TESIS. INDUKSI MUTASI KROMOSOM DENGAN KOLKISIN PADA TANAMAN KESUNA BALI (Allium sativum Linn.) DAN ANALISIS DNA DENGAN MARKA RAPD

Transkripsi

1 TESIS INDUKSI MUTASI KROMOSOM DENGAN KOLKISIN PADA TANAMAN KESUNA BALI (Allium sativum Linn.) DAN ANALISIS DNA DENGAN MARKA RAPD LUH AYU JAMI WISTIANI NIM PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2014 i

2 INDUKSI MUTASI KROMOSOM DENGAN KOLKISIN PADA TANAMAN KESUNA BALI (Allium sativum Linn.) DAN ANALISIS DNA DENGAN MARKA RAPD Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Ilmu Biologi Program Pascasarjana Universitas Udayana LUH AYU JAMI WISTIANI NIM PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU BIOLOGI PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2014 ii

3 Lembar Pengesahan TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL 20 NOPEMBER 2014 Pembimbing I, Pembimbing II, Ir. Made Pharmawati, M.Sc.Ph.D. Dr. Dra.Ni Putu Adriani Astiti, M.Si. NIP NIP Mengetahui, Ketua Program Studi Ilmu Biologi Program Pascasarjana Universitas Udayana Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana, Ir. Ida Ayu Astarini, M.Sc. Ph.D. Prof.Dr.dr.A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K) NIP NIP iii

4 Tesis Ini Telah Diuji pada Tanggal 20 Nopember 2014 Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No. : 4369/UN14.4/HK/2014, Tanggal 18 Nopember 2014 Ketua : Ir. Made Pharmawati, M.Sc.Ph.D. Anggota : 1. Dr. Dra. Ni Putu Adriani Astiti, M.Si 2. Ir. Ida Ayu Astarini, M.Sc., Ph.D 3. Dra. Ni Luh Arpiwi, M.Sc., Ph.D 4. Dra. I Gusti Sugi Wahyuni, M.Si iv

5 SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT Saya yang bertanda tangan dibawah ini : Nama : LUH AYU JAMI WISTIANI NIM : Program Studi Judul Tesis : Ilmu Biologi : Induksi Mutasi Kromosom dengan Kolkisin Pada Tanaman Kesuna Bali (Allium sativum Linn.) dan Analisis DNA Dengan Marka RAPD. Dengan ini menyatakan bahwa Tesis ini bebas plagiat. Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam tulisan ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundangan undangan yang berlaku. Denpasar, 2014 Yang membuat pernyataan (LUH AYU JAMI WISTIANI) v

6 UCAPAN TERIMAKASIH Om Swastyastu Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa karena hanya atas asung kertha wara nugraha-nya/karunia-nya, tesis ini dapat diselesaikan. Penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Ir. Made Pharmawati, M.Sc. Ph.D., sebagai pembimbing I yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan, semangat, bimbingan saran dan bantuan zat kimia selama pelaksanaan penelitian dan penulisan tesis ini. Terimakasih sebesar-besarnya pula kepada Dr. Dra. Ni Putu Adriani Astiti, M.Si. selaku pembimbing II yang dengan penuh kesabaran memberikan bimbingan dan saran penulisan tesis ini. Terimakasih juga penulis sampaikan kepada para penguji tesis ini yaitu, Ir. Ida Ayu Astarini, M.Sc. Ph.D., Ni Luh Arpiwi, S.Si. M.Sc. Ph.D dan Dra. I Gusti Ayu Sugi Wahyuni, M.Si. yang telah banyak memberikan masukan, saran, sanggahan, koreksi, dan kritik yang membangun. Terimakasih juga disampaikan kepada Kepala Laboratorium Bioteknologi Tumbuhan Fakultas Pertanian dan staf Laboratorium Biomedik, FKH Universitas Udayana atas ijin penggunaan laboratorium dan bantuan selama pelaksanaan penelitian RAPD. Ucapan terimakasih juga ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr.dr. Ketut Suastika Sp. PD-KEMD. dan Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof.Dr.dr.A.A. Raka Sudewi, SP.S(K) atas kesempatan yang diberikan untuk menjadi mahasiswa pada program Pascasarjana Universitas Udayana. Tidak lupa pula penulis menyampaikan terimakasih kepada Ir. Ida Ayu Astarini, M.Sc. Ph.D. selaku Ketua Program Magister Ilmu Biologi Universitas Udayana atas segala fasilitas yang diberikan selama penulis mengikuti Program Pascasarjana Universitas Udayana. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang tulus kepada orang tua yang dengan penuh pengorbanan telah membesarkan dan mengasuh penulis selama ini, dan para sahabat yang selalu memberikan doa serta motivasi. Akhirnya penulis menyampaikan terimakasih kepada seluruh rekan-rekan Program Studi Ilmu Biologi angkatan 2012/2013 yang telah memberikan motivasi dan persahabatan selama menempuh pendidikan dan menyelesaikan tesis ini. vi

7 Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmat-nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan penyelesaian tesis ini, serta kepada penulis sekeluarga. Om Santi Santi Santi Om vii

8 ABSTRAK Induksi Mutasi Kromosom dengan Kolkisin Pada Tanaman Kesuna Bali (Allium sativum Linn.) dan Analisis DNA Dengan Marka RAPD. Tanaman bawang putih (Allium sativum Linn.) adalah tanaman holtikultura yang memiliki banyak manfaat terutama sebagai bumbu dan obat. Produksi bawang putih di Indonesia belum mampu memenuhi permintaan kebutuhan pangan masyarakat. Untuk mengatasi permasalahan tersebut diperlukan usaha seperti pemuliaan tanaman yang dapat menghasilkan kultivar-kultivar unggul bawang putih di Indonesia. Salah satu kultivar bawang putih yang ditanam di Bali adalah kesuna bali. Untuk meningkatkan produksi kesuna bali diperlukan perbaikan sifat dengan cara induksi mutasi. Kolkisin merupakan mutagen kimia yang dapat menambah variasi genetik pada tanaman.variasi genetik akibat pemberian kolkisin dapat dideteksi dengan pengamatan karakter morfologi, anatomi, dan penanda molekuler. Pengamatan secara molekuler dilakukan dengan menggunakan marka RAPD. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok dengan enam ulangan. Perlakuan mutagen kimia kolkisin yang digunakan adalah 5%, 10% dan 20%. Pengamatan dilakukan dengan melihat respon tanaman kesuna bali dari morfologi tanaman, sitologi tanaman dan analisis DNA. Pada penelitian ini digunakan lima primer RAPD untuk analisis DNA yaitu OPA 01, OPA 02, OPA 04, OPD 14 dan UBC 250. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan kolkisin berpengaruh positif terhadap morfologi dan sitologi tanaman serta terjadi perubahan sekuen pada DNA tanaman. Perlakuan kolkisin 10% dan 20% paling efektif dalam meningkatkan tinggi tanaman, panjang daun dan jumlah daun tanaman kesuna bali dibandingkan dengan kontrol. Perlakuan kolkisin tidak berpengaruh terhadap berat kering umbi kesuna bali. Pada uji sitologi, perlakuan kolkisin 20% menghasilkan indeks stomata terendah dibandingkan kontrol. Pada analisis jumlah kromosom perlakuan kolkisin 20% menghasilkan kromosom triploid (2n=3x=24). Analisis DNA dengan menggunakan primer OPA 01 dan UBC 250 menunjukkan perbedaan pola pita DNA antara kontrol dengan perlakuan kolkisin. Kata kunci : Allium sativum Linn., Kolkisin, mutasi, morfologi, sitologi, RAPD viii

9 ABSTRACT Induced Chromosome Mutation Using Colchicine In Kesuna Bali Plants (Allium sativum Linn.) And DNA Analysis Using with RAPD markers. Garlic (Allium sativum Linn.) is a horticultural crop that has many benefits, especially as spice and traditional medicine. Garlic production in Indonesia has not been able to meet the demands of the food needed by the community. To overcome this problems, plant breeding efforts are required such as breeding for superior cultivars of garlic in Indonesia. One of garlic cultivars planted in Bali is kesuna bali. To increase the production of kesuna bali, modification of kesuna bali properties can be done by means of induced mutation. Colchicines is a chemical mutagen which can increase the genetic variation. The variation caused by soaking of plant materials in colchicines can be detected by observation of morphological, anatomical, and molecular markers. Molecular observations were performed using RAPD markers. This research employed randomized block design with six replicates. In this experiment the concentration of colchicines used were 5%, 10% and 20%. Observations were made by evaluating the response of kesuna bali on plant morphology, cytology and using DNA analysis. In this study, five RAPD primers were used for DNA analysis (OPA 01, OPA 02, OPA 04, OPD 14 and UBC 250). The results of this study showed that colchicines treatment had an effect on morphology and cytology of plants as well as caused a change in the DNA sequence of kesuna bali. Colchicines at concentration 10% and 20% were most effective in increasing plant height, leaf length and leaf number of kesuna bali plants compared to controls. Colchicines had no effect on tuber dry weight of kesuna bali. In cytology test, colchicines treatment of 20% resulted in the lowest stomata index. In the analysis of the number of chromosomes, 20% colchicines treatment resulted in triploid plants (2n = 3x = 24). The DNA pattern analysis using primer OPA 01 and UBC 250 DNA showed that there were differences in DNA pattern between control and colchicines treatments. Keywords: Allium sativum Linn., Colchicine, mutation, morphology, cytology, RAPD ix

10 DAFTAR ISI SAMPUL DALAM... i PRASAYARAT GELAR... ii LEMBAR PENGESAHAN... iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI... iv SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... v UCAPAN TERIMAKASIH... vi ABSTRAK... viii ABSTRACT... ix DAFTAR ISI... x DAFTAR TABEL... xiv DAFTAR GAMBAR... xv DAFTAR LAMPIRAN... xvi BAB I. PENDAHULUAN Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian... 6 BAB II. KAJIAN PUSTAKA Bawang Putih (Allium sativum Linn.) Deskripsi Bawang Putih (Allium sativum Linn.) Syarat Tumbuh Bawang Putih (Allium sativum Linn.) Kandungan Kimia Bawang Putih (Allium sativum Linn.) x

11 2.1.4 Kesuna Bali (Allium sativum Linn.) Mutasi Mutagen Kolkisin Deteksi Mutan Deteksi Mutan Secara Morfologi Deteksi Melalui Perhitungan Jumlah Kromosom Deteksi Mutan dengan RAPD BAB III. KERANGKA BERFIKIR DAN KONSEP PENELITIAN Kerangka Berfikir Konsep Penelitian Hipotesis Penelitian BAB IV. METODE PENELITIAN Rancangan Penelitian Lokasi dan Waktu Penelitian Ruang Lingkup Penelitian Penentuan Sumber Data Variabel Penelitian Bahan Penelitian Instrumen Penelitian Prosedur Penelitian Persiapan Bahan Pembuatan Larutan Kolkisin Pembuatan Pewarna Aceto Orcein 2% Pembuatan Larutan Fiksatif Carnoy xi

12 4.8.2 Prosedur Kerja Teknik Perendaman Umbi dengan Kolkisin Teknik Penanaman Umbi Pengamatan Karakter Pertumbuhan Perhitungan Indeks Stomata Pembuatan Preparat Kromosom Analisis DNA Isolasi DNA Elektroforesis dan Penentuan Konsentrasi DNA Proses PCR (Polimerase Chain Reaction) DNA genomik Kesuna Bali (Allium sativum Linn.) dengan Penanda RAPD Elektroforesis Produk PCR Analisis Data BAB V HASIL PENELITIAN Karakteristik Morfologi Tanaman kesuna bali (Allium sativum Linn.) Tinggi Tanaman Panjang Daun Jumlah Daun Tanaman Abnormal Berat Kering Umbi Karakteristik Sitologi Tanaman kesuna bali (Allium sativum Linn.) Indeks Stomata Jumlah Kromosom Analisis PCR-RAPD. 45 xii

13 5.3.1 Isolasi DNA Kesuna Bali (Allium sativum Linn.) Optimalisasi PCR-RAPD PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction-Random Amplified Polymorphic DNA) Pengelompokan Tanaman Kesuna Bali Akibat Perlakuan Kolkisin BAB VI PEMBAHASAN Karakter Morfologi Kesuna Bali Akibat Pengaruh Kolkisin Karakteristik Sitologi Tanaman kesuna bali (Allium sativum Linn.) Indeks Stomata Kesuna Bali Jumlah Kromosom Kesuna Bali Tanaman Triploid DNA Genomik dan Kondisi PCR-RAPD PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction-Random Amplified Polymorphic DNA) Tanaman Kesuna Bali Pengelompokan Tanaman Kesuna Bali Hasil Perlakuan Kolkisin Poliploid Berdasarkan Penanda RAPD BAB VII SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xiii

14 DAFTAR TABEL Tabel 4.1 Nama Primer dan Urutan Basa Primer RAPD Tabel 5.1 Rata-rata Tinggi Tanaman Kesuna Bali. 36 Tabel 5.2 Rata-rata Panjang Daun Kesuna Bali Tabel 5.3 Rata-rata Jumlah Daun Kesuna Bali Tabel 5.4 Berat Kering Kesuna Bali Tabel 5.5 Indeks Stomata Kesuna Bali Tabel 5.6 Jumlah Kromosom Kesuna Bali. 42 Tabel 5.7 Ringkasan Pita DNA yang dihasilkan pada PCR dengan Primer OPA Tabel 5.8 Ringkasan Pita DNA Produk PCR dengan Primer UBC Tabel 5.9 Dendogram Similaritas Dua Puluh Empat Tanaman kesuna bali Berdasarkan Karakter Molekular dengan Metode UPGMA.. 55 xiv

15 DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Bawang Putih Tunggal (kesuna bali) (Allium sativum Linn.)... 8 Gambar 2.2 Kesuna Bali (Allium sativum Linn.)... 9 Gambar 2.3 Struktur Molekul Kolkisin Murni Gambar 3.1 Bagan Konsep Penelitian Gambar 4.1 Denah Petak Percobaan.. 23 Gambar 5.1 Tinggi Tanaman Kesuna Bali Gambar 5.2 Tanaman Kesuna Bali Abnormal pada Perlakuan Kolkisin 20% Gambar 5.3 Variasi Bentuk Umbi Kesuna Bali setelah Panen.. 40 Gambar 5.4 Stomata kesuna bali 43 Gambar 5.5 Kromosom kesuna bali Gambar 5.6 Kromosom C-anafase Kesuna Bali Akibat Perlakuan Kolkisin. 44 Gambar 5.7 DNA Genomik Hasil Isolasi Daun kesuna bali.. 45 Gambar 5.8 Hasil Optimalisasi PCR-RAPD DNA kesuna bali mutan.. 46 Gambar 5.9 Hasil Optimalisasi PCR-RAPD DNA kesuna bali mutan primer OPA Gambar 5.10 Elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer OPA Gambar 5.11 Elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer UBC Gambar 5.12 Dendogram kesuna bali mutan hasil analisis kluster dengan metode UPGMA. 56 xv

16 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Hasil Anova Tinggi Tanaman Kesuna Bali 2 Minggu Lampiran 2. Hasil Anova Tinggi Tanaman Kesuna Bali 6 Minggu Lampiran 3. Hasil Anova Tinggi Tanaman Kesuna Bali 10 Minggu Lampiran 4. Hasil Anova Tinggi Tanaman Kesuna Bali 14 Minggu Lampiran 5. Hasil Anova Jumlah Daun Kesuna Bali 2 Minggu Lampiran 6. Hasil Anova Jumlah Daun Kesuna Bali 6 Minggu 94 Lampiran 7. Hasil Anova Jumlah Daun Kesuna Bali 10 Minggu.. 95 Lampiran 8. Hasil Anova Jumlah Daun Kesuna Bali 14 Minggu.. 96 Lampiran 9. Hasil Anova Panjang Daun Kesuna Bali 2 Minggu Lampiran 10. Hasil Anova Panjang Daun Kesuna Bali 6 Minggu. 98 Lampiran 11. Hasil Anova Panjang Daun Kesuna Bali 10 Minggu Lampiran 12. Hasil Anova Panjang Daun Kesuna Bali 14 Minggu Lampiran 13. Hasil Anova Berat Umbi Kering Kesuna Bali Lampiran 14. Hasil Anova Indeks Stomata Kesuna Bali Lampiran 15. Hasil Anova Jumlah Kromosom Kesuna Bali Lampiran 16. Perhitungan BAR Stomata Kesuna Bali Lampiran 17. Perhitungan BAR Kromosom Kesuna Bali xvi