Aplikasi Multiplex RT-PCR untuk Deteksi Cymbidium mosaic virus dan Odontoglossumringspot virus pada Anggrek di Jawa dan Bali

Transkripsi

1 Aplikasi Multiplex RT-PCR untuk Deteksi Cymbidium mosaic virus dan Odontoglossumringspot virus pada Anggrek di Jawa dan Bali Isna Rasdianah Aziz Program Studi Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar Abstrak Cymbidium mosaic virus (CymMV) dan Odontoglossum ringspot virus (ORSV) adalah virus tanaman yang umumnya menginfeksi tanaman anggrek. CymMV menyebabkan kelayuan pada tanaman anggrek, ukuran bunga menjadi lebih kecil, nekrosis dan dapat mengubah fenotif bunga secara drastis. Sedangkan ORSV menyebabkan color breaking dan distorsi pada bunga. Tanaman anggrek yang terinfeksi oleh kedua virus ini akan kehilangan vigor, reduksi kualitas pembungaan dan penurunan nilai komersial. Berbagai metode untuk mendeteksi CymMV dan ORSV telah banyak dilakukan. Meskipun demikian, deteksi kedua virus tersebut dengan Multiplex Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (Multiplex RT-PCR) masih jarang dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jenis tanaman anggrek yang terinfeksi CymMV dan ORSV serta mendeteksi virus tersebut dengan menggunakan metode multiplex RT-PCR. Pada tahap awal dilakukan isolasi RibonucleicAcid (RNA) dari jaringan daun yang terinfeksi virus. Hasil sampel yang positif terinfeksi virus kemudian dianalisis dengan Multiplex RT-PCR untuk mendeteksi kedua virus tersebut. Hasil penelitian menunjukkan anggrek Phalaenopsissp, Cattleyasp, dan Phaiustankertilepositif CymMV pada 669 bp dan positif ORSV pada 474 bp menggunakan metode simplex dan multiplex dengan campuran produk RNA kedua virus tersebut. Positif multiplex juga ditunjukkan dengan campuran produk cdna ORSV dan CymMV. Kata kunci : CymMV, ORSV, Multiplex RT-PCR, anggrek Abstract Cymbidium mosaic virus (CymMV) andodontoglossum ringspot virus (ORSV) are common viruses infecting orchids. CymMV causes withered orchid, flower size become smaller, necrotic, and change the phenotype of flower. While ORSV causes color breaking and flower distortion. The infected orchid will lose vigor, reduce flowering and decrease quality of commercial value. Various methods to detect CymMV and ORSV have been widely applied. Neverthless, the molecular detection of both viruses is still rare. This study aims to determine orchids infected CymMV and ORSV and also to detect virus using the Multiplex RT-PCR method. In first stage, RNA was isolated from virusinfected leaf tissue. The positive samples then analyzed by Multiplex RT-PCR to detect both of viruses. The result showed positive CymMV at 669 bp and ORSV at 474 bp infected Phalaenopsissp, Cattleyasp, dan Phaiustankertile using simplex and multiplexmethod with a mixture of both RNA viruses. Positive multiplex also shown with a mixture of their cdna product. Keyword : CymMV, ORSV, Multiplex RT-PCR, orchid 16

2 I. Pendahuluan Anggrek merupakan tanaman kosmopolitan, yaitu dapat tumbuh pada hampir semua habitat, dengan kisaran persebaran dimulai dari area tropis hingga dataran tertutup es. Karena toleransi hidupnya yang tinggi, anggrek ini menjadi satu grup terbesar di antara tumbuhan berbunga. Terdapat spesies anggrek dengan 1200 genus tersebar di 750 negara di dunia. Kurang lebih spesies anggrek di antaranya tersebar di Indonesia (Kramer, 1998; Sutarni, 2002). Anggrek mempunyai nilai ekonomis tinggi karena selain sebagai komoditas perdagangan tanaman hias, anggrek juga diketahui sebagai bahan tanaman obat dan bahan pembuatan kosmetik serta parfum (Siregar dkk., 2005). Di antara 4 kelompok anggrek di antaranya anggrek epifit, anggrek terestreal, anggrek saprofit, dan anggrek litofit, jenis anggrek epifit merupakan anggrek komersial yang sangat digemari pasar. Hal ini dikarenakan anggrek jenis ini memiliki jumlah varian banyak, bunganya besar, variasi warnanya menarik, lebih cepat beradaptasi dengan lingkungan baru, relatif mudah dalam perawatan, dan harga relatif terjangkau (Darmono, 2002). Akan tetapi, pembudidayaan anggrek tidak selalu diiringi dengan usaha pencegahan penyebaran penyakit tanaman, terutama yang disebabkan oleh virus. Virus yang menginfeksi anggrek menyebabkan kerugian pada proses pembudidayaan anggrek. Banyak gejala yang menunjukkan tanaman anggrek terserang oleh virus. Gejala infeksi virus itu sendiri sangat tergantung pada jenis virus yang menginfeksi, kultivar tanaman inang, dan keadaan lingkungan. Tanaman yang terserang penyakit akibat infeksi patogen dapat menyebabkan penghambatan atau gangguan dari aktivitas fisiologis atau perubahan struktural yang dapat menghambat pertumbuhan, abnormalitas morfologi, bahkan menyebabkan kematian bagian tanaman atau seluruh tanaman sebelum waktunya (Agrios, 2005). Virus yang paling banyak menginfeksi tanaman anggrek dan menimbulkan kerugian ekonomi adalah Cymbidium mosaic virus (CymMV) dan Odontoglossum ringspot virus (ORSV). Pola infeksi dapat bersifat individual maupun bersama, karena kedua virus tersebut memiliki karakteristik biologi dan epidemiologi yang sama (Gara and Inouye, 1996; Astua, 2003). InfeksiCymMV menyebabkan kelayuan pada tanaman anggrek, ukuran bunga menjadi lebih kecil, mengalami nekrosis dan dapat mengubah fenotip bunga secara drastis.gejala yang muncul pada daun umumnya berupa mozaik, klorosis berbentuk streak dan akhirnya mengalami nekrosis yang ditandai dengan menghitamnya jaringan (Seoh et al., 1998; ICTV, 2009; Hsuet al., 1992). ORSV menyebabkan color breakingdan distorsi (penyimpangan) pada bunga. Gejala yang muncul pada daun berupa mozaik, dengan pola garis, berbentuk cincin, dan nekrotik berbentuk cincin/ringspot (Khentryet al., 2006). Infeksi ganda dapat disebabkan karena kedua virus tersebut menyebabkan pertumbuhan tanaman menjadi tidak stabil. Berbagai gejala muncul lebih cepat dan kronis dibandingkan dengan infeksi tunggal. Penyebaran CymMV dan ORSV di lapangan terjadi melalui kontaminasi peralatan potong dan pot, inokulasi mekanis dan melalui perbanyakan vegetatif tanaman. Gejala yang muncul akibat infeksi keduanya juga sangat bervariasi tergantung pada strain virus, kultivar dan kondisi lingkungan (Lawson and Hsu, 1995; Agrios, 2005; Navalinskieneet al., 2005). Penelitian virus CymMV dan ORSV yang menginfeksi sebagian besar tanaman anggrek komersial di Indonesia telah dilakukan oleh Gara dan Inouye (1996). Deteksi CymMV dan ORSV secara molekuler pada anggrek juga dilakukan oleh Syahierah (2010) yang menyimpulkan bahwa kemampuan ORSV dalam menginfeksi 17

3 tanaman anggrek lebih cepat dibandingkan CymMV. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai metode deteksi virus CymMV dan ORSV secara cepat dan lebih akurat dibandingkan deteksi berdasarkan gejala dan sebagai upaya perlindungan tanaman anggrek terhadap virus dan sumber gen ketahanan untuk merakit varietas anggrek yang diinginkan. II. Bahan Dan Metode Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel daun anggrek yang diperoleh dari Kebun Raya Purwodadi, Kebun Raya Bogor, Kebun Raya Cibodas, Borobudur Orchid Center (BOC) Magelang, nursery Mekar Lestari dan Nia Orchid Yogyakarta, hutan adat Wonosadi di Gunung Kidul dan Taman Nasional Bali Barat. Anggrek yang menunjukkan gejala-gejala terserang virus CymMV dan ORSV dikoleksi dan dimasukkan ke dalam ice box berisi es batu atau plastik yang berisi silika gel untuk menghindari kerusakan sampel. Untuk menjaga daya tahan RNA, sampel disimpan dalam freezer pada suhu C sampai saat akan dianalisis. 1. Isolasi RNA Isolasi RNA dilakukan dengan menggunakan Total RNA Isolation Kit dengan mengacu pada petunjuk perusahaan SBS Genetech Co. Ltd., China. RNA yang diperoleh kemudian diuji secara kuantitatif dengan menghitung absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm menggunakan spektrofotometer. 2. Simplex dan Multiplex RT-PCR Reaksi RT dan amplifikasi gen CP CymMV dan ORSV dilakukan dengan menggunakan two-step RT-PCR kit (SBS Genetech Co. Ltd., China). Primer oligonukleotida yang digunakan seperti tercantum pada Tabel 1. Pada proses RT, komposisi bahan yang digunakan mengacu pada protokol RT- PCR kit dengan pencampuran 1 µl RNA isolatcymmv atau ORSVdengan 1 µl reverse primercymmv atau ORSV. Untuk metode multiplex, kedua isolat virus dan reverse primer dicampurkan. Kemudian ditambahkan bahan-bahan dengan rincian seperti tercantum pada Tabel 2. Tahapan proses RT adalah inkubasi pada suhu 42 0 C selama 60 menit dan inkubasi dilanjutkan pada suhu 94 0 C selama 5 menit kemudian stop reaction dengan meletakkan tube di dalam ice box. Pada proses PCR, komposisi bahan yang digunakan seperti tercantum pada Tabel 3. Amplifikasi DNA hasil RT dilakukan berdasarkan Lee and Chang (2006) dengan sedikit modifikasi. Formula PCR dengan menggunakan mesin ThermocyclerBoeco, Jerman dimulai dengan tahap predenaturation pada suhu 96 0 C selama 5 menit, denaturation pada suhu 96 0 C selama 1 menit, annealingpada suhu 50 0 C selama 1 menit, elongationpada suhu 72 0 C selama 2 menit. Tahap denaturation sampai elongation sebanyak 34 siklus. Dan tahap Post elongationpada suhu 72 0 C selama 7 menit. Hasil amplifikasi dipisahkan dengan elektroforesis menggunakan horizontal agarose gel electrophoresis apparatus (Biorad Laboratories Inc., USA) pada gel agarosa (SBS Genetech Co. Ltd., China) 2% dalam buffer Tris borat-edta (TBE) 1x selama 30 menit pada 100 volt. Ukuran pita DNA ditetapkan dengan menggunakan 100 bp DNA ladder. Gel direndam dalam larutan ethidium bromide selama 30 menit. Fragmen DNA diamati dengan menggunakan UV- Transilluminator (Optima Inc., Japan) dan kemudian didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital (Sony DSC W320,Swedia). 18

4 Tabel 1. Urutan nukleotida primer gen coat protein yang digunakan dalam RT-PCR (Lee and Chang, 2006) Target Primer Urutan nukleotida 5 3 Posisi Produk CymMV ORSV CymMV CP-F1 ATGGGAGAGYCCACTCCARCYCCAGC Gen CP 1-26 nt CymMV CP-R1 TTCAGTAGGGGGTGCAGGCA Gen CP nt ORSV CP-F1 ATGTCTTACACTATTACAGACCCG Gen CP 1-24 nt ORSV CP-R1 GGAAGAGGTCCAAGTAAGTCC Gen CP nt Tabel 2. Volume dan konsentrasi bahan untuk reaksi RT (SBS Genetech Co.Ltd. Komponen Volume (µl) Konsentrasi 5 x M-MLV Buffer 4 dntps 1 10 mm Rnasin 0,25 10 U 100mM DTT 2 M-MLV Reverse Transcriptase 0,5 100 U DEPC-treated water 10,25 Volume total 20 µl Tabel 3. Volume dan konsentrasi bahan untuk reaksi PCR (SBS Genetech Co.Ltd.) Komponen Volume (µl) cdna 5 Forward primercymmv (CP-F1) (10 pmol) 1 Reverse primercymmv (CP-R1) (10 pmol) 1 Forward primer ORSV (CP-F1) (10 pmol) 1 Reverse primer ORSV(CP-R1) (10 pmol) 1 10 x PCR Buffer 2 dntps (10 mm) 0,5 U-Taq DNA polymerase (1,5 U) 0,3 ddh 2 O/aquabides 8,2 669 bp 474 bp 3. Uji Penularan CymMV dan ORSV Secara Mekanis Tanaman yang digunakan untuk propagasi virus antara lain: tembakau (Nicotiana tabacum), melon (Cucumis melo), cabai rawit ( Capsicum frutescens), tomat (Solanum lycopersicum) dan Chenopodium amaranticolor. Daun tanaman tersebut 19

5 ditaburi dengan debu karborandum 600 mesh, kecuali pada tanaman kontrol, kemudian diinokulasi dengan ekstrak daun yang terinfeksi Cattleyasp.CymMV dan daun Phalaenopsis sp yang terinfeksi ORSV (1g/10ml). Pengamatan dilakukan terhadap gejala dan variasi gejala yang timbul, masa inkubasi, dan jumlah tanaman yang bergejala atau prosentase kejadian penyakit. III. Hasil Dan Pembahasan 1. Survei dan Sampling Sampel yang dikoleksi berupa daun anggrek yang menunjukkan gejala terinfeksi virus CymMV dan ORSV. Diperoleh 88 sampel daun anggrek yang dikoleksi dari 8 lokasi. Genus anggrek yang paling banyak ditemukan dengan gejala terinfeksi CymMV dan ORSV adalah genus Phalaenopsis. Berdasarkan uji molekular diperoleh 13 sampel yang positif CymMV dan ORSV. Data ini kemudian menjadi acuan untuk dilakukan metode Multiplex RT-PCR. Sampel yang diuji dipilih berdasar nilai kuantitas RNA yang paling tinggi, sehingga diharapkan dapat teramplifikasi dengan baik dan berdasarkan tipe lokasi sampel ditemukan. Hasil visualisasi dengan gel agarosa 2% pada Gambar 2 memperlihatkan munculnya fragmen DNA yang jelas pada hasil simplex. Sebaliknya pada hasil multiplex, fragmen DNA terlihat kurang jelas dan samar-samar. Bahkan pada sampel 3, hanya fragmen ORSV saja yang teramplifikasi. cdna yang diperoleh dari hasil transkripsi balik dalam tube terpisah lebih bersifat stabil sehingga lebih mudah teramplifikasi. cdna kualitas tinggi bergantung pada kualitas total RNAnya. Sampel anggrek yang digunakan diperoleh dari kebun rayapurwodadi. Uji multiplex pada sampel yang diperoleh di lokasi hutan alami ( Liparissp dan Phalaenopsissp) tidak menunjukkan hasil yang positif. Tidak ada sampel yang teramplifikasi dengan menggunakan metode two step RT-PCR. Hal ini bisa diakibatkan oleh tingkat kemurniaan RNA yang rendah, adanya kontaminan berupa DNA genom dan senyawa fenol dari anggrek serta kurangnya spesifitas dari kit yang digunakan (Akin, 2006). 2.Deteksi virus dengan analisis Multiplex RT-PCR Hasil elektroforesis dengam metode two step yang menunjukkan hasil positif simplex dan multiplex RT-PCR ditampilkan pada Gambar 1. Pada hasil simplex (Gambar 1 nomor 1 dan 2), pita DNA yang dihasilkan jelas dan sesuai dengan letak fragmen gen CP ORSV yaitu 474 bp dan CymMV yaitu 669 bp, sehingga dinyatakan hasilnya positif. Sedangkan pada hasil multiplex (Gambar 1 nomor 3 dan 4), pita DNA kedua virus juga terbentuk bersama sesuai dengan letak fragmennya. Meskipun pita yang terlihat pada hasil simplex jauh lebih terang dan jelas, amplifikasi hasil multiplex juga dapat dilakukan dengan baik. Sampel anggrek yang digunakan merupakan koleksi dari nursery. Gambar 1. Deteksi simplex dan multiplex RT- PCR pada virus CymMV dan ORSV yang divisualisasikan pada gel agarosa 2%. M: DNA Marker; 1: Positif ORSV ( Phalaenopsissp) pada 474 bp; 2: Positif CymMV ( Cattleyasp) pada 669 bp; 3: Positif multiplex dengan campuran produk RNA ORSV dan CymMV; 4: Positif multiplex dengan campuran produk cdna ORSV dan CymMV 20

6 Gambar 2. Deteksi simplex dan multiplex RT- PCR pada virus CymMV dan ORSV yang divisualisasikan pada gel agarosa 2%. M: DNA Marker; 1: Positif ORSV ( Phalaenopsissp) pada 474 bp; 2: Positif CymMV (Phaiustankertile) pada 669 bp; 3: Negatif multiplex dengan campuran produk RNA ORSV dan CymMV; 4: Positif multiplex dengan campuran produk cdna ORSV dan CymMV. Kedua uji simplex dan multiplex pada penelitian ini menunjukkan sensifitas yang sama, yaitu mampu mengamplifikasi fragmen DNA viruscymmv dan ORSV. Di samping itu, dua pasang primer CymMV dan ORSV yang digunakan menunjukkan adanya spesifitas penempelan pada sel target. Interaksi antara primer yang digunakan dalam uji multiplex biasanya berbeda pada uji simplex. Akan tetapi dengan menggunakan primer yang spesifik, masingmasing akan menempel secara spesifik dan stabil pada DNA template (Lee and Chang, 2006). Dibandingkan dengan metode simplex, kelebihan dari metode multiplex ini adalah mampu mengamplifikasi lebih dari satu sekuen, mendeteksi kedua virus secara bersamaan dan dapat diaplikasikan pada sampel yang banyak, sehingga menghemat biaya dan efesiensi waktu yang digunakan (Daryono and Natsuaki, 2011). 3. Uji Penularan CymMV dan ORSV Secara Mekanis Tanaman indikator yang menunjukkan gejala terinfeksi virus campuran antara lain: Nicotianatabacum, Capsicum frutescens dan Chenopodium amaranticolor seperti tercantum pada Tabel Infeksi Ganda CymMV dan ORSV Pada Tanaman Anggrek Untuk memperoleh isolat virus CymMV dan ORSV, virus dipropagasi pada Chenopodium amaranticolor. Dari tanaman C.amaranticolor, virus kemudian diinokulasikan ke beberapa jenis anggrek, diantaranya : Dendrobium sp, Cattleya sp, Vanda sp dan Phalaenopsis sp. Pada anggrek Dendrobiumsp, gejala yang muncul berupa klorotik dengan pola mottle (belang) yang berwarna kuning dan hijau di seluruh permukaan daun. Di samping itu, muncul ringspot berwarna hitam. Daun yang terinfeksi kedua virus ini keseluruhan akan berwarna kuning dan gugur. Gejala mozaik muncul pada anggrek Cattleya sp. Gejala ini dimulai dengan adanya klorosis berwarna kuning kecoklatan di permukaan daun dan kemudian menyebar ke seluruh permukaan daun dan menyebabkan kematian daun. Gejala ini juga disertai dengan terbentuknya cekungan. Gejala mozaik juga muncul pada anggrek Phalaenopsis sp. Gejala ini terlihat belang berwarna hijau terang dan kuning menutupi seluruh permukaan daun (Gambar 3). Anggrek Vanda sp tidak menunjukkan gejala terinfeksi virus CymMV dan ORSV. Menurut Hull (2002), jenis tanaman tertentu memiliki tingkat ketahanan yang tinggi terhadap infeksi virus. Pemberian inokulum yang tidak mencukupi atau tanaman tersebut memiliki zat penghambat tertentu menyebabkan virus tidak dapat bereplikasi pada tanaman tersebut. 21

7 Tabel 4. Respon tanaman indikator terhadap inokulasi virus campuran (ORSV dan CymMV) (Matthews, 1992) No. Jenis Gejala 1) Inkubasi Masa (hari) Kejadian Penyakit (%) 2) Tingkat Ketahanan 3) Nicotiana tabacum Nek, Klo 6 50 Rentan Capsicumfrutescens Nek, Klo Rentan Chenopodiumamaranticolor NLL, Md Rentan Cucumis melo Tg - - Mendekati imun 1) Gejala: Nek (Nekrotik), Klo (Klorosis), NLL ( Necrotic Local Lession), Md (Malformasi Daun), Tg (Tidak bergejala) 2) KP (Kejadian Penyakit): Jumlah tanaman terinfeksi/jumlah tanaman yang diinokulasi x100% 3) Tingkat Ketahanan: 0: tidak ada kejadian penyakit; 0 < x 40: agak resisten; 40 x < 100: rentan Solanum lycopersicum Tg - - Mendekati imun A B C D Gambar 3. Gejala infeksi CymMV dan ORSV pada berbagai jenis anggrek. Anggrek Dendrobium sp. menunjukkan gejala klorotik dengan bercak-bercak kuning di permukaan daun (A) dan juga ringspot berwarna hitam (B). Gejala mozaik muncul pada anggrek Cattleyasp (C) dan juga pada anggrek Phalaenopsis sp dengan pola mottle (D) IV. Kesimpulan CymMV dan ORSV telah menginfeksi anggrek Phalaenopsissp, Cattleyasp, Phaiustankertile dan Liparissp yang ditemukan di kebun raya, nursery dan hutan alam di Jawa dan Bali. Dengan metode Multiplex RT-PCR, kedua virus tersebut dapat dideteksi dengan cepat dan akurat. Uji kisaran inang CymMV dan ORSV mampu 22

8 menginfeksi Nicotiana tabacum, Capsicumfrustescens dan Chenopodium amaranticolor. Sedangkan uji patogenitas CymMV dan ORSV pada anggrek Dendrobiumsp, Cattleyasp dan Phalaenopsis sp menunjukkan gejala klorotik, ringspot hitam dan mozaik belang. DAFTAR PUSTAKA Agrios, G. N. (2005). Plant Pathology. Ed ke-5. New York: Academic Press. Akin, H. M. (2006). Virologi Tumbuhan. Penerbit Kanisius: Yogyakarta. Astua, J. F. (2003). Orchid viruses. The Bulletin of American Orchid Society. Darmono, W. (2002). Menghasilkan Anggrek Silangan. Penebar Swadaya: Jakarta. Daryono, B. S. and Natsuaki, K. T. (2011). Application of Multiplex RT-PCR for Detection of Cucurbit-infecting Tobamovirus. Indonesian Journal of Biotechnology. 16 (1): Gara, I.W and Inouye, N. (1996). Detection and identification of viruses of orchids in Indonesia. Bull. Res. Inst. Bioresour. 4 : Hull, R. (2002). Matthews Plant Virology. Ed ke- 4. San Diego: Academic Press Hollings,M. (2007). Chenopodium amaranticolor as a test plant for plant viruses. Wiley online library. Plant Pathology. Vol 5 (2): Hsu, H.T., Vongsasitorn, D and Lawson, R.H. (1992). An improved method for serological detection of cymbidium mosaic potexvirus infection in orchids. Phytopathology 82 : International Comittee on Taxonomy of Viruses (ICTV). (2009). The Universal Virus Database : Cymbidium mosaic virus. Khentry, Y., Paradormuwat A., Tantiwitat, S., Phansiri, S and Thaveechai N. (2006).Incidence of Cymbidium mosaic virus and Odontoglossumringspot virus indendrobium spp. In Thailand. Crop Protection 25: Kramer, J. (1998). Botanical Orchids and How to Grow Them. Antique Collectors' Club Ltd. UK Lawson, R.H and Hsu, H.T. (1995). Orchid. Di dalam: Loebenstein G, Lawson RH, Brunt AA,editor. Virus and Virus-like Diseases of Bulb and Flower Crops. Chichester, UK: John Wiley and Sons Lee, S.C. and Chang, Y.C. (2006). Multiplex RT- PCR detection of two orchid viruses with an internal control of plant nad5 mrna. Plant Pathology Bulletin 15: Matthews, REF. (1992). Plant Fundamental of Plant Virology. California: Academic Press Navalinskiene, M., Raugalas, J and Samuitien, M. (2005). Viral diseases of flower plants 16. Identification of virus affecting orchids Cymbidium Sw. Biologija 2: Siregar, C., Listiawati, A dan Purwaningsih. (2005). Anggrek Spesies Kalimantan Barat. Volume 1. LP3-KB. Jayakarta Agung Offset. Pontianak Seoh, M. L., Wong, S. M and Zhang, L. (1998). Simultaneous TD/RT-PCR detection of cymbidium mosaic potexvirus and odontoglossumringspottobamovirus with a single pair of primers. J. Virol. Methods 72: Sutarni, M. (2002). Merawat Anggrek. Kanisius: Yogyakarta. Syahierah, P. (2010). Respon Berbagai Jenis Anggrek ( Orchidaceae) Terhadap Infeksi Cymbidium Mosaic Virus (CymMV) dan OdontoglossumRingspot Virus (ORSV) Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian, ITB. Bogor. 23