Skripsi MADE RAI DWITYA WIRADIPUTRA

Transkripsi

1 DETEKSI MUTASI DAERAH RRDR GEN rpob PADA ISOLAT DNA SPUTUM PASIEN MULTIDRUG RESISTANTT Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGANN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP) Skripsi MADE RAI DWITYA WIRADIPUTRA JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2016

2 DETEKSI MUTASI DAERAH RRDR GEN rpob PADA ISOLAT DNA SPUTUM PASIEN MULTIDRUG RESISTANTT Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGANN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP) Skripsi MADE RAI DWITYA WIRADIPUTRA JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2016 i

3 ii

4 KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul DETEKSI MUTASI DAERAH RRDR GEN rpob PADA ISOLAT DNA SPUTUM PASIEN MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP) tepat pada waktunya. Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Penyusunan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari dukungan, bantuan, serta bimbingan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada: 1. Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M. Si., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. 2. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana. 3. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing I yang telah membantu dalam membimbing serta tak hentinya memberikan semangat dan dukungan hingga akhir penyusunan tugas akhir I ini. 4. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., selaku dosen pembimbing II yang juga telah banyak membimbing demi kelancaran penyusunan tugas akhir I ini. 5. Seluruh teknisi di Laboratorium Biologi Molekular FK UNUD, khususnya Mbok Nanik, Mok Echi, dan Bu Komang yang telah banyak memberi bantuan dan dukungan. 6. Bagian/SMF Mikrobiologi Klinik FK UNUD/RSUP Sanglah yang telah membantu dalam pengadaan sampel pada penelitian ini. 7. Seluruh dosen beserta staf/pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang telah banyak iii

5 memberikan ilmu serta dukungan sejak awal penulis mengenyam pendidikan di jurusan ini. 8. Kedua orangtua penulis, I Gede Putu Wirajaya dan Ni Luh Made Adi Gunasih, yang tak pernah henti memberi dukungan, doa, dan semangat. 9. Keluarga besar penulis yang selalu memberi dukungan serta motivasi bagi penulis. 10. Tim Tugas Akhir TB Ratih, Linda, Dektri, Widya, dan Ebi yang telah menjadi teman diskusi dan berbagi suka duka selama pembuatan Tugas Akhir. 11. Teman-teman mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana, khususnya Dioscuri Hygeia yang telah berjuang bersama penulis. 12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu. Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari berbagai pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Bukit Jimbaran, Juni 2016 Penulis iv

6 DAFTAR ISI Halaman HALAMAN SAMPUL... LEMBAR PENGESAHAN... KATA PENGANTAR... DAFTAR ISI... DAFTAR SINGKATAN... DAFTAR ISTILAH... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... ABSTRAK... i ii iii v viii x xiii xiv xv xvi BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Manfaat Keilmuan Manfaat Praktis... 6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Mycobacterium tuberculosis Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-TB)... 7 v

7 2.3 Resistensi RIF Mutasi Gen Point mutation Frameshift mutation Enzim Restriksi Pemilihan Enzim Restriksi PCR PCR-RFLP Elektroforesis BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Waktu dan Lokasi Penelitian Bahan Penelitian Alat Penelitian Prosedur Penelitian Pemilihan Enzim Restriksi Isolasi DNA dari Spesimen Sputum Pasien Amplifikasi Gen rpob MDR-TB dengan PCR Deteksi Produk PCR Digesti Produk PCR dengan Enzim Restriksi PvuII Deteksi Hasil Digesti Produk PCR Interpretasi Hasil vi

8 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pemilihan Enzim Restriksi secara In Silico Isolasi DNA M. tuberculosis Amplifikasi Fragmen pb Gen rpob M. tuberculosis dengan Teknik PCR dan Deteksi Produk PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa Optimasi Digesti Produk PCR dengan Enzim PvuII Digesti Produk PCR rpob dengan Enzim Restriksi PvuII BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN vii

9 DAFTAR SINGKATAN A ACP BSA BSC BTA C DNA DST datp dctp dgtp dntps dttp dsdna EDTA FI G INH kpb LJ MDGs : Adenine : acyl carrier protein : bovine serum albumin : biological safety cabinet : Basil tahan asam : Cytosine : Deoxyribose nucleic acid : Drug susceptibility testing : deoksiadenosin trifosfat : deoksisitidin trifosfat : deoksiguanosin trifosfat : Deoxynucleotide triphospates : deoksitimidin trifosfat : Double stranded deoxyribose nucleic acid : Ethylene diamine tetraacetic acid : Fidelity index : Guanine : Isoniazid : kilo pasang basa : Lowenstein-Jensen : Millenium Development Goals viii

10 MDR-TB MIC mrna Mtb OAT Pb PCR : Multidrug Resistant-Tuberculosis : Minimum inhibitory concentration : Messenger ribonucleic acid : Mycobacterium tuberculosis : Obat antituberkulosis : pasang basa : Polymerase Chain Reaction PCR-SSCP : Polymerase Chain Reaction Single-Stranded Conformational Polymorphism PCR-RFLP : Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism RIF RNA RRDR RT-PCR ssdna T TB TBE WHO : Rifampisin : Ribonucleic acid : Rifampicin Resistant Determinant Regio : Real Time-Polymerase Chain Reaction : Single stranded deoxyribose nucleic acid : Thymine : Tuberkulosis : Tris-Boric Acid-EDTA : World Health Organization ix

11 DAFTAR ISTILAH Amplifikasi DNA Amplikon Building block Comb : perbanyakan DNA : produk amplifikasi DNA : unit monomer penyusun komponen : alat menyerupai sisir yang digunakan untuk membentuk kolom (well) pada gel agarosa Chamber DNA polimerase DNA templat : wadah untuk meletakkan gel agarosa : enzim yang diperlukan dalam proses sintesis DNA : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan DNA ladder : DNA dengan ukuran yang diketahui dan digunakan sebagai pembanding ukuran DNA lain dalam elektroforesis Gen GenBank : urutan DNA yang menyandi suatu protein : database utama dalam biologi molekuler yang dikelola oleh NCBI Genom : keseluruhan materi genetik (DNA/RNA) pada makhluk hidup In vitro : percobaan dilakukan menyerupai sistem in vivo agar dapat memberikan hasil yang sama dengan proses in vivo In silico : dilakukan pada komputer x

12 Kodon : deret nukleotida pada mrna yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu Mutasi : terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip Nukleotida Open reading frame : unit monomer pembentuk DNA : segmen dari urutan nukleotida yang diawali dengan start kodon dan diakhiri dengan stop kodon dan memiliki panjang yang cukup untuk mengkode protein PCR : teknik perbanyakan urutan DNA dengan menggunakan reaksi enzimatis Primer : oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat Resistensi : kemampuan bakteri untuk bertahan terhadap adanya obat yang dengan konsentrasi normal dapat membunuh atau menghambat pertumbuhannya Sekuen Sekuensing : urutan DNA : proses penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA Transkripsi : proses sintesis RNA dengan menggunakan DNA sebagai templat xi

13 Tray Wildtype : alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarosa : organisme yang memunculkan karakter dalam populasi aslinya xii

14 DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1 Mutasi gen yang berperan terhadap resistensi OAT... 9 Tabel 2.2 Frekuensi mutasi pada kodon di daerah RRDR Tabel 2.3 Perbedaan tipe enzim restriksi Tabel 2.4 Rentang pemisahan pada gel agarosa Tabel 4.1 Enzim restriksi dengan situs restriksi pada titik mutasi daerah RRDR xiii

15 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Contoh missense mutation Gambar 2.2 Contoh nonsense mutation Gambar 2.3. Contoh frameshift mutation akibat delesi dan insersi Gambar 2.4 Mekanisme pemotongan DNA oleh enzim restriksi Gambar 2.5 Pemotongan enzim restriksi tipe II pada untai DNA Gambar 2.6 Tiga tahapan utama PCR Gambar 2.7 Mutasi gen yang menyebabkan inaktivasi situs pengenalan enzim restriksi Gambar 2.8 Contoh elektroforegram hasil pemotongan produk PCR dengan enzim restriksi spesifik (Fratamico et al., 2005) Gambar 3.1 Skema rancangan penelitian Gambar 4.1 Peta restriksi enzim PvuII pada fragmen rpob pb.. 40 Gambar 4.2 Elektroforegram produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer Gambar 4.3 Elektroforegram produk PCR fragmen pb DNA Mtb Isolat H37Rv, 134, DNA sputum Gambar 4.4 Elektroforegram produk PCR fragmen pb DNA Mtb Isolat P10, P11, P Gambar 4.5 Elektroforegram hasil optimasi digesti produk PCR Gambar 4.6 Elektroforegram produk digesti isolat M. tuberculosis Gambar 4.7 Elektroforegram hasil optimasi formula digesti isolat P xiv

16 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Pembuatan Larutan Lampiran 2. Skema Kerja Isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv Lampiran 3. Sekuen Nukleotida Gen rpob M. tuberculosis H37Rv Lampiran 4. Daftar enzim restriksi yang memotong pada fragmen pb gen rpob Mtb H37Rv (GenBank U ) Lampiran 5. Daftar ukuran fragmen restriksi dari hasil pemotongan enzim restriksi pada fragmen pb gen rpob Mtb H37Rv Lampiran 6. Formula amplifikasi fragmen pb gen rpob M. tuberculosis dan formula optimasi digesti produk PCR Lampiran 7. Surat keterangan kelaikan etik xv

17 ABSTRAK Resistensi terhadap rifampisin diketahui sebagai surrogate marker kejadian MDR-TB. Sebagian besar isolat M. tuberculosis yang resisten terhadap rifampisin mengalami mutasi di daerah sepanjang 81 pb pada gen rpob atau disebut dengan Rifampin Resistance Determining Region (RRDR). Berbagai metode molekuler telah dikembangkan untuk deteksi MDR-TB secara cepat berdasarkan kejadian mutasi pada daerah RRDR. Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif laboratoris yang bertujuan untuk mendeteksi mutasi daerah RRDR dari isolat DNA sputum pasien MDR-TB dengan metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi yang sesuai. Sampel penelitian diperoleh dari koleksi kultur isolat Bagian Mikrobiologi Klnik RSUP Sanglah. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi pemilihan enzim restriksi, isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv, amplifikasi fragmen gen rpob M. tuberculosis, deteksi produk PCR, digesti produk PCR dengan enzim restriksi PvuII, dan deteksi hasil digesti produk PCR. Amplifikasi fragmen pb gen rpob M. tuberculosis dilakukan terhadap DNA isolat H37Rv, 134, P10, P11, P16, DNA sputum pasien A dan B. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa enzim PvuII dapat mendeteksi mutasi pada kodon 510 dan 511 daerah RRDR M. tuberculosis dengan teknik PCR-RFLP. Beradasarkan elektroforegram hasil digesti, mutasi pada kodon 510 ditemukan pada isolat 134, sedangkan pada isolat P10, P11, dan P16 tidak ditemukan adanya mutasi pada kodon 510 maupun 511. Namun, primer pada penelitian ini belum mampu mengamplifikasi fragmen pb gen rpob M. tuberculosis secara spesifik dari isolat DNA sputum pasien MDR-TB. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa PCR-RFLP dengan enzim PvuII terbukti dapat digunakan untuk deteksi mutasi kodon 510 dan 511 daerah RRDR M. tuberculosis. Mutasi pada kodon 510 hanya ditemukan pada isolat 134. Kata kunci : MDR-TB, RRDR, mutasi, PCR-RFLP; DNA sputum xvi

18 ABSTRACT Resistance to rifampicin is known as surrogate marker of MDR-TB. Most of rifampicin resistant M. tuberculosis isolates have mutations in 81 bp of rpob gene called Rifampin Resistance Determining Region (RRDR). Various molecular techniques have been developed for rapid detection of MDR-TB based on evidence of mutations in RRDR. The aim of this laboratory explorative experiment is to detect mutation in the region of RRDR from DNA isolate of MDR-TB respiratory specimens using PCR-RFLP method with proper restriction enzyme. The samples were obtained from isolate culture collection in Clinical Microbiology Department of Sanglah Hospital. Several steps were conducted, which are: selection of restriction enzyme, DNA isolation of M. tuberculosis H37Rv isolate, amplification of fragment bp of M. tuberculosis rpob gene, detection of PCR products, digestion of PCR products using a selected restriction enzyme (PvuII), and detection of restriction fragmen t as a result of PCR product digestion. In the amplification process, DNA isolates of M. tuberculosis H37Rv, P10, P11, P16, 134, DNA isolate of MDR-TB patient s sputum A and B were used as DNA template. The result of this experiment showed that PvuII enzyme could detect mutation of codon 510 and 511 in the region of RRDR using PCR-RFLP. Mutation at codon 510 has been detected in isolate 134 while there were no mutation of codon 510 and 511 detected in P10, P11, and P16 isolates. However, the primer used in this experiment was unable to amplify fragment bp of M. tuberculosis rpob gene specifically from DNA isolate of MDR-TB patient s sputum. In conclusion, this experiment has proved the ability of PCR-RFLP with PvuII enzyme to detect mutation in codon 510 and 511 of RRDR M. tuberculosis. Mutation at codon 510 was only found in isolate 134. Keywords : MDR-TB, RRDR, mutation, PCR-RFLP; DNA of sputum xvii