIEN TUBERKULOSIS

Transkripsi

1 TESIS DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DENGAN PRIMER PROMOTER inha DARI DNA METAGENOMIK SPUTUM PASIEN TUBERKULOSIS NI MADE YUSTIKARINI PROGRAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 i

2 TESIS DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DENGAN PRIMER PROMOTER inha DARI DNA METAGENOMIK SPUTUM PASIEN TUBERKULOSIS NI MADE YUSTIKARINI NIM PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN PROGRAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 ii

3 DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DENGAN PRIMER PROMOTER inha DARI DNA METAGENOMIK SPUTUM PASIEN TUBERKULOSIS Tesis ini untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Kimia Terapan, Program Pasasarjana Universitas Udayana NI MADE YUSTIKARINI NIM PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN PROGRAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 iii

4 Lembar Pengesahan TESIS INI DISETUJUI TANGGAL 26 AGUSTUS 2015 Pembimbing I Pembimbing II Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si NIP NIP Mengetahui Ketua Program Magister Kimia Terapan Program Pascasarjana Universitas Udayana, Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. I Made Dira Swantara, M.Si Prof.Dr.dr.A.A Raka Sudewi,Sp.S(K). NIP NIP PENETAPAN PANITIA PENGUJI TESIS iv

5 PENETAPAN PANITIA PENGUJI TESIS Tesis ini diuji pada Tanggal 26 Agustus 2015 Panitia Penguji Tesis berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No : 2715/UN14.4/HK/2015, Tanggal 25 Agustus 2015 Ketua : Dr.Sagung Chandra Yowani,S.Si,Apt., M.Si Anggota 1. Dr. I Nengah Wirajana,S.Si, M.Si 2. Prof. Dr. I Made Dira Swantara,M.Si 3. Prof. Dr. Ir. I Gede Mahardika, M.S 4. Dr. Dra. Retno Kawuri, M.Phil v

6 SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT Saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama : Ni Made Yustikarini NIM : Program Studi : Kimia Terapan Judul Tesis : Deteksi Mycobacterium tuberculosis dengan Primer Promoter inha dari DNA Metagenomik Sputum Pasien Tuberkulosis Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah ini bebas plagiat. Apabila di kemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI N0. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku. Denpasar, 26 Agustus 2015 Yang membuat pernyataan Ni Made Yustikarini vi

7 UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan Yang Maha Esa, karena hanya atas asung kerta wara nugraha-nya, tesis yang berjudul Deteksi Mycobacterium tuberculosis dengan Primer Promoter inha dari DNA Metagenomik Sputum Pasien Tuberkulosis ini dapat diselesaikan. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., sebagai pembimbing I yang telah banyak membantu dan tak hentinya memberikan semangat, bimbingan serta dukungan dalam penyelesaian tesis ini. Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya juga penulis sampaikan kepada Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., sebagai pembimbing II yang juga telah banyak membimbing dan memberikan saran, semangat, serta dukungan untuk menyelesaikan tesis ini. Ucapan terima kasih juga ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. I Ketut Suastika, Sp.PD-KEMD atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan Program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terimakasih penulis ucapkan kepada Direktur Program Pasca Sarjana Universitas Udayana yang dijabat oleh Prof. Dr. Dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S (K) atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pasca Sarjana Universitas Udayana. Pada kesempatan ini juga penulis menyampaikan rasa terimakasih kepada ketua Program Studi Kimia Terapan Program Pasca Sarjana Universitas Udayana, Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pasca Sarjana Universitas Udayana. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kepala UPT Laboratorium Forensik Universitas Udayana, Dr.rer.nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si.,Apt atas ijin yang diberikan kepada penulis untuk menggunakan fasilitas laboratorium. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada para penguji tesis yaitu : Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si, Prof. Dr. Ir. I Gede xi

8 Mahardika, M.S, Dr. Dra. Retno Kawuri, M.Phil, yang telah memberikan masukan, saran, sanggahan dan koreksi sehingga tesis ini dapat terwujud. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak, Ibu dosen dan segenap karyawan di lingkungan Magister Kimia Terapan yang telah memberikan banyak bekal ilmu pengetahuan dan kerja sama selama penulis menimba ilmu. Terimakasih yang sebesar-besarnya juga penulis sampaikan kepada staff laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Udayana diantaranya Nanik, Mbok Mang Handayani, Ecik, Mbak Wahyu dan Pak Ketut atas bantuannya selama penulis melakukan penelitian. Pada kesempatan ini ijinkanlah penulis menyampaikan terima kasih yang tulus kepada suami yang telah banyak memberikan bimbingan dan dukungan semangat, moral serta finansial, anak-anak tercinta Luh Muni Wiraswari, Made Parama Wiryasentana dan Ketut Saita Wiryaparami. Ucapan terimakasih yang tulus juga penulis sampaikan kepada orang tua penulis yang sudah dengan sabar memberikan bimbingan moral dan dukungan semangat yang tiada hentinya. Terima kasih yang tulus juga ingin penulis sampaikan kepada teman-teman satu team penelitian, Maitri dan Indra yang sudah banyak membantu dan menjadi teman diskusi yang baik selama penelitian. Akhirnya penulis mengucapkan terima kasih kepada teman-teman seperjuangan di Magister Kimia Terapan Universitas Udayana diantaranya Rahayu, Bu Rini, Diani, Nining, Eva, Bu Trisna, Gusti, Bu Sagung, Agus, Widya, Fika dan Lia. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmat dan anugerah-nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan penyelesaian tesis ini. Semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan perkembangan ilmu pengetahuan. Denpasar, Agustus 2015 Penulis xii

9 DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... ii PRASYARAT GELAR.... iii LEMBAR PENGESAHAN.... iv PENETAPAN PANITIA PENGUJI... v PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... vi UCAPAN TERIMA KASIH... vii ABSTRAK... viii ABSTRACT... ix RINGKASAN... x DAFTAR ISI... xi DAFTAR TABEL... xiv DAFTAR GAMBAR... xv DAFTAR SINGKATAN... xvi DAFTAR ISTILAH... xvii DAFTAR LAMPIRAN... xix BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian... 6 BAB II KAJIAN PUSTAKA Tuberkulosis Penegakan Diagnosis Tuberkulosis Metagenomik Isolasi DNA Metagenomik xiii

10 2.5. Polymerase Chain Reaction Elektroforesis Sekuensing DNA Analisis Homologi BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS Kerangka Berpikir Hipotesis BAB IV METODE PENELITIAN Rancangan Penelitian Lokasi dan Waktu Penelitian Bahan Penelitian Alat Penelitian Prosedur Penelitian Isolasi DNA dari Kultur Isolat MDR-TB Isolasi DNA Metagenomik dari Sputum Pasien MDR-TB Amplifikasi DNA dengan PCR Deteksi DNA dengan Elektroforesis Sekuensing DNA Analisis Data Penelitian BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi DNA Metagenomik Amplifikasi DNA Metagenomik dengan Teknik PCR Optimasi Suhu Annealing Primer Pomoter inha M. tuberculosis Amplifikasi DNA Metagenomik dengan Primer Promoter inha Analisis Produk PCR dengan Sekuensing xiv

11 5.4. Analisis Homolog dan Mutasi Nukleotida BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN-LAMPIRAN xv

12 DAFTAR TABEL Halaman 5.1 Hasil Analisis homologi sekuens fragmen promoter inha DNA Metagenomik P.48B Hasil Analisis homologi sekuen fragmen promoter inha DNA Metagenomik P.47B Hasil Analisis homologi sekuen fragmen promoter inha DNA Metagenomik P.48B dengan Kit Hasil Analisis homologi sekuen fragmen promoter inha DNA Metagenomik P.46B dengan Kit. 48 xvi

13 DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1 Bakteri Mycobacterium tuberculosis pada sputum dengan teknik pewarnaan tahan asam Dinding sel mikobakteri Kerangka Konseptual Penelitian Skema Rancangan penelitian Elektoforegram DNA metagenomik sebelum amplifikasi dengan PCR Elektroforegram PCR dengan suhu annealing 56ºC,57ºC, 58ºC Elektroforegram PCR dengan suhu annealing 59º Elektroforegram dari produk PCR pertama dari DNA Metagenomik Elektroforegram dari produk PCR kedua dari DNA Metagenomik Elektroforegram amplifikasi lima sampel DNA metagenomik pengulangan pertama Elektroforegram amplifikasi lima sampel DNA metagenomik pengulangan kedua Elektroforegram dari produk PCR sebelum disekuensing.. 45 xvii

14 DAFTAR SINGKATAN BLASTn : Basic Local Alignment Search Tool nucleotide Bp : base pairs C : sitosin DNA : Deoxyribonucleic acid datp : deoksiadenosin trifosfat dctp : deoksisitidin trifosfat dgtp : deoksiguanosin trifosfat dttp : deoksitimidin trifosfat dntps : Deoxynucleotide triphosphates EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid GuSCN : Guanidinium thiocyanate INH : isoniazid inha : pengkode enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase MDR : Multi-drug resistant MEGA4 : Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0 PCR : Polymerase Chain Reaction T : timin TB : tuberkulosis TAE : Tris-Asetat EDTA TBE : Tris-Boric Acid-EDTA xviii

15 DAFTAR ISTILAH Alignment : proses pensejajaran sekuen DNA berdasarkan homologi sekuen tersebut dengan subjek untuk mengidentifikasi sekuen yang memiliki kesamaan Amplikon : produk PCR Asam amino : unit monomer penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida Comb : alat menyerupai sisir yang digunakan untuk membentuk kolom (well) pada gel agarosa Chamber wadah untuk meletakkan gel agarosa DNA polymerase : enzim yang diperlukan sebagai katalis dalam proses polimerisasi DNA DNA templat : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan Elektroforegram : pita hasil analisis elektroforesis gel Elektroferogram : grafik hasil analisis sekuensing Gen : urutan DNA yang menyandi suatu protein GenBank : database utama dalam biologi molekuler yang dikelola oleh NCBI H37Rv : galur standar yang dijadikan wild type In silico : dilakukan pada komputer Kodon : deret nukleotida pada mrna yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu xix

16 Mutasi : terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip Nukleotida : unit monomer pembentuk DNA PCR : teknik perbanyakan urutan DNA dengan menggunakan reaksi enzimatis Pelet : gumpalan DNA berwarna putih pada dasar tabung setelah proses sentrifugasi Primer : oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat Polimerisasi : reaksi pembentukan polimer Promoter : suatu sekuen DNA spesifik yang berperan dalam mengendalikan transkripsi gen struktural xiii xiii Sekuen : urutan DNA Sekuensing : proses penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA Tray : alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarosa Well : kolom-kolom tempat diletakkannya zat yang akan dielektroforesis Tray : alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarosa Well : kolom-kolom tempat diletakkannya zat yang akan dielektroforesis xx

17 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Skema Kerja Isolasi DNA dari isolat M. tuberculosis dan sputum pasien Tuberkulosis dengan metode Boom Modifikasi Skema Kerja Isolasi DNA Metagenomik dari Sputum pasien Tuberkulosis Skema kerja isolasi DNA metagenomik menggunakan DNA Isolation kit 61 4 Pembuatan Larutan Elektroferogram Hasil Sekuensing Promoter inha terhadap DNA Metagenomik Sputum P. 48B Elektroferogram Hasil Sekuensing Promoter inha terhadap DNA Metagenomik Sputum P. 47B Elektroferogram Hasil Sekuensing Promoter inha terhadap DNA Metagenomik Sputum P. 48B dengan kit Elektroferogram Hasil Sekuensing Promoter inha terhadap DNA Metagenomik Sputum P. 46B dengan Kit Hasil Alignment Sekuens Nukleotida DNA Metagenomik A Sputum MDR- TB Promoter inha dengan Data Base M.Tuberculosis (U ) Hasil Alignment Sekuens Nukleotida DNA Metagenomik C Sputum MDR- TB Promoter inha dengan Data Base M.Tuberculosis (U ) Hasil Alignment Sekuens Nukleotida DNA Metagenomik Sputum MDR- TB P.48B Kit Promoter inha dengan Data Base M.Tuberculosis (U ) Hasil Alignment Sekuens Nukleotida DNA Metagenomik Sputum MDR- TB P.46B Kit Promoter inha dengan Data Base M.Tuberculosis (U ) xxi

18 13. Hasil Alignment Sekuens Nukleotida Isolat P.11, P.16, DNA Metagenomik P.48B, P.47B, P.48B Kit dan P. 46B Kit Sputum MDR- TB Promoter inha dengan Data Base M. tuberculosis (U ) Hasil Alignment Sekuens Nukleotida Isolat P.11, P.16, DNA Metagenomik P.48B, P.47B, P.48B Kit dan P. 46B Kit Sputum MDR- TB Promoter inha dengan Data Base M. tuberculosis (U ) dalam Format Map 77 xxii