PEPPER VEIN YELLOW VIRUS (PeVYV) PENYEBAB PENYAKIT KUNING (YELLOWING) PADA TANAMAN MENTIMUN DI DAERAH BALI

Transkripsi

1 TESIS PEPPER VEIN YELLOW VIRUS (PeVYV) PENYEBAB PENYAKIT KUNING (YELLOWING) PADA TANAMAN MENTIMUN DI DAERAH BALI M. TINNY LESTARININGSIH. T PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016

2 TESIS PEPPER VEIN YELLOW VIRUS (PeVYV) PENYEBAB PENYAKIT KUNING (YELLOWING) PADA TANAMAN MENTIMUN DI DAERAH BALI M. TINNY LESTARININGSIH. T NIM : PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016

3 PEPPER VEIN YELLOW VIRUS (PeVYV) PENYEBAB PENYAKIT KUNING (YELLOWING) PADA TANAMAN MENTIMUN DI BALI Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian, Program Pascasarjana Universitas Udayana M. TINNY LESTARININGSIH. T NIM: PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016 ii

4 Lembar Pengesahan TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL 14 JANUARI 2016 Pembimbing I, Pembimbing II, Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si. Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. NIP NIP Mengetahui Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana, Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana, Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. NIP Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K) NIP iii

5 PENETAPAN PANITIA PENGUJI Tesis Ini Telah Diuji pada Tanggal 14 Januari 2016 Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No. 4372/UN14.4/HK/2015, Tanggal 23 Desember 2015 Ketua : Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si. Anggota : 1. Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. 2. Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P 3. Dr. G.N. Alit Susanta Wirya, S.P. M.Agr. 4. I Putu Sudiarta, S.P., M.Si., Ph.D. iv

6 SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama : M. Tinny Lestariningsih. T NIM : Program Studi : Bioteknologi Pertanian Judul Tesis : Pepper Vein Yellow Virus (PeVYV) Penyebab Penyakit Kuning (YELLOWING) Pada Tanaman Mentimun di Bali Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah tesis ini bebas plagiat. Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku. Denpasar, 14 Januari 2016 Yang membuat pernyataan (M. Tinny Lestariningsih. T) v

7 UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena atas asung kerta wara nugraha-nya, penulis dapat menyelesaikan tesis ini yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Bioteknologi Pertanian pada Program Pascasarjana Bioteknologi Pertanian Universitas Udayana, dengan judul Pepper Vein Yellow Virus (PeVYV) Penyebab Penyakit Kuning (Yellowing) pada Tanaman Mentimun di Daerah Bali. Dalam kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si dan Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc selaku Pembimbing yang senantiasa memberikan semangat, dorongan, bimbingan dan pengarahan kepada penulis serta kepada para Penguji tesis, yaitu Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P., Dr. I Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya, S.P., M. Agr., dan I Putu Sudiarta, S.P., M.Si., Ph.D., yang telah memberikan saran, arahan, dan banyak masukan yang bermanfaat sehingga tesis ini dapat penulis selesaikan dengan baik. Ucapan terima kasih juga penulis tujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD., KEMD, Ibu Direktur Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K) atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pascasarjana Universitas Udayana, serta seluruh staf dosen dan staf administrasi Bioteknologi Pertanian, Ni Md Intan M, Citra yang telah banyak membantu penulis selama menempuh pendidikan. Penulis pada kesempatan ini juga mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak dan Ibu staf Laboratorium Virologi Institut Pertanian Bogor, Sari Nurulita S.P., M.Si., Rizki Haerunisa, Hamda, serta teman-teman Laboratorium Virologi IPB atas kerjasama, kesempatan dan kemudahan dalam menggunakan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk belajar dan melakukan penelitian. vi

8 Ucapan terimakasih yang tulus penulis sampaikan kepada kedua orang tua Drs. I Ketut Teneng, SP., M.Si. dan Drh. Luh Ayu Aryani, M.P., serta kepada mendiang Ibunda tercinta. Terimakasih penulis sampaikan juga kepada suami tercinta Made Yudi Aditya, S.E., serta kakak L.P. Tetty Lestariasih.T., S.P., adik K. Trianny Putri Mahadewi Lestariningrum. T., dan K. Teguh Wibawa Lesmana Putra. T., bapak ibu mertua I Wayan Rena dan Desak Putu Kartika, Popyana, Sekarini dan seluruh keluarga besar yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu atas dukungan, semangat, do a yang diberikan selama penulis menyelesaikan pendidikan ini. Akhir ucapan terima kasih penulis sampaikan juga kepada teman-teman Bioteknologi Pertanian angkatan 2013 N. Putri Adnyani, Kade Kusuma D, Putra Wiratama, Dwi M, Shinta D, Nisa S, Febri S, Irsan N, Diyah N, Agung D, Dita M, Rahde, Kayan, atas semangat dan motivasinya selama kuliah. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada teman-teman Karantina Pertanian Denpasar serta temanteman Ekonomi Bappeda Provinsi Bali yang memberikan semangat serta seluruh pihak dan teman-teman yang membantu dalam penulisan tesis ini, mohon maaf jika ada beberapa pihak yang tidak bisa saya sebutkan satu persatu. Penulis sangat menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan, untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun sehingga tesis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa selalu melimpahkan rahmat-nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini. Denpasar, Januari 2016 M. Tinny Lestariningsih. T vii

9 ABSTRAK Pepper vein yellow virus (PeVYV) PENYEBAB PENYAKIT KUNING (YELLOWING) PADA TANAMAN MENTIMUN DI BALI Pepper vein yellow virus (PeVYV) merupakan salah satu anggota kelompok Polerovirus yang mempunyai inang sangat terbatas yaitu hanya dapat menginfeksi jenis tanaman cabai (Capsicum spp.). Namun demikian, pada survei yang telah dilakukan pada penelitian ini menemukan sejumlah tanaman mentimun (Cucumis sativus L.) di Bali memperlihatkan gejala yang hampir sama dengan yang terjadi pada tanaman cabai yang terinfeksi PeVYV. Gejalanya khas yaitu mulai muncul pada daun-daun bawah lambat laun berkembang ke daun-daun yang lebih muda. Lamina daun menjadi kuning akibat klorosis demikian juga tulang daunnya, tetapi jaringan disekitar tulang daun tetap hijau (vein banding). Bentuk dan ukuran daun tetap normal. Berdasarkan simptomatologi ini, diagnose langsung dilakukan dengan reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan sepasang primer spesifik PeVYV, untuk memastikan penyebab penyakit kuning pada tamanan mentimun. RNA total diekstraksi dari daun tanaman mentimun sakit menggunakan RNA extraction kit (Promega, USA) kemudian digunakan sebagai template untuk sintesis cdna dalam RT menggunakan primer oligo-dt (Promega, USA). PCR dilakukan berdasarkan Dream Taq Green Master Mix (Thermo Scientific, US) dan sepasang primer PeVYV-CP-F-BamH1 (5 -AATTAAGGATCCAATACGGGAGG GGTTAGGAGAAAT-3 ) dan PeVYV-CP-R-Pst1 (5 -AATTAACTGCAGTTTCGG GTTGTGCAATTGCACA GTA-3 ) yang dapat mengamplifikasi seluruh gen protein mantel PeVYV. Reaksi RT-PCR menghasilkan satu band DNA berukuran 650 pasang basa (bp) yang sesuai dengan predeksi. Produk PCR berhasil disekuen dan berdasarkan hasil Blast memastikan bahwa virus yang berasosiasi dengan penyakit kuning pada tanaman mentimun di Bali adalah PeYVY. Analisis pohon pilogeni memperlihatkan bahwa PeVYV isolat mentimun asal Bali sangat dekat hubungan kekerabatannya dengan PeVYV isolat cabai asal Bali. Kumungkinan besar virus yang ada pada tanaman cabai menginfeksi tanaman mentimun melalui serangga vektornya yaitu kutu daun. Ini merupakan laporan pertama bahwa PeVYV menginfeksi tanaman mentimun, selain cabai. Kata kunci : PeVYV, Mentimun, kuning. viii

10 ABSTRACT Pepper vein yellow virus (PeVYV) CAUSING YELLOWING DISEASE ON CUCUMBER PLANTS IN BALI Pepper vein yellow virus (PeVYV) is one of the members of Polerovirus having very restricted plant host that it is infected only chili pepper (Capsicum spp.). But, in the surveys conducted in Bali, it was found that many cucumber (Cucumis sativus L.) plants exhibited mostly the same symptoms with those occurred on PeVYV-infected chili pepper plants. The symptoms occurred first on the lower leaves and gradually to upper leaves, and characterized by yellowing on the lamina, but the tissue around the vein was still normal green (vein banding). Leaf shape and size was not distorted. Based on this symptomatology, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT- PCR) using primer pairs specific to PeVYV was done to elucidate virus associated with the disease on cucumber. Total RNA was extracted from diseased cucumber plant leaves using RNA extraction kit (Promega, USA) and then used as template during cdna syntheses using oligo-dt primer (Promega, USA). PCR was done according to Dream Taq Green Master Mix (Thermo Scientific, US) and a pair of primers PeVYV-CP-F-BamH1 (5 -AATTAAGGATCCAATACGGGAGGGGTTA GGAGAAAT-3 ) dan PeVYV-CP-R-Pst1 (5 -AATTAACTGCAGTTTCGGGTTGT GCAATTGCACA GTA-3 ) that can amplified full length of the coat protein gene of PeVYV. RT-PCR reaction resulted one DNA band with size of 650 bp, accordance with the expected size. PCR products were successfully sequenced and based on Blast analyses it was confirmed that the virus associsted with yellowing disease on cucumber plants in Bali was PeVYV. Pylogenetic three analyses found that cucumber isolate of PeVYV from Bali has very close relationship with that of chili pepper isolate from Bali. It is postulated that the virus from chili pepper infected cucumber plants through its vector insect of Aphids. This is the first report concerning PeVYV can infect cucumber plant, other than chili pepper. Keywords: PeVYV, Cucumber, yellowing ix

11 RINGKASAN Mentimum (Cucumis sativus L.) adalah salah satu jenis sayur-sayuran yang dikenal di hampir setiap negara dan sangat disukai oleh semua lapisan masyarakat. Di Indonesia, salah satu tanaman sayuran seperti mentimun, merupakan komoditas tanaman sayuran yang banyak diusahakan oleh petani, karena mempunyai nilai ekonomi yang cukup tinggi. Proses budidaya tanaman mentimun sering kali mengalami banyak gangguan, salah satunya adalah dari organisme pengganggu tumbuhan (OPT) yang terdiri dari hama dan patogen tanaman. Salah satu patogen tanaman adalah virus yang dapat menyebabkan tanaman mengalami kehilangan hasil dan penurunan kualitas yang sangat tinggi. Tanaman yang terinfeksi virus dapat menunjukkan gejala yang berbeda-beda, tetapi biasanya daun menguning, klorosis (daun mengalami belang-belang), perubahan bentuk daun (keriting), dan pertumbuhan menyimpang lainnya (kerdil, bentuk bunga atau buah tidak normal). Selain itu, tanaman mengalami gangguan pertumbuhan (penurunan hasil dan gagal panen), penurunan kualitas dan nilai jual buah (daya tarik, ukuran, bentuk, warna, rasa, dan tekstur). Gejala yang ditimbulkan oleh virus kuning berbeda-beda,tergantung pada genus dan spesies tanaman yang terinfeksi. Pada sentra penanaman mentimun di Desa Bangli, Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan, Bali, menemukan banyak daun mentimun yang memperlihatkan gejala kuning maupun mosaik. Gejalanya khas yaitu mulai muncul pada daun-daun bawah lambat laun berkembang ke daun-daun yang lebih muda. Lamina daun menjadi kuning akibat klorosis demikian juga tulang daunnya, tetapi jaringan disekitar tulang daun tetap hijau (vein banding). Bentuk dan ukuran daun tetap normal. Virus-virus yang terlibat dalam menginduksi penyakit kuning pada tanaman mentimun di daerah Bali belum ada yang melaporkan sehingga informasi mengenai virus penyakit kuning yang terjadi pada tanaman mentimun di Bali masih terbatas. Penelitian ini perlu dilakukan agar dapat mengidentifikasi virus yang berasosiasi dengan penyakit kuning pada tanaman mentimun yang terjadi di daerah Bali serta untuk mengetahui hubungan kekerabatan isolat virus ini dengan x

12 isolat-isolat virus sejenis yang telah dilaporkan di daerah/negara lain agar kedepannya pengelolaan tanaman mentimun dapat dilakukan dengan baik. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT-PCR). Elektroforesis digunakan untuk visualisasi hasil RT-PCR dilakukan dengan elektroforesis gel Agarosa. Hasil RT-PCR yang telah terdeteksi positif pada sampel tanaman mentimun sakit dilakukan analisis sekuen nukleotida yang kemudian hasilnya digunakan untuk analisis kesejajaran dengan sekuen nukleotida Polerovirus yang telah dipublikasikan di GenBank dengan program BLAST. Pohon filogenetik dapat dibangun dengan menggunakan data sekuen untuk memvisualisasikan hubungan evolusi kesejajaran suatu spesies dengan menggunakan program Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 5.05) dan TreeTop-Phylogenetic Prediction Tree dalam situs Genebee-Molecular Biology Services ( Amplifikasi menggunakan sepasang primer spesifik PeVYV-CP-F-BamH1/ PeVYV-CP-R-Pst1 berhasil didapatkan fragmen DNA dari sampel tanaman bergejala pada ukuran ± 650 pb. Isolat Lahan 1 pada sampel no. 7 dengan intensitas fragmen DNA yang kuat kemudian terpilih untuk dilakukan analisis sekuen nukleotida. Hasil dari Analisis sekuen nukleotida pada sampel no. 7 mempunyai homologi tertinggi dengan PeVYV asal Bali, Rembang, dan Jepang yang menginfeksi tanaman cabai dengan nilai lebih dari 95%. Hal ini mengindikasikan bahwa isolat PeVYV Bali dari tanaman mentimun merupakan spesies yang sama dengan PeVYV yang menginfeksi tanaman cabai di Bali, Rembang, dan Jepang. Analisis sekuen nukleotida menggunakan pohon filogeni juga menunjukkan bahwa isolat PeVYV Bali yang menginfeksi tanaman mentimun tergabung menjadi satu kelompok dengan isolat PeVYV Bali yang menginfeksi tanaman cabai. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa infeksi Pepper Vein Yellow Virus (PeVYV) pada tanaman mentimun di Bali merupakan laporan pertama di Indonesia. Laporan ini sekaligus menambah informasi mengenai kisaran inang PeVYV yang sebelumnya dilaporkan hanya menginfeksi tanaman cabai (Capsicum spp.) dan tanaman ranti (Solanum ningrum). xi

13 Melalui metode RT-PCR dan analisis sekuen nukleotida dapat disimpulkan bahwa penyakit kuning pada tanaman mentimun di Baturiti, Tabanan, Bali berasosiasi dengan infeksi PeVYV. Isolat PeVYV Bali (Baturiti, Tabanan) pada tanaman mentimun tersebut memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan PeVYV yang menginfeksi tanaman cabai di Bali, Rembang dan Jepang. Penelitian ini merupakan laporan pertama di Indonesia bahwa tanaman mentimun terinfeksi Pepper Vein Yellow Virus (PeVYV). Masih diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai alternatif inang dari Pepper vein yellow virus (PeVYV), epidemologi, penyebaran penyakit dan metode untuk mengurangi kepadatan populasi vektor PeVYV xii

14 DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... PERSYARATAN GELAR.... LEMBAR PENGESAHAN... PENETAPAN PANITIA PENGUJI... SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... UCAPAN TERIMAKASIH... ABSTRAK... ABSTRACT... RINGKASAN... DAFTAR ISI... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... i ii iii iv v vi viii ix x xiii xv xvi BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian... 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA Mentimun Virus Yang Menginfeksi Tanaman Mentimun Penyakit Kuning Pepper vein yellow virus (PeVYV) Deteksi Virus BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP PENELITIAN DAN HIPOTESIS Kerangka Berpikir Penelitian xiii

15 3.2 Konsep Penelitian Hipotesis Penelitian BAB IV BAHAN DAN METODE PENELITIAN Pengamatan Penyakit Kuning (Yellowing) pada Tanaman Mentimun di Lapangan Deteksi Virus pada Jaringan Tanaman Mentimun Bergejala Kuning (Yelowwing) Melalui Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Penentuan Spesies Virus yang Berasosiasi dengan Penyakit Kuning (Yellowing) Melalui Sekuen Nukleotida BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN Gejala Penyakit di Lapangan Deteksi PeVYV Menggunakan RT-PCR Identifikasi dan Analisis PeVYV pada Tanaman Mentimun Pembahasan Umum BAB VI SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xiv

16 DAFTAR TABEL Halaman 5.1 Tingkat homologi (%) sekuen nukleotida gen protein selubung Pepper vein yellow virus (PeVYV) isolat Bali dengan isolat dari daerah/negara lain xv

17 DAFTAR GAMBAR Halaman 3.1 Skema Kerangka Berpikir Penelitian Skema Konsep Penelitian Gejala khas penyakit kuning (daun berwarna kuning, jaringan sekitar tulang daun tetap hijau, ukuran dan bentuk daun tidak mengalami perubahan) pada tanaman mentimun di Bali Hasil amplifikasi gen CP dengan metode reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT-PCR) Pohon filogenetika berdasarkan sekuen nukleotida gen protein selubung isolat Pepper vein yellow virus (pevyv) asal Indonesia, Yunani, Jepang, dan Cina menggunakan program MEGA V6.06 dengan pendekatan Neighbor-Joining dan pengulangan 1000 kali xvi