ANALISIS PROTEIN MEMBRAN SPERMATOZOA SAPI ABERDEEN- ANGUS, SAPI BALI, DAN SAPI ONGOLE SEBAGAI PENDEKATAN KEKERABATAN SAPI

Transkripsi

1 ANALISIS PROTEIN MEMBRAN SPERMATOZOA SAPI ABERDEEN- ANGUS, SAPI BALI, DAN SAPI ONGOLE SEBAGAI PENDEKATAN KEKERABATAN SAPI ABERDEEN-ANGUS, BALI, AND ONGOLE BULL S MEMBRANE SPERMATOZOA ANALYSIS AS A STUDY IN BULL S GENETIC RELATIONSHIP Ratna Dwi Ramadani, Sofia Ery Rahayu 2, Umie Lestari 1 Jurusan Biologi Universitas Negeri Malang ratnadwiramadani@gmail.com ABSTRACT Generally, livestock s breeding could make both possitive and negative effects if done without pay few attention on it s genetic relationship. Therefore, livestock s genetic relationship characterization, especially in bull is crucial to be observed so that we could manage the appropriate breeding system. The purposes of this research are to describe the Aberdeen-Angus, Bali, and Ongole bull s sperm membrane protein profile and observe its polymorphismic protein to determine the compared bull s genetic relationship. To analyze the bull s sperm membrane protein had been done by comparing the protein testicular spermatozoa with molecule mass around 16 kda, 33 kda, kda, 64 kda and 75 kda, that are the results of sperm nuclear DNA expression. Based on the result of electrophoresis SDS-PAGE, it have been known that Aberdeen-angus bull has the expression of doppel protein (34-38 kda) and PH-20 Hyaluronidase protein (75 kda), besides Bali bull just has the expression of doppel protein. In the other hand, Ongole bull has the expression of doppel protein and phospholipase A 2 protein (16 kda). Genetic relationship estimation among Aberdeen-Angus, Bali and Ongole bulls conducted by doing cluster analysis using MVSP 3.22 program to obtain a dendogram as the result. Based on the dendogram, could be estimated that Bali bull has a close genetic relationship with Aberdeen-angus bull, in the other hand, both of them estimated to have such as a distant genetic relationship with Ongole bull. Keywords: Protein Analysis, Bull s Membrane Spermatozoa, Genetic Relationship, Bull s Breeding Systems. PENDAHULUAN Salah satu upaya peningkatan potensi produksi ternak sapi lokal Indonesia adalah dengan memperhatikan sistem perkawinan sapi. Sistem perkawinan hewan ternak dapat menimbulkan dampak positif dan negatif apabila dilakukan tanpa memperhatikan kekerabatan hewan ternak. Studi hubungan kekerabatan antara suatu makhluk hidup dapat diketahui melalui pengamatan morfologi dan anatomi serta melalui pengamatan molekular dalam kajian filogenetik (Hidayat, dkk. 2006). Pengamatan hubungan kekerabatan berdasarkan kajian filogenetik melalui pengamatan terhadap variasi genetik pada hewan ternak, khususnya pada sapi, seringkali dilakukan dengan mengamati polimorfisme protein (Johari, dkk. (2007); Lisnawati (2011); Noviani, dkk. (2013); Riztyan (2000)). Polimorfisme protein merupakan studi mengenai

2 karakteristik dari berbagai protein, yang dapat dipelajari dari struktur protein atau enzim yang dihasilkan karena perbedaan basa nukleotida dalam DNA. Polimorfisme protein sangat berguna untuk membantu penentuan asal-usul serta menyusun hubungan filogenetis makhluk hidup intraspesies maupun interspesies. Pada penelitian ini diamati polimorfisme protein membran spermatozoa sapi dalam estimasi hubungan kekerabatan. Protein membran spesifik spermatozoa digunakan sebagai dasar dalam estimasi hubungan kekerabatan, protein-protein tersebut diantaranya protein membran spermatozoa yang terekspresi di testis selama spermatogenesis, bukan protein-protein yang terbentuk ketika spermatozoa berada pada saluran reproduksi jantan (epididimis, vesikula seminalis, kelenjar prostat, dan kelenjar cowper) (Johnson and Everitt, 2007). Pengamatan protein spesifik didasarkan pada karakter spermatozoa yang DNA stabil akibat ikatan disulfida yang kuat DNA dengan protamin sehingga spermatozoa tidak akan mengalami sintesis protein hingga spermatozoa membuahi sel telur. Oleh karena itu, susunan protein struktural membran spermatozoa tidak mengalami perubahan hingga spermatozoa membuahi ovum (Yu, 2008). Protein spesifik spermatozoa yang digunakan sebagai protein pembanding pada penelitian kali ini diantaranya adalah protein doppel yang dikode oleh gen prnd dengan berat protein kda (Rondena et al., 2006), protein perlekatan kalsium (calciumbinding protein) yang merupakan protein integral akrosomal membran spermatozoa bovine dengan berat molekul 64 kda (Nadgas et al., 2013), protein perlekatan sel telur (ovum binding protein) atau Phospholipase A 2 dengan berat molekul 16 kda (Marques et al., 2000), protein tirosin terfosforilasi (tyrosin phosphorylated protein) yang memiliki berat molekul 33 kda (Harayama et al., 2010) serta protein PH-20 hyaluronidase dengan berat molekul 75 kda (Lalancette et al., 2001). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui profil protein membran spermatozoa sapi Aberdeen- Angus, Sapi Bali, dan Sapi Ongole serta mengamati polimorfisme proteinnya untuk mengkaji hubungan kekerabatan antara sapi yang dibandingkan. MATERI DAN METODE Materi penelitian ini adalah semen beku Sapi Aberdeen-Angus, Sapi Bali, dan Sapi Ongole yang diperoleh dari Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari Malang. Semen beku yang diperoleh disimpan dalam nitrogen cair sebelum diisolasi untuk menghindari kerusakan semen selama transportasi. Semen sapi diencerkan (thawing) dengan direndam pada air suhu C (15-30 menit). Isolasi Protein Membran Spermatozoa Sapi Isolasi protein membran spermatozoa dilakukan berdasarkan petunjuk dalam Lestari (2008), dimana: 2 ml semen spermatozoa sapi diperoleh dari 9 straw semen sapi, semen dicuci dengan menggunakan PBS hingga dua kali pencucian dengan sentrifugasi

3 3000 rpm (10 menit). Pellet hasil sentrifugasi di rendam dalam BO cafein dan diinkubasi 36,5 37 o C (20 menit). Isolasi protein membran spermatozoa sapi, menggunakan Tuenn dan PMSF, selajutnya proses homogenasi larutan dengan menggunakan vortex (10 menit) dan sonikasi (2x10 menit) untuk membantu lysis protein membrannya. Sentrifugasi dingin dilakukan pada suhu 4 o C dengan kecepatan rpm selama 2x10 menit. Presipitasi protein membran spermatozoa dilakukan dengan menambahkan etanol absolut dingin, selanjutnya ditambah etanol dan dikeringanginkan. Endapan di dasar tabung eppendorf 2 ml ditambahkan buffer Tris-Cl dan disimpan pada suhu -20 o C. Elektroforesis SDS-PAGE Crude Protein Membran Spermatozoa Sapi Pada penelitian ini elektroforesis SDS-PAGE dilakukan dengan konsentrasi separating gel 12,5% dan stacking gel 3% menurut Lestari (2008). Separating gel 12,5% mengandung 30% acrylamide-bis; 1,5 M Tris ph 8,8; demineralized water; SDS 10%; APS 10%; serta TEMED. Sementara stacking gel 3% mengandung 30% acrylamide-bis; 0,5 M Tris ph 6,8; demineralized water; SDS 10%; APS 10%; serta TEMED. Sebelum dielektroforesis, crude protein membran spermatozoa sapi diukur konsentrasi dengan menggunakan NANODROP spektrofotometer dan disamakan konsentrasinya melalui pengenceran. Selanjutnya, crude protein ditambah RSB dengan perbandingan 1:1 dan dipanaskan selama 5 menit pada suhu 95 o C. Protein marker yang digunakan dalam penelitian ini adalah marker protein Spectra TM Multicolor Broad Range Protein Ladder SM1841. Proses elektroforesis dilakukan dengan tegangan 130 V dan kuat arus 60 ma (running elektroforesis per-2 gel). Gel hasil elektroforesis diwarna dengan commasie brilliant blue, methanol absolut, asam asetat glasial, dan demineralized water selama menit. Proses penghilangan warna dilakukan menggunakan destaining buffer yang mengandung methanol absolut, asam asetat glasial, dan demineralized water. Pencucian dengan destaining water dilakukan selama 3 hari 3 malam. Analisis Data Dilakukan perbandingan polimorfisme protein membran spesifik spermatozoa sapi dengan berat molekul 16 kda, 33 kda, kda, 64 kda, dan 75 kda pada ketiga jenis sapi. Selanjutnya berdasarkan profil protein spesifik spermatozoa dilakuakan analisis kluster (cluster analysis) dengan menggunakan program Multivariate Statistical Package (MVSP) Hasil analisis kluster menggunakan MVSP 3.22 adalah dendogram yang menggambarkan estimasi hubungan kekerabatan sapi.

4 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil elektroforesis SDS-PAGE crude protein membran spermatozoa Sapi Aberdeen-Angus, Sapi Bali, dan Sapi Ongole dapat dilihat pada Gambar 1 di bawah ini., Gambar 1. (a)gambar Hasil Elektroforesis SDS-PAGE (b) Zimogram Hasil Elektro-foresis SDS PAGE, (AA) Crude Protein Sapi Aberdeen-Angus, (B) Crude Protein Sapi Bali, (M) Protein Marker Spectra TM Multicolor Broad Range Protein Ladder SM184, (O) Crude Protein Sapi Ongole. Hasil elektroforesis crude protein Sapi Aberdeen-Angus menunjukkan bahwa protein yang terbentuk pada separating gel sejumlah 11 band protein dengan berat molekul diantaranya: 179,6 kda; 82,4 kda; 75 kda; 37,8 kda; 15,01 kda; 14,3 kda; 13,6 kda; 12,36 kda; 11,29 kda; 10,7 kda dan 9,7 kda. Hasil elektroforesis crude protein Sapi Bali terbentuk 9 band protein pada separating gel dengan berat molekul 199,2 kda; 82,2 kda; 71,5 kda; 37,2 kda; 15,4 kda; 14,7 kda; 12,2 kda; 11,1 kda dan 10,6 kda. Sementara itu, Hasil elektroforesis SDS-PAGE pada crude protein Sapi Ongole menggambarkan terbentuknya 11 band protein. Berdasarkan hasil penghitungan berat molekul protein diketahui bahwa protein-protein tersebut memiliki berat molekul 198,4 kda; 83,7 kda; 72,5 kda; 37,0 kda; 15,6 kda; 14,9 kda; 12,3 kda; 11,7 kda; 11,2 kda dan 10,6 kda. Berikut di bawah ini merupakan gambar hasil elektroforesis SDS-PAGE., Pada penelitian ini, estimasi hubungan kekerabatan antara Sapi Aberdeen- Angus, Sapi Bali dan Sapi Ongole dilakukan dengan membandingkan profil protein membran spesifik spermatozoa sapi sebagai protein pembanding. Protein spesifik spermatozoa sapi yang diamati diantaranya: (1) protein doppel (34-38 kda), (2) calcium-binding protein (64 kda), (3) Phospholipase A 2 protein (16 kda), tyrosin phosphorylated protein (33 kda), serta (4) protein PH-20 hyaluronidase (75 kda).

5 Protein spesifik membran spermatozoa merupakan hasil sintesis protein yang terjadi selama tahapan mitosis dan meiosis selama spermatogenesis, yang selanjutnya dipergunakan untuk pembentukan protein struktural, enzim, dan hormon. Sintesis protein pada spermatozoa terhenti pada tahap akhir spermiogenesis. Analisa profil protein penanda dapat dilihat pada tabel 1., Tabel 1. Tabel Analisa Profil Protein Spesific Spermatozoa antara Sapi Aberdeen-Angus, Sapi Bali, dan Sapi Ongole Dalam Pendekatan Kekerabatan Sapi Protein No Jenis Sapi 16 kda (A 2 ) 33 kda (TPP) kda (Dop) 64 kda (CBP) 75 kda (PH-20) 1 Sapi Aberdeen-angus ~ ~ ~ 2 Sapi Bali ~ ~ ~ ~ 3 Sapi Ongole ~ ~ ~ Keterangan: A 2 TPP Dop CBP : Protein perlekatan sel telur : Tyrosine Phosphorilated Protein : Protein Doppel : Calcium Binding Protein PH-20 : Protein PH-20 Hyaluronidase = Terdapat protein ~ = Tidak terdapat protein Gambar 2. Gambar Dendogram Hubungan Kekerabatan Sapi Berdasarkan Analisis Protein Membran Spermatozoa Sapi Aberdeen-Angus, Sapi Bali dan Sapi Ongole. Berdasarkan Tabel 1 diketahui bahwa Protein Doppel terekspresi pada spermatozoa ketiga sapi, yakni Sapi Aberdeen-Angus, Sapi Bali, dan Sapi Ongole. Protein PH-20 Hyaluronidase (75 kda) hanya terekspresi pada spermatozoa Sapi Aberdeen-Angus. Selain itu, phospholipase A 2 protein (16 kda) hanya terekspresi pada spermatozoa Sapi Ongole. Berdasarkan keberadaan protein pembanding, dilakukan analisa kluster (cluster analysis) untuk mengestimasi kedekatan hubungan antara sapi yang dibandingkan dengan memanfaatkan program MVSP 3.22 yang akan

6 menghasilkan dendogram (Gambar 2), dari gambaran dendogram dapat diketahui estimasi kedekatan hubungan antara Sapi Aberdeen-Angus, Sapi Bali, dan Sapi Ongole. Berdasarkan dendogram dapat diketahui bahwa Sapi Bali diestimasikan memiliki hubungan kekerabatan yang lebih dekat dengan Sapi Aberdeen-Angus, indeks similiaritas antara kedua jenis sapi ini adalah 0,8. Hal tersebut menggambarkan ekspresi protein spesifik spermatozoa antara Sapi Aberdeen-Angus dan Sapi Bali memiliki 80% kemiripan. Sementara itu Sapi Bali dan Sapi Aberdeen-Angus dengan Sapi Ongole memiliki indeks similiaritas 0,7 yang menandakan kemiripan ekspresi protein antara ketiganya mencapai 70%, sehingga Sapi Bali dan Aberden-angus diestimasikan memiliki hubungan kekerabatan yang jauh dengan Sapi Ongole. Kedekatan hubungan antar hewan, merupakan salah satu hal yang penting untuk diperhatikan dalam upaya pemuliabiakan ternak, untuk dapat menentukan teknik perkawinan (breeding) yang tepat bagi hewan ternak. Berdasarkan profil protein membran spermatozoa diketahui bahwa sistem perkawinan sapi yang tepat bagi ketiga jenis sapi tersebut diatas berdasarkan profil protein membran spermatozoanya adalah perkawinan antara sapi Bali dengan Sapi Ongole dan Sapi Aberdeen-angus dengan Sapi Ongole yang memiliki hubungan kekerabatan yang lebih jauh. Perkawinan antara hewan yang memiliki hubungan kekerabatan jauh dikenal sebagai cross breeding atau perkawinan silang. Peningkatan kualitas sapi akibat cross breeding dapat terjadi akibat adanya gabungan sifat unggul dari induknya yang biasa disebut heterosis atau hybrid vigour. Perkawinan cross breeding memiliki dampak positif berupa peningkatan kualitas hewan ternak hasil perkawinan serta peningkatan variasi genetik hewan ternak hasil perkawinan. Hasil persilangan antara Sapi Aberdeen-angus dan Sapi Bali yang diperkirakan memiliki hubungan kekerabatan relatif lebih dekat didasarkan pada polimorfisme protein membran spermatozoanya dikawinkan, maka besar kemungkinan akan terjadi perkawinan inbreeding. Perkawinan inbreeding akan menyebabkan penurunan keragaman genetik dalam populasi. Selain itu, filial pertama hasil perkawinan inbreeding kemungkinan memiliki kondisi fisik yang lemah (viabilitas rendah) serta sulit memperoleh keturunan (mandul) (Christine et al., 1983). KESIMPULAN 1. Hasil elektroforesis SDS-PAGE pada crude protein membran spermatozoa Sapi Aberdeen-angus, Sapi Bali dan Sapi Ongole menunjukkan bahwa Sapi Aberdeen- Angus memiliki ekspresi Protein Doppel dengan berat molekul kda dan Protein PH-20 Hyaluronidase dengan berat molekul 75 kda. Sapi Bali hanya memiliki ekpresi Protein Doppel (34-38 kda). Sementara Sapi Ongole memiliki ekpresi Protein Phospholipase A 2 dengan berat molekul 16 kda dan Protein Doppel (34-38 kda). 2. Berdasarkan profil protein membran spermatozoa diketahui bahwa Sapi Bali diestimasikan berkerabat dekat dengan Sapi Aberdeen-angus, sementara kedua sapi tersebut diestimasikan memiliki kekerabatan yang lebih jauh jika dibandingkan dengan Sapi Ongole.

7 SARAN 1. Dilakukan penelitian serupa dengan menambah jumlah individu sapi yang dianalisa polimorfisme proteinnya agar dapat diketahui variasi genetik antar jenis sapi. 2. Dilakukan penelitian pengembangan dari penelitian ini, dengan menganalisa protein yang diekspresikan oleh sel somatik duktus genital jantan sebagai dasar dalam estimasi hubungan kekerabatan antara hewan ternak. DAFTAR RUJUKAN Balhorn, Rod Protein Family Review: The Protamine Family of Sperm Nuclear Proteins. Genome Biology (8) : 227. Christine M. S., Cox S. M., Chambers B., Macbryde L., Thomas Genetics and Conservation. California: Benjamin/ cummings publishing. Hecht, N., Cavalcanti, M. C. O., Nayudu, P., Behr, R., Reichenbach, M., Weidner, W. and Steger, K Protamine-1 Represents a Sperm Spesific Gene Transcript: a Study in Callithrix jacchus and Bos taurus. Andrologia (41) : 1-7 Hidayat, T. dan Pancoro, A Sistematika dan Filogenetika Molekuler. Makalah Disajikan Pada Kursus Singkat Aplikasi Perangkat Lunak PAUP dan MrBayers Untuk Penelitian Filogenetika Molekuler SITH-ITB, Bandung, Desember Johari, S., Kurnianto, E., Sutopo, Aminah, S Keragaman Protein Darah Sebagai Parameter Biogenetik Pada Sapi Jawa. J. Indon. Trop. Anim. Agric 32(2): Johnson, M. H. and Everitt, B. J Essential Reproduction. Sixth Edition. Garshington Road UK: Blackwell Publishing. Lalancette, C., Dorval, V., Leblanc, V. and Leders, P Characterization of an 80- kilodalton Bull Sperm Protein Identified as PH-20. Biology of Reproduction 65(2): Lestari, Umie Karakterisasi Dan Spesifikasi Protein Membran Spermatozoa Manusia Dan Antibodi Hasil Induksinya Untuk Pengembangan Kandidat Bahan Imunokontrasepsi. Disertasi Tidak Diterbitkan. Malang: Pasca Sarjana Universitas Brawijaya Malang. Lisnawati, Priskila Analisis Keragaman Genetik Protein Darah Kuda Lokal Sulawesi Utara Dengan Menggunakan Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE). Skripsi Tidak Diterbitkan. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Marques, V. A., Goulart, L.R. and Silva, A. E. D. F Variation of Protein Profiles and Calcium and Phospholipase A 2 Concentration in Thawed Bovine Semen and Their Relation to Acrosome Reaction. Genetics and Molecular Biology 23(4): Nadgas, S.K., Buchanan, T. and MCCashill, S., Mackey, J., Alvarez, G. E. and Raychoudhury, S Isolation of a Calcium Binding Protein of Acrosomal Membrane of Bovine Spermatozoa. Int J Biochem Cell Biol 45(4):

8 Noviani, F., Sutopo dan Kurnianto, E Hubungan Genetik Antara Domba Wonosobo (Dombos), Domba Ekor Tipis (DET) dan Domba Batur (Dombat) Melalui Analisis Polimorfisme Protein Darah. Sains Peternakan 11(1): 1-9 Riztyan Konstitusi Gen Pada Protein Putih Telur Burung Puyuh Sebagai Dasar Dalam Klasifikasi. J. Indon. Trop. Anim. Agric. 30(1): Rondena, M., Ceciliani, F., Comazzi, S., Pocacqua, V., Bazocchi, C., Luvoni, C., Chigioni, S. and Paltrinieri, S Identification of Bovine Doppel Protein in Testis, Ovary and Ejaculated Spermatozoa. Theriogenology (63): Shaman, J. A. and Ward, W. S Sperm Chromatin Stability And Susceptibility To Damage In Relation To Its Structure. The Sperm Cell (Production, Maturation, Fertilization, Regeneration) : Warwick, E. J., Astuti, J. M. dan Hardjosubroto, W Pemuliaan Ternak. Yogyakarta: Gajahmada University Press. Yu, Yang The Identification and Characterization of an Inner Acrosomal Membrane Associated Protein, IAM38, Responsible for Secondary Sperm-Zona Binding During Fertilization. Thesis tidak diterbitkan. Canada: Queen s University Press.

9