Lampiran 1 Prosedur pembuatan media dan reagen yang digunakan dalam penelitian

Transkripsi

1 LAMPIRAN 66

2 67 Lampiran 1 Prosedur pembuatan media dan reagen yang digunakan dalam penelitian Media kultur cair dan padat bakteri PMP 0126y Pembuatan media kultur cair bakteri yang mengandung CMC dilakukan dengan melarutkan 1% CMC di dalam air yang terus dipanaskan dan diaduk sampai larutan menjadi homogen. Kemudian sebanyak 0,02% MgSO. 4 7H 2 O; 0,03% NH 4 NO 3 ; 0,05% K 2 HPO 4 ; 0,1% KH 2 PO 4 ; 0,002% FeSO. 4 7H 2 O; 0,004% CaCl. 2 2H 2 O; 0,2% ekstrak khamir dilarutkan dalam larutan CMC yang sudah homogen. Pada media inokulum, ditambahkan sebanyak 0,1% glukosa. Sedangkan pada media produksi tidak ditambahkan glukosa. Pembuatan media kultur padat CMC dibuat dengan perlakuan yang sama dengan media kultur cair. Akan tetapi, media kultur padat ditambahkan sebanyak 1,5% agar-agar bakto. Kemudian media disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu C selama 15 menit. Merah Kongo 0,1% Sebanyak 1 g reagen merah kongo dilarutkan dalam 100 ml air distilasi. Larutan ini harus disimpan dalam botol gelap dan sebaiknya dalam keadaan segar setiap kali akan dilakukan uji kualitatif. Reagen DNS Sebanyak 1% NaOH dilarutkan dalam air distilasi, kemudian ditambahkan sebanyak 1% DNS, 18,2% Na K Tartarat (sodium tartarat), 0,2% Fenol, 0,05% Na 2 SO 4. Semua bahan dilarutkan dalam air distilasi dan disimpan dalam botol gelap pada suhu 4 0 C. Larutan stok KH 2 PO 4 (SNI ) Sebanyak 34 g KH 2 PO 4 ditambahkan ke dalam 500 ml akuades. ph diatur 7,2 dengan 1 N NaOH dan larutan ditepatkan sebanyak 1 L dengan ditambah akuades. Sterilisasi selama 15 menit pada suhu C. Larutan disimpan dalam lemari pendingin.

3 68 Pereaksi Bradford (Bradford 1976) Sebanyak 175 mg Coomassie Briliant Blue G250 (C.L ) dilarutkan dalam 50 ml etanol 95% dan 100 ml asam ortofosfat 88% untuk larutan stok Bradford. Pada larutan bufer pereaksi Bradford 100 ml dibuat dengan mencampurkan sebanyak 6 ml larutan stok Bradford dengan 6 ml asam fosfat, 3 ml etanol, dan 90,4 ml air distilasi. Kemudian, campuran pereaksi disaring dengan menggunakan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap pada suhu ruang atau dingin. Gel Agarosa Sebanyak 0,25 g dilarutkan dalam 25 ml bufer TBE 1x. Kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 50 0 C selama 2 menit. Elektroforesis gel poliakrilamida, SDS 30% (29%, 1%) Sebanyak 14,5 g akrilamida (Acrylamide) dan 0,5 g bis akrilamida (N, N - Methylenebisacrylamide) dilarutkan dalam 50 ml air distilasi (30%). Kemudian, larutan disaring dengan menggunakan kertas saring dan disiman dalam botol gelap pada suhu 4 0 C. 1,5 M Bufer Tris-HCl ph 8,8 Sebanyak 9,1 g Tris basa dilarutkan di dalam 50 ml air distilasi, kemudian ph diatur hingga menjadi 8,8 dengan menggunakan HCl 1 N. Larutan disimpan pada suhu 4 0 C. 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 Sebanyak 5,85 g Tris basa dilarutkan dalam 100 ml air distilasi, kemudian ph diatur dengan menggunakan HCl 1 N hingga menjadi 6,8. Larutan disimpan pada suhu 4 0 C. 10% SDS Sebanyak 0,1 g SDS dilarutkan dalam 1 ml air distilasi. Larutan ini disimpan dalam suhu 4 0 C. Larutan ini harus dibuat segar setiap minggunya. 10% Amonium Persulfat (APS) Sebanyak 20 mg dilarutkan dalam 0,2 ml air distilasi (dalam 1 ml mengandung 0,1 g APS). Larutan ini harus dibuat segar setiap kali akan

4 69 digunakan. Tidak dianjurkan untuk menggunakan APS yang sudah dibuat sehari sebelumnya. 5X Bufer Sampel SDS dan Zimogram Bufer sampel SDS-PAGE dibuat dengan mencampurkan sebanyak 0,6 ml 1 M Tris-Cl ph 6,8 dengan 5 ml 50% gliserol, 2 ml 10% SDS, 0,5 ml β-mercaptoethanol, 1 ml 1% bromophenol blue dan 0,9 ml H 2 O. Untuk bufer sampel Zimogram tanpa penambahan 10% SDS, dan β-mercaptoethanol yaitu sebanyak 1,2 ml 1 M Tris-Cl (ph 6,8) ditambah dengan 5 ml 50% gliserol, 0,5 ml bromophenol blue, dan 1,4 ml H 2 O. 1X Bufer Elektroforesis SDS Sebanyak 3 g Tris, 14,4 g glysin, dan 1 g SDS dilarutkan dalam 1 L air distilasi kemudian ph diatur menjadi 8,3. Larutan bufer ini dapat digunakan sampai 10 kali elektroforesis SDS-PAGE dan dapat disimpan dalam suhu ruang (Bollag & Edelstein 1991) Larutan Pewarna Gel (Kit Pewarna Silver) Fermentas a. Larutan peluntur gel 1 (gel fixing) Sebanyak 25 ml etanol absolut dicampur dengan 20 ml air distilasi dan ditambah dengan 5 ml asam asetat glasial. b. Larutan peluntur gel 2 (gel fixing) Sebanyak 30 ml etanol absolut dicampur dengan 70 ml air distilasi. c. Larutan sensitizer Sebanyak 200 µl konsentrat sensitizer dilarutkan dalam 50 ml air distilasi. d. Larutan pewarna Sebanyak 2 ml bahan reaksi pewarna ditambahkan 50 air distilasi, kemudian saat akan digunakan baru ditambah dengan 27 µl larutan formaldehida.

5 70 e. Larutan pencuci gel Sebanyak 10 µl konsentrat sensitizer dicampur dengan 5 ml larutan pencuci, dan 50 ml air distilasi. Kemudian, ditambah dengan 13,5 µl larutan formaldehida saat larutan ini akan digunakan. f. Larutan akhir Sebanyak 4 ml larutan akhir (Stop solution) ditambah dengan 46 ml air distilasi.

6 71 Lampiran 2 Kurva standar glukosa Kurva standar glukosa dibuat dengan pembuatan larutan standar glukosa 0,1% dengan berbagai konsentrasi (0-100 ppm). Sebanyak 1 ml substrat glukosa 0,1% dalam akuades steril dengan berbagai konsentrasi ditambah dengan 1 ml DNS pada masing-masing tabung reaksi. Setiap larutan kemudian diinkubasi di dalam air mendidih selama 15 menit dan absorbansi diukur pada λ 575 nm. Konsentrasi glukosa (mg/l) Absorbansi 0 0, , , , , ,765

7 72 Lampiran 3 Kurva standar bovin serum albumin (BSA) Konsentrasi BSA (mg/ml) Absorbansi λ ,1 0,033 0,2 0,046 0,3 0,057 0,4 0,080 0,5 0,097 0,6 0,115 0,7 0,140 0,8 0,152 0,9 0, ,171

8 73 Lampiran 4 Kurva hubungan log sel dan kerapatan optis dan jumlah sel isolat PMP 0126y selama 27 jam pengamatan Pengenceran OD Jumlah sel Log 10 1:1 1, ,47 1:2 0, ,17 1:4 0, ,87 1:8 0, ,57 1:16 0, ,27 1:32 0, ,96 Jumlah sel (Log 10 CFU/mL) isolat PMP 0126y selama 27 jam pengamatan Waktu sampling (jam) OD Log 10 CFU/mL 0 0,141 8,3 3 0,450 8,7 6 0,991 9,4 9 1,123 9,5 12 1,251 9,7 15 1,271 9,7 18 1,252 9,7 21 1,263 9,7 24 1,091 9,5 27 0,605 8,9

9 74 Lampiran 5 Hasil uji aktivitas selulase isolat PMP 0126y Hasil uji aktivitas selulase pada media produksi selama 6 hari pengamatan Hari Konsentrasi glukosa (mg/l) Aktivitas selulase (U/mL) Jumlah sel (Log 10 CFU/mL) Konsentrasi protein (mg/ml) Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 0,069 0,064 8,7 1,193 0, ,071 0,065 9,1 0,875 0, ,079 0,073 9,1 0,927 0, ,117 0,108 9,1 0,895 0, ,076 0,070 9,1 1,070 0, ,075 0,069 9,0 1,052 0, ,068 0,063 8,9 1,030 0,061 Hasil uji aktivitas selulase pada media produksi mengandung glukosa 0,1% setiap hari pengamatan Hari Konsentrasi glukosa (mg/ml) Aktivitas selulase (U/mL) Jumlah sel (Log 10 CFU/mL) Kadar Protein (mg/ml) Aktivitas spesifik (U/mg) 0 0,070 0,065 8,4 1,024 0, ,070 0,065 9,4 1,010 0, ,071 0,066 9,4 0,860 0, ,076 0,070 9,4 0,606 0, ,068 0,063 9,3 1,119 0, ,064 0,059 9,2 1,235 0, ,054 0,050 8,9 1,241 0,040 Aktivitas unit, aktivitas spesifik endapan dan supernatan pada berbagai persen kelarutan amonium sulfat Persen kelarutan amonium sulfat (%) Aktivitas selulase (U/mL) Aktivitas spesifik (U/mg) Endapan Supernatan Endapan Supernatan Kontrol 0,064 0, ,069 0,059 0,092 0, ,069 0,065 0,117 0, ,072 0,068 0,128 0, ,071 0,064 0,079 0, ,066 0,065 0,062 0, ,064 0,065 0,047 0, ,064 0,062 0,047 0,054

10 75 Hasil uji aktivitas selulase hasil pemurnian kolom DEAE Fraksi Konsentrasi glukosa (mg/ml) Aktivitas selulase (U/mL) Kadar protein (mg/ml) Aktivitas spesifik (U/mg) 46 0,064 0,127 0,124 1, ,064 0,127 0,087 1, ,077 0,154 0,118 1, ,064 0,127 0,107 1, ,064 0,128 0,144 0, ,073 0,147 0,092 1, ,070 0,141 0,133 1, ,066 0,131 0,130 1, ,061 0,121 0,130 0, ,068 0,137 0,115 1,187 Aktivitas relatif selulase pada penambahan logam 5 mm dan 10 mm Aktivitas relatif (%) Ion logam 5 mm 10 mm Kontrol 100 KCl NaCl MgCl FeCl CaCl ZnCl EDTA Aktivitas selulase pada 5 mm dan 10 mm pada aktivitas selulase Ion logam Aktivitas selulase (U/mL) Aktivitas selulase (U/mL) pada 5 mm pada 10 mm Kontrol 0,090 KCl 0,089 0,098 NaCl 0,072 0,072 MgCl 2 0,116 0,067 FeCl 3 0,075 0,100 CaCl 2 0,138 0,074 ZnCl 2 0,064 0,020 EDTA 0,073 0,059

11 76 Lampiran 6 Prosedur delignifikasi limbah rumput laut dengan NaOH dan H 2 SO 4 oleh BBP4BKP limbah rumput laut digerus sampai halus ditambah NaOH (w/w) 4 dan 6%, dan H 2 SO 4 1% (w/v) diautoklaf selama 20 menit pada suhu C disaring dikeringkan di dalam oven sampai kadar air ± 10%

12 77 Model 3730 File: 1st_BASE_672451_Isna_16SF.ab1 Signal G:110 A:191 T:231 C:195 Page 1 of 2 KB.bcp KB_3730_POP7_BDTv3.mob 8/24/2011 BIO _Isna_16SF ?? no 'MTXF' field Spacing: TRACE Lane 13 Points 2201 to BioEdit version (10/28/05) G GGGGGGAA ACTTT CG GGG ACTT G AGAGC GGCGTACGGG TGCGGAACAC GTGTGCAACC TGCCTTTATC TGGGGGATAG CC TTTCGAAA GGAAGATTAA TACCCCATAA TATATTGAATGGCATCAT TTGATATTGAAA ACTCCGG T GG ATAGAGATGG GCACGCGCAA GATTAGATAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC CAAG TCAGCG ATCTTTAGGG GGCCTG AGAG GGTGATCCCC CACACTGGTA CTGAG ACACG G ACCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTG AG GAAT ATTGGA CAATGGGTGA GAGCCTGATC CAGCCATCCC GCGTGAAGGA CGACGGCCCT ATGGGTTGTA AACTTCTTTTGTATAGGGAT AAACCTACCC TCGTGAGGGT AGCTGAAGGT ACTATACGAA TAAGCACCGG CTAACTCCGT GCCA GCAGCC GCGGTAATAC GGAGGGTGCA AGCGTTATCC GGATTTATTG GGTTTAAAGG GTCCGTAGGC TGATTTGTAA GTCAGTGGTG AAATCTCACA GCTTAACTGT GAAACTGCCA TTGATACTGC AAGTCTTGAG TGTTGTTGAA GTAG CTGGAA TAAGTAGTGT AGCGGTGAAA TGCATAGATA TTACTTAGAA CACCAATTGC GAAGGCAGGT TACTAAGCAA CAACTGACGC TGATGGACGA AAGCGTGGGG AGCGAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA CG

13 78 Model 3730 File: 1st_BASE_672451_Isna_16SF.ab1 Signal G:110 A:191 T:231 C:195 Page 2 of 2 KB.bcp KB_3730_POP7_BDTv3.mob 8/24/2011 BIO _Isna_16SF ?? no 'MTXF' field Spacing: TRACE Lane 13 Points 2201 to BioEdit version (10/28/05) ATGCTAAC TCGTTTTTGGGCTTTTGGGT TCAGAGACTA AGCGAAAGTG ATAAGTTAGC CACCTGG GGAGTACGAACGC AAGTT TGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGATTA TGTGGTTTAA TTCGA TGATACGCGAGGAAC CTT ACCAAGG CTTAAATGGG GAAATGAC AGGCTT AGAAAA TAGGCTT TT CTTC GGACATT TTTCAAGGTG CTGCATGG TT GTC GTCAGCT CCTGCCCGTG AGGTGTTAAG GTTAAGTCCT T GCAACGAAG CGCAACCCCT TGTCACTAA TTTGCCATCAT TT AATTTGGG GGACTCTAGT T AAAACTGCC T ACCCCAA GTA AAAAAGAAA AGTT GGGGAT AAA

14 79 Model 3730 File: 1st_BASE_672450_Isna_16SR.ab1 Signal G:126 A:146 T:183 C:157 Page 1 of 2 KB.bcp KB_3730_POP7_BDTv3.mob 8/24/2011 BIO _Isna_16SR ?? no 'MTXF' field Spacing: TRACE Lane 15 Points 2200 to BioEdit version (10/28/05) N GGGGGCAA ACCG CG CCAT G G CT G ATGCG CGATTACTAG CGATTCCAGC T TCATAG AGT CGAGTTGCAG ACTCCAATCC GAACTG AG AC CGGC TTTCGAGATTTGCATC AC TTCGCAGT GTAGC TGCCC TC TGTACCGG CCAT TG TATTACGTG TG TGGCCCAAGGCG TAAGGGCCG TG ATG ATTTGAC GTCATCCCCA CC TTCCTCTC TACTTGCGTA GGCAGTCTCA CTAG AGTCCC CAACTTAATG ATGGCAACTA G TGACAGGGG TTGCGCTCGT TGCAGGACTT AACCTAACAC CTCACGGCAC GAGCTGACGA CAACCATGCA GCACCTTG AAAAATGTCCGA AGAAAAGCCT ATTTCTAAGC CTGTCATTTC CCATTTAAGC CTTGGTAAGG TTCCTCGCGT ATCATCGAAT TAAACCACAT AATCCACCGC TTGTGCGGGC CCCCGTCAAT TCCTTTGAGT TTCAAACTTG CGTTCGTACT CCCCAGGTGG CTAACTTATC ACTTTCGCTT AGTCTCTGAA CCCAAAAGCC CAAAAACGAG TTAGCATCGT TTACGGCGTG GACTACCAGG GTATCTAATC CTGTTCGCTC CCCACGCTTT CGTCCATCAG CGTCAGTTGT TGCTTAGTAA CCTGCCTTCG CAATTGGTGT TCTAAGTAAT ATCTATGCAT TTCACCGCTA CACTACTTATTCCAGCTACT TCAACAACAC TCAAGACTTG CAGT ATCA

15 80 Model 3730 File: 1st_BASE_672450_Isna_16SR.ab1 Signal G:126 A:146 T:183 C:157 Page 2 of 2 KB.bcp KB_3730_POP7_BDTv3.mob 8/24/2011 BIO _Isna_16SR ?? no 'MTXF' field Spacing: TRACE Lane 15 Points 2200 to BioEdit version (10/28/05) ATGGCAGTTTCA CAGTT AAGCT GTGAGATTTC ACCACTGACT TACAAATCAGCCTACGGACC CTTTAAACCC AATAAATCC GGAT AAC GCTT GCACCCTCCG TATTACCGCGGCTGCTGGCA CG GAGTT AG CCGGTGCTT AT TCGTATAGTACCTT CAGCTACCCT CACGA GGGTAGGTTT ATCCCCTATAC AAAAA AAAGT TT ACAACCC ATAA GGGCCGT CGTCCTTTCA CGCCGGGATG GCTGGGATCA AGGCT CTCACCCCATTGTCC AAATATTCCT TCAC TGGCTG CCCTCCCGT AAGAATTCTGG G CCC TTGT CTCAA TTACCAA TT TTN