ANALISIS PROTEIN DARAH KERBAU LOKAL

Transkripsi

1 ANALISIS PROTEIN DARAH KERBAU LOKAL (Bubalus bubalis) DI WILAYAH LUMAJANG DAN BANGKALAN DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SEBAGAI PENDEKATAN KEKERABATAN Ayun Wintari, M. Amin, Umie Lestari. Jurusan Biologi Universitas Negeri Malang ABSTRAK Sejak tahun 2009 hingga 2012, populasi ternak kerbau cenderung menurun, terutama di Jawa Timur. Berbagai upaya untuk meningkatan jumlah populasi telah dilakukan. Salah satunya adalah melalui teknik persilangan (breeding). Akan tetapi sejauh ini hasil yang diperoleh dari persilangan tersebut belum mampu meningkatkan jumlah populasi ternak kerbau yang ada. Kondisi ini diduga disebabkan oleh masih rendahnya mutu genetik akibat adanya perkawinan sejenis (inbreeding) dalam suatu populasi. Oleh sebab itu diperlukan teknik dan jenis persilangan yang tepat untuk membantu meningkatkan mutu genetik kerbau, yaitu dengan melihat hubungan kekerabatan tiap individu kerbau dari masing-masing populasi. Untuk dapat melihat hubungan kekerabatan tersebut maka perlu dilakukan studi molekuler, melalui pengamatan profil protein spesifik dalam darah. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan estimasi hubungan kekerabatan kerbau di Lumajang dan Bangkalan melalui analisis profil protein spesifik darah. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif. Darah kerbau dari kedua populasi dipisahkan menjadi plasma darah dan eritrosit. Bagian plasma di purifikasi dan selanjutnya di elektroforesis sehingga menghasilkan pita protein spesifik meliputi hemoglobin (64-66 kda), transferin (79-85 kda), dan post-transferin ( kda). Selanjutnya dianalisis menggunakan (cluster analysis) MVSP dan GENEPOP 4.2 untuk mendapatkan estimasi hubungan kekerabatan dan variasi ekspresi protein. Hasil penelitian diketahui bahwa frekuensi ekspresi protein kerbau dari dua populasi yaitu ekspresi transferin pada populasi Bangkalan dan post-transferin dari populasi Lumajang lebih variatif dibandingkan ekspresi hemoglobin. Berdasarkan dendogram hasil analisis filogeni rekomendasi persilangan yang dapat dilakukan adalah individu Bangkalan 4 disilangkan dengan semua individu dari kedua populasi. Individu Lumajang 4, Bangkalan 1, dan Lumajang 2 tidak dapat saling disilangkan dengan Individu Bangkalan 2, Lumajang 3, Bangkalan 3 serta Lumajang 1, karena individu-individu tersebut memiliki hubungan kekerabatan yang dekat. Kata Kunci: analisis protein, protein darah, hubungan genetik, keragaman genetik Ternak kerbau mempunyai fungsi dan peranan penting dalam sistem usaha tani di Indonesia. Pengolahan lahan pertanian dengan menggunakan ternak kerbau, masih tetap bertahan hampir di seluruh Indonesia, termasuk Jawa Timur. Kerbau di Pulau Jawa mengalami penurunan terutama terjadi di Jawa Timur. Dinas Peternakan Jawa Timur tahun 2009 hingga 2012, mencatat laju pertumbuhan populasi kerbau di Jawa Timur hanya 0% yaitu berjumlah ekor. Madura merupakan wilayah di Jawa Timur. Salah satu daerah yang memiliki populasi kerbau terbesar di Madura adalah kabupaten Bangkalan. Pada tahun 2009 jumlah populasi kerbau sebesar ekor dan pada tahun 2012 menurun menjadi ekor. Penurunan jumlah populasi kerbau di kabupaten Bangkalan ini dikarenakan beberapa faktor, seperti tidak adanya pasar kerbau untuk melakukan transaksi jual beli kerbau di daerah tersebut. Kabupaten Lumajang merupakan daerah di Jawa Timur memiliki kerbau dengan jumlah selalu meningkat setiap tahunnya, yaitu mulai tahun 2009 sejumlah 3319 ekor hingga 2012 menjadi

2 2 ekor (Dinas Peternakan Prov. Jawa Timur, 2013). Peningkatan tersebut antara lain karena sebagian besar lahan kecamatan di Lumajang merupakan lahan sawah yang sangat mendukung ketersedian pakan untuk kerbau, khususnya jerami padi yang melimpah. Di wilayah tersebut meskipun terdapat lebih banyak kerbau dibandingkan wilayah lain di Jawa Timur, secara keseluruhan lebih sedikit jika dibandingkan dengan hewan ternak lain seperti sapi potong dan sapi perah. Pertumbuhan populasi kerbau yang rendah juga dikarenakan kurangnya pengetahuan para peternak kerbau dalam manajemen breeding. Selama ini teknik breeding yang dilakukan masih terbatas pada jenis persilangan kerbau dalam satu populasi yang sama, sehingga menghasilkan anakan dengan mutu genetik rendah sebagai akibat peristiwa inbreeding itu sendiri. Kondisi yang demikian apabila dibiarkan terjadi akan mengancam sumberdaya genetik kerbau, oleh sebab itu diperlukan upaya untuk mempertahankan kelestarian ternak kerbau dalam rangka meningkatkan sumber daya genetiknya. Salah satu upaya peningkatan sumberdaya genetik kerbau dapat dilakukan melalui perbaikan manajemen breeding. Induk kerbau yang memiliki kemampuan reproduksi dan pertumbuhan yang baik perlu dilestarikan untuk dijadikan bibit agar populasi kerbau dapat ditingkatkan, karena betina produktif merupakan sumber daya genetik dalam mengembangbiakan populasi ternak, untuk itu harus dijaga kelestarian dan ketersediaannya. Hal tersebut dilakukan sebagai langkah awal bagi konservasi hewan tersebut. Untuk keberhasilan upaya konservasi dan pembibitan kerbau lokal maka perlu dilakukan identifikasi variasi genetik. Identifikasi variasi genetik melalui pendekatan molekuler dapat diketahui berdasarkan pola profil protein yang terdapat dalam darah. Mwacharo (2007) menyatakan bahwa polimorfisme protein sebagai bentuk ekspresi fenotip gen, akan menunjukkan lokus-lokus yang mengkodekan suatu protein. Penelitian menggunakan polimorfisme protein darah untuk mengetahui keragaman genetik sudah dilakukan diantaranya pada populasi ayam kedu (Johari, dkk. 2008), populasi ikan gurami (Oktarianti, dkk 2007), populasi ikan nila di kabupaten Jember (Widiasworo, 2002), populasi kuda Sulawesi Utara (Lisnawati, 2011) dan pada ikan lele (Suratno, dkk. 2001). Hasinah, dkk. (2007) menyatakan bahwa polimorfisme protein darah diatur secara genetis, sehingga mampu menggambarkan perbedaan-perbedaan sifat biokimia (biochemical variant), yang dapat dilihat dengan adanya variasi di dalam protein plasma atau serum darah (misalnya albumin, transferin, dan alkaline phosphatase) dan sel darah merah (haemoglobin, peptidase B, dan acid phospatase). Teknik elektroforesis SDS PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk analisis protein. Elektroforesis pada prinsipnya berfungsi sebagai saringan molekul, proporsional yang memungkinkan pemisahan polipeptida hanya berdasarkan atas berat molekulnya. Keuntungan penggunaan data berbasis molekuler adalah tinggi tingkat keakuratan datanya. Dengan demikian data genetis yang dihasilkan dapat membantu untuk menentukan kebijakan dalam pemuliaan ternak. Pertimbangan proses breeding yang dilakukan, tidak hanya didasarkan pada bentuk fenotip saja tetapi juga mempertimbangkan faktor genetisnya. Selain itu manajemen breeding dapat ditentukan dengan analisis kekerabatan menggunakan protein darah.

3 3 MATERI DAN METODE Materi pada penelitian ini adalah sampel darah 8 ekor kerbau lokal dari dua wilayah yaitu Lumajang dan Bangkalan. Darah yang diperoleh di beri EDTA sebagai anti koagulan, kemudian disimpan pada suhu -20 C. Profil protein yang digunakan sebagai pembanding adalah protein spesifik pada plasma darah (transferin, post-transferin) dan eritrosit (hemoglobin). Variasi ekspresi protein dan hubungan kekerabatan populasi kerbau di wilayah Lumajang dan Bangkalan diperoleh melalui analisis profil dan polimorfisme protein dengan teknik elektroforesis. Pemisahan Darah untuk Mendapatkan Plasma Darah dan Eritrosit Sampel darah disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan rpm pada suhu 4 o C. Sampel darah akan terpisah antara plasma darah dan sel darah merah. Masing-masing bagian tersebut dimasukkan dalam mikrotube, kemudian dilakukan pencucian untuk sel darah merah. Pencucian sel darah merah dilakukan dengan menambahkan larutan Natrium Chloride 0,9% dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit pada suhu 4 o C dan pencucian sel darah merah tersebut dilakukan 3 kali, kemudian disimpan dalam freezer pada suhu -20 C. Purifikasi Plasma Darah Metode purifikasi plasma darah yang dilakukan pada penelitian ini sesuai dengan Lestari (2008). Plasma darah diambil sebanyak 300 µl ditambahkan SAS 50% sebanyak 300 µl (1:1) lalu di vortex. Selanjutnya dilakukan sentrifuse dengan kecepatan rpm selama 10 menit pada suhu 4 C. Bagian supernatan dibuang hingga menyisakan bagian pellet. Bagian pellet tersebut kemudian ditambahkan etanol absolute dingin dengan perbandingan 1:1, lalu diinkubasi dalam refrigerator selama 24 jam (overnight). Selanjutnya dilakukan kembali sentrifuse dengan kecepatan rpm, selama 10 menit, pada suhu 4 C. Kemudian membuang supernatannya dan mengering anginkan pellet hingga bau etanol hilang, dan ditambahkan buffer Tris-Cl ph 6,8 dengan perbandingan 1:1, untuk selanjutnya disimpan dalam freezer dengan suhu -20 C. Elektroforesis SDS-PAGE Protein Plasma Darah dan Eritrosit Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan dengan konsentrasi separating gel 12,5% dan stacking gel 3% menurut Lestari (2008). Bahan untuk separating gel 12,5% adalah Acrilamide-bis 30%, 1,5M Tris ph 8,8, demineralized water, SDS 10%, APS 10% dan TEMED. Sedangkan bahan stacking gel 3% adalah Acrilamide-bis 30%, 0,5M Tris ph 6,8, demineralized water, SDS 10%, APS 10% dan TEMED. Sebelum dilakukan proses elektroforesis terlebih dahulu sampel plasma darah dan eritrosit diukur konsentrasi proteinnya dengan menggunakan NANODROP spektrofotometer dan disamakan konsentrasinya melalui pengenceran. Selanjutnya sampel protein ditambah RSB dan dipanaskan selama 5 menit pada suhu 95 C. Protein marker yang digunakan dalam penelitian ini adalah marker protein Spectra TM Multicolor Broad Range Protein Ladder SM1841. Proses elektroforesis dilakukan dengan tegangan 130 V dan kuat arus 60 ma. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan staining buffer selama 25 menit. Selanjutnya dilakukan

4 4 pencucian untuk menghilangkan warna menggunakan destaining buffer selama 3 malam. Analisis Data Data yang diambil untuk dianalisis adalah 1) Profil pola pita protein spesifik untuk melihat frekuensi ekspresi proteinnya. Frekuensi ekspresi protein dari masing-masing lokus diketahui dengan cara melihat pita-pita (band) protein yang muncul. Hasil pengamatan berupa pita (band) protein, kemudian dianalisis menggunakan GENEPOP ver ) Keberadaan protein spesifik untuk estimasi jarak genetik. Gambaran profil pita protein spesifik yang didapat diubah menjadi data biner dan dianalisa dengan program MVSP 3.22 untuk mengetahui jarak genetik individu dalam populasi. Dendogram hasil analisa akan menunjukkan persentase similaritas antar individu dari 2 populasi tersebut sehingga dapat diketahui hubungan kekerabatannya. Hasil penelitian ini juga dapat digunakan sebagai pertimbangan teknik breeding dengan tujuan peningkatan mutu genetik kerbau. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil elektroforesis SDS-PAGE gel polyacrilamid memperlihatkan adanya perbedaan profil protein pada individu dalam populasi kerbau di daerah Lumajang dan Bangkalan. Berikut dibawah ini merupakan gambar hasil elektroforesis pada sampel plasma dan eritrosit. (a) Gambar 1. a) Separasi Profil Protein Pada Sampel Plasma Darah Kerbau Dari Populasi Wilayah Bangkalan (Sampel B1-B4-) Serta Lumajang (Sampel L1-L4) b) Zimogram Profil Protein Pada Sampel Plasma Darah Kerbau Dari Populasi Wilayah Bangkalan (B1-B4) Serta Lumajang (Sampel L1-L4) (b)

5 5 (a) Gambar 2. a) Separasi Profil Protein Pada Sampel Eritrosit Kerbau Dari Populasi Wilayah Bangkalan (Sampel B1-B4) Serta Lumajang (Sampel L1-L4) b) Zimogram Profil Protein Pada Sampel Eritrosit Kerbau Dari Populasi Wilayah Bangkalan (B1-B4) Serta Lumajang (Sampel L1-L4) Separasi pita protein yang terdapat pada gel poliakrilamid hasil elektroforesis kedua sampel menunjukkan bahwa banyak jenis protein yang dihasilkan dalam darah. Hasil separasi pita protein dan perhitungan berat molekul juga menampakkan adanya protein spesifik (hemoglobin, transferin, dan posttransferin) yang muncul pada sampel plasma dan eritrosit. Ketiga jenis protein tersebut merupakan protein hasil ekspresi genetik yaitu berupa globin (Hillman, et al., 2005). Berdasarkan hasil elektroforesis diketahui bahwa protein transferin terletak pada berat molekul sekitar kda, Post-transferin dengan berat molekul kda. Hemoglobin dengan berat molekul kda. Hasil perhitungan berat molekul 3 protein spesifik dalam plasma dan eritrosit dari 2 populasi ditampilkan pada Tabel 1.1 dibawah ini. (b) Tabel 1.1 Berat Molekul Protein Darah Dalam Plasma dan Eritrosit dari 2 Populasi Individu BM Protein dalam Plasma Eritrosit Populasi ke- post-transferin Transferin hemoglobin ( kda) (79-85) kda (64-66 kda) Bangkalan Lumajang ;

6 6 Populasi Di Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa kedua populasi memiliki perbedaan protein yang dimiliki pada masing-masing individu berdasarkan berat molekulnya. Data pada tabel tersebut kemudian dianalisis menggunakan software GENEPOP version 4.2, untuk mengetahui frekuensi ekspresi protein pada 2 populasi berdasarkan tiga lokus protein (hemoglobin, transferin, dan posttransferin). Dibawah ini ditampilkan tabel frekuensi ekspresi tiga lokus protein dari kedua populasi berdasarkan input data GENEPOP. Tabel 1.2 Frekuensi Ekspresi Protein dari Populasi Bangkalan dan Lumajang Protein Frekuensi (%) Ekspresi Protein pada Berat Molekul (kda) Bangkalan hb trf ptf Lumajang hb trf ptf Berdasarkan Tabel 1.2, pada transferin nampak muncul 3 varian protein di populasi Bangkalan dan Lumajang. Sedangkan untuk ekspresi post-transferin menunjukkan adanya 2 varian protein di populasi Bangkalan, dan 4 varian protein di populasi Lumajang. Hal tersebut menunjukkan bahwa ekspresi transferin pada populasi Bangkalan nampak lebih variatif dibandingkan ekspresi hemoglobin dan post-transferin. Sedangkan pada populasi Lumajang ekspresi post-transferin lebih variatif dibanding 2 ekspresi protein lainnya. Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa ekspresi transferin dan ekspresi post-transferin nampak lebih variatif dibandingkan ekspresi hemoglobin dari kedua populasi. Pada penelitian ini dilakukan estimasi jarak genetik individu kerbau dari kedua populasi berdasarkan profil protein darah. Untuk membuat estimasi jarak genetik dilakukan dengan mengamati keberadaan protein spesifik darah. Berdasarkan keberadaan protein yang di indentifikasi yaitu hemoglobin, transferin dan post-transferin, nampak bahwa ketiga protein dapat terekspresi pada kedua populasi. Hal ini menunjukkan bahwa protein-protein tersebut spesifik terdapat pada darah kerbau dari kedua populasi. Data keberadaan protein spesifik dalam darah pada. Selanjutnya dilakukan analisis filogenik dengan memanfaatkan cluster analysis yang ada pada program MVSP Dengan analisis tersebut dapat diperoleh indeks similiaritas yang semakin memperjelas jarak genetik individu. Diungkapkan Faruque (2007) dalam Lukitasari (2011), indeks similaritas dengan rentangan 0-1 menunjukkan tingkat kekerabatan antar individu yang dapat dianalisis. Semakin indeks similaritas mendekati angka 1 berarti individu yang dimaksud semakin mirip sehingga jarak genetik menjadi semakin dekat. Berikut di bawah ini merupakan gambar dendogram hasil analisa kluster.

7 7 Kluster 1 Kluster 2 Kluster 3 Gambar 3. Dendogram Hubungan Kekerabatan Kerbau dari Populasi Bangkalan (B1-B4) dan Populasi Lumajang (L1-L4) Berdasarkan Protein Spesifik Darah Gambar diatas memperlihatkan individu kerbau dari dua populasi membentuk tiga kluster. Dari ketiga kluster tersebut menunjukkan individuindividu yang berasal dari dua populasi yang berbeda yaitu Bangkalan dan Lumajang, justru berada pada satu kluster. Hal ini mengindikasikan kemungkinan terjadinya migrasi pada individu-individu kerbau tersebut. Vijh et al., (2008) menyatakan bahwa kondisi geografis yang biasanya dipergunakan untuk mengetahui perbedaan genetik yang terjadi pada populasi seringkali menunjukkan hasil yang tidak signifikan. Hal tersebut terjadi mengingat kebiasaan peternak lokal Bangkalan yang sering membawa kerbau mereka ke daerah-daerah lain diluar Bangkalan. Hal ini dapat dipahami melihat fakta bahwa di lokasi tersebut tidak terdapat pasar untuk jual beli kerbau. Sehingga memberikan peluang bagi peternak lokal membawa kerbau mereka ke luar wilayah Bangkalan, atau pun mendatangkan kerbau dari daerah lain. Kondisi ini menunjukkan bahwa kondisi geografis atau tempat bukan menjadi penghalang untuk kawin. Penelitian ini diharapkan dapat mempertahankan populasi kerbau yang terus menurun dengan meningkatkan mutu genetik dari kerbau itu sendiri. Kedekatan hubungan antar hewan, merupakan salah satu hal yang penting untuk diperhatikan dalam upaya pemuliabiakan ternak. Dengan memperhatikan hubungan kekerabatan maka dapat membantu dalam pertimbangan teknik breeding yang tepat bagi hewan ternak. Perkawinan antara hewan yang memiliki hubungan kekerabatan jauh dikenal sebagai cross breeding atau perkawinan silang. Perkawinan cross breeding memiliki dampak positif berupa peningkatan kualitas serta peningkatan variasi genetik hewan ternak hasil perkawinan. Berdasarkan hasil analisis profil protein darah pada penelitian ini diketahui bahwa estimasi perkawinan sesuai dendogram adalah individu dari kluster 1 dapat dikawinkan dengan setiap individu dari kluster 2 dan kluster 3. Sedangkan untuk individu dalam kluster 2 tidak dapat dikawinkan dengan individu anggota kluster 3, karena kedua kluster memiliki hubungan kekerabatan yang sangat dekat. Sebab apabila dilakukan perkawinan pada kerbau yang berkerabat dekat (inbreeding)

8 8 akan menyebabkan penurunan kualitas reproduksi dan memungkinkan proses munculnya gen-gen yang merugikan yang diwarisi dari kedua induknya. KESIMPULAN 1. Frekuensi ekspresi protein kerbau dari dua populasi menunjukkan ekspresi transferin pada populasi Bangkalan dan ekspresi post-transferin dari populasi Lumajang nampak lebih variatif dibandingkan ekspresi hemoglobin. 2. Berdasarkan dendogram hasil kluster analisis diketahui adanya 3 kluster yang terbentuk. Kluster pertama menunjukkan bahwa individu Bangkalan 4 memiliki hubungan kekerabatan yang cukup jauh dengan kluster 2 dan kluster 3. Kluster 2 menunjukkan individu Lumajang 2, Lumajang 4, dan Bangkalan 1 memiliki hubungan kekerabatan sangat dekat. Kluster ketiga menunjukkan adanya hubungan kekerabatan yang sangat dekat antara individu Bangkalan 2, Bangkalan 3, Lumajang 2 dan Lumajang 1. Semakin tinggi indeks similiaritas semakin dekat hubungan kekerabatan antar individu dalam populasi. SARAN 1. Dilakukan penelitian serupa dengan memperbanyak jumlah sampel dalam setiap populasi yang dianalisis polimorfisme proteinnya agar dapat diketahui variasi genetik dalam populasi. 2. Estimasi perkawinan yang dapat dilakukan adalah individu dari kluster 1 dikawinkan dengan setiap individu dari kluster 2 dan kluster 3. Sedangkan untuk individu dalam kluster 2 tidak dapat dikawinkan dengan individu anggota kluster 3, karena kedua kluster memiliki hubungan kekerabatan yang sangat dekat. DAFTAR RUJUKAN Dinas Peternakan Prov. Jawa Timur Data Statistik Populasi Ternak Kab/Kota di Jawa Timur. (Online) ( atistikpopulasiternak, diakses tanggal 8 November 2013). Faruque,M.O., The Genetic Diversity of Bangladesh Buffaloes. Italian Jounal Animal Science. Volume 6, Hasinah, H., dan Eko H., Keragaman Genetik Ternak Kerbau Di Indonesia. Lokakarya Nasional Usaha Ternak Kerbau Mendukung Program Kecukupan Daging Sapi. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan. Bogor. Hillman RS, Ault KA and Rinder HM Hematology in Clinical ractise. Mc Graw Hill. USA ; 4: Johari, S., Sutopo, Kurnianto, E.dan Hasviara, E Polimorfisme Protein Darah Ayam Kedu. Skripsi. Fakultas Peternakan Universitas Diponegoro. Semarang.

9 9 Lestari, Umie Karakterisasi Dan Spesifikasi Protein Membran Spematozoa Manusia Dan Antibodi Untuk Pengembangan Kandidat Bahan Imunokontrasepsi. Disertasi. Malang: Universitas Brawijaya Malang. Lisnawati, Prisikila, Analisis Keragaman Genetik Protein Darah Kuda Lokal Sulawesi Utara Dengan Menggunakan Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Page). Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Lukitasari, Marheny Variasi genetik kerbau lokal (Bubalus bubalis) di wilayah Madiun dan Malang Berdasarkan Profil dan Polimorfisme Protein Darah sebagai Bahan Ajar Teknik Analisis Biologi Molekuler. Tesis. Universitas Negeri Malang. Mwacharo, J.M., Otieno, C.J.,. Okeyo, A.M Suitability of Blood Polymorphisms in Assessing Genetic Diversity and Relationships in Population Genetic Studies. Dept. Of Animal Production, University of Nairobi, Kenya. Oktarianti, R., Prastiwindari, M Pengkajian Polimorfisme Protein Plasma Darah pada Ikan Gurami (Osphronemus Gouramy Lac) di Kabupaten Jember. Skripsi. Universitas Jember Suratno, D. Setyati. Oktarianti R Analisis Polimorfisme Protein Plasma darah Ikan Lele Lokal di Kabupaten Jember. Laporan Penelitian. Universitas Jember. Vijh, R.K.. Tantia M.S., Mishra, B dan Bharani Kumar, S.T Genetic Relationship and Diversity Analisis of Indian Water Buffalo (Bubalus bubalis. American Society of Animal Science.86: Widiasworo A Polimorfisme Protein Plasma Darah pada Ikan Nila Hitam, Ikan Nila Merah, dan Ikan Mujair. Skripsi tidak dipublikasikan. FKIP Biologi Universitas Jember.