BIODIVERSITAS MIKROBA TERMOFILIK PADA SAMPEL KAWAH HUJAN, KAMOJANG-JAWA BARAT DISERTASI

Transkripsi

1 BIODIVERSITAS MIKROBA TERMOFILIK PADA SAMPEL KAWAH HUJAN, KAMOJANG-JAWA BARAT DISERTASI Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari Institut Teknologi Bandung Oleh: HENI YOHANDINI KUSUMAWATI NIM (Program Studi Kimia) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008

2 ABSTRAK BIODIVERSITAS MIKROBA TERMOFILIK PADA SAMPEL KAWAH HUJAN, KAMOJANG-JAWA BARAT Oleh Heni Yohandini Kusumawati NIM : Mikroba termofilik telah diketahui bersifat unik berkaitan dengan kemampuannya tumbuh optimum pada suhu tinggi. Penelitian mengenai mikroba termofilik dapat memberikan keuntungan baik bagi pengembangan ilmu dasar maupun kemungkinan aplikasinya dalam proses industri. Indonesia banyak memiliki sumber air panas di sekitar gunung berapi yang merupakan habitat potensial bagi mikroba termofilik. Banyaknya sumber air panas dengan kondisi fisik dan kimiawi yang berbeda diharapkan dapat menjadi sumber biodiversitas yang tinggi bagi mikroba termofilik. Pada saat ini, penelitian mengenai biodiversitas mikroba termofilik di Indonesia masih sangat jarang. Penelitian yang dilakukan dimaksudkan untuk memperoleh informasi mengenai biodiverditas mikroba termofilik dari sumber air panas Kawah Hujan A dan Kawah Hujan B, Kamojang, Jawa Barat. Di samping itu juga diharapkan untuk mendapatkan kultur mikroba yang potensial untuk dikembangkan dalam aplikasi praktis. Dalam menganalisis biodiversitas mikroba digunakan dua pendekatan, yaitu pendekatan yang bergantung dan tidak bergantung pada kultivasi. Metode analisis yang digunakan didasarkan pada perbedaan urutan fragmen gen 16S rrna. Fragmen gen 16S rrna diperoleh dengan cara amplifikasi PCR dari DNA kromosom mikroba sampel yang dilanjutkan dengan analisis DGGE. Masingmasing pita DNA hasil analisis DGGE direamplifikasi untuk ditentukan urutan nukleotidanya. Masing-masing urutan nukleotida dianalisis tingkat kekerabatannya dengan menggunakan analisis filogenetik. Dalam melakukan analisis biodiversitas mikroba, proses isolasi DNA kromosom merupakan tahapan yang penting. Pada penelitian ini digunakan dua metode lisis sel, yaitu yang berbasis enzimatis dan perusakan fisik (bead beating). Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode enzimatis memiliki keterbatasan dalam memecah sel yang terperangkap dalam lumpur atau yang membentuk spora dan biofilm. Sedangkan metode perusakan fisik memiliki kemungkinan untuk melepas mikroba yang tersembunyi atau memecah spora dan biofilm, hanya saja sering mendapatkan kualitas DNA kromosom yang kurang baik. Analisis biodiversitas menggunakan pendekatan yang tidak bergantung pada kultivasi dimaksudkan untuk melihat diversitas mikroba yang dominan di alam, ii

3 sedangkan pendekatan yang bergantung pada kultivasi dimaksudkan untuk mendeteksi mikroba yang tidak dominan di alam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa diversitas mikroba yang terdeteksi dominan di alam pada umumnya berbeda dengan mikroba yang terdeteksi di kultur. Biodiversitas mikroba yang dominan di kultur sangat bergantung pada komposisi media yang digunakan. Pada sumber Kawah Hujan A yang merupakan kawah dengan ph netral, mikroba yang dominan merupakan kelompok bakteri yang memiliki kedekatan tertinggi dengan kelas gamma Proteobakteria. Sedangkan mikroba yang terdeteksi dalam kultur sebagian besar termasuk dalam filum Firmicutes, yang memiliki kedekatan tertinggi dengan genus Geobacillus dan Anoxybacillus, dan mikroba dari filum Deinococcus yang memiliki kedekatan dengan genus Thermus. Berdasarkan hasil analisis penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna dengan data GenBank mengindikasikan bahwa mikroba dari kelompok gamma Proteobakteria kemungkinan berbeda dengan mikroba yang sudah ditemukan saat ini. Kawah Hujan B yang bersifat sangat asam dengan kandungan sulfat sangat tinggi didominasi oleh mikroba yang memiliki kedekatan tertinggi dengan filum Crenorchaeota dari kelompok archaea dan kelas gamma Proteobakteria dari bakteri. Sedangkan hasil analisis mikroba dari kultur Kawah Hujan B pada umumnya didominasi oleh bakteri yang memiliki kedekatan tertinggi dengan genus Alicyclobacillus dari filum Firmicutes serta genus Pantoea/Enterobacter dan Pseudomonas dari kelas Gamma proteobakteria. Analisis penjajaran urutan nukleotida fragmen gen 16S rrna dengan data GenBank menyarankan bahwa kelompok Crenorchaeota dari Kawah Hujan B juga kemungkinan berbeda dengan mikroba yang sudah ditemukan. Kultur murni yang berhasil diisolasi dari kultur Kawah Hujan A sebagian besar merupakan genus Geobacillus berdasarkan hasil identifikasi menggunakan urutan gen 16S rrna utuh. Selain Geobacillus, beberapa koloni memiliki kedekatan dengan genus Pantoea/Enterobacter. Sedangkan kultur murni dari Kawah Hujan B belum diperoleh. Informasi mengenai biodiversitas mikroba pada sumber Kawah Hujan belum pernah dilaporkan sebelumnya. Informasi ini diharapkan bisa menambah wawasan mengenai potensi sumber daya alam di Indonesia, dalam hal ini biodiversitas mikroba termofilik, dan menyediakan bahan (kultur mikroba) bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan penggunaannya dalam proses industri. Kata kunci: biodiversitas, mikroba termofilik, Kawah Hujan, gen 16S rrna, PCR, analisis DGGE. iii

4 ABSTRACT BIODIVERSITY OF MICROBIAL THERMOPHILIC FROM KAWAH HUJAN, KAMOJANG-WEST JAVA by Heni Yohandini Kusumawati NIM : Thermophilic microbes are unique cells due to their capability to grow optimal in high tempeature. Research on thermophilic microbes has advantages for development of fundamental science and its aplication in industrial processes. Indonesia has many volcanoes with abundant hot springs which are potential habitats for thermophilic microbes. Many of these hot springs have different phisical and chemical properties. This difference makes Indonesia s hot springs a good source for high biodiversity of thermophilic microbes. Nowdays, research on biodiversity of thermophilic microbes in Indonesia are very limited. The objective of this reseach is to get information of biodiversity of thermophilic microbes in Kawah Hujan A and Kawah Hujan B, beside to obtain microbial cultures which are potential for industrial aplication. Culture-dependent and culture-independent approaches were used to analyze biodiversity of thermophilic microbes. The method was based on differences of 16S rrna gene sequences obtained from amplification of chromosomal DNA of microbial samples. The 16S rrna gene fragments with different sequences were separated by DGGE apparatus. Each of bands from DGGE was targeted for nucleotide sequencing. Homology of the nucleotide sequences was analyzed using computational analysis trough Phylip program combining with phylogenetic analyis. Chromosomal DNA isolation is crucial method for diversity analysis. In these research two methods of cell lysis, enzymatic and physical based methods were used to lysis the cell. The result showed that enzymatic based method has limitation to disrupt cell which trapped on the mud or spores and biofilm form cells. Meanwhile, physical disruption could lysis the trapping cell, spore, and biofilm form cell; however the chromosomal DNA often fragmented. Culture-independent strategy is used to analyze the dominant microbes in natural habitat, while culture-independent approaches are used to detect less populating microbes. The result showed that the microbes detected by culture-independent were different with detected by culture-dependent strategies. The application of additional nutrient in the culture was crucial to detect culturable microbes. iv

5 In neutral hot spring (Kawah Hujan A), predominated microbes in nature have high homology with gamma Proteobacteria. Meanwhile, the predominated microbes in culture were belonged to Firmicutes and Deinococcus phyla. The highest homology for Firmicutes phylum was Geobacillus and Anoxybacillus genera, while for Deinococcus phylum, was Thermus genus. From detail alignment analysis suggested that the gamma proteobacteria from Kawah Hujan A were different with other known gamma proteobacteria. The result from Kawah Hujan B, very acidic with high sulphate content, were predominated by microbes that have closest homology with Crenorchaeota and Proteobacteria phyla, especially from class of gamma proteobacteria. Meanwhile, predominated microbes in culture were belonged to Alicyclobacillus genus from Firmicutes phylum, and Pantoea/Enterobacter and Pseudomonas genera from Proteobacteria phylum. Based on detail alignment analysis, the Crenorchaeota detected from Kawah Hujan B were also different with other Crenorchaeota known before. The pure culture isolated from Kawah Hujan A based on the sequence of the whole 16S rrna gene were mostly belong to Geobacillus genus. In addition of Geobacillus, some colonies were identified as Pantoea/Enterobacter. Meanwhile pure culture from Kawah Hujan B has not succesfully isolated. Information on biodiversity of microbes of Kawah Hujan hot spring has not been reported yet. This information is broader our knowledge on natural potential of Indonesia, especially on biodiversity of thermophilic microbes, and provide a resource of microbes for development of science and its application in industrial processes. Keywords: biodiversity, thermophilic microbe, Kawah Hujan, 16S rrna gene, PCR, DGGE. v

6 LEMBAR PENGESAHAN BIODIVERSITAS MIKROBA TERMOFILIK PADA SAMPEL KAWAH HUJAN, KAMOJANG-JAWA BARAT Oleh Heni Yohandini Kusumawati NIM : Menyetujui Tim Promotor Tanggal... Ketua (Akhmaloka, PhD) Anggota Anggota (Dr. Pingkan Aditiawati) (Dr. Fida Madayanti) vi

7 PEDOMAN PENGGUNAAN DISERTASI Disertasi Doktor yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh disertasi haruslah seizin Dekan Sekolah Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. Perpustakaan yang meminjam disertasi ini untuk keperluan anggotanya harus mengisi nama dan tanda tangan peminjam dan tanggal pinjam. vii

8 UCAPAN TERIMA KASIH Segaka puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-nya, karena dengan izin-nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan disertasi yang merupakan salah satu syarat dalam menempuh pendidikan Program Doktor di Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bandung. Penulis menyadari keterbatasan yang dimiliki dalam melaksanakan penelitian dan menyelesaikan disertasi ini. Dengan bimbingan dan dukungan Tim Promotor, dosen, keluarga dan sahabat, akhirnya disertasi ini dapat diselesaikan. Oleh sebab itu pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih yang tidak terhingga kepada Bapak Akhmaloka, Ph.D, Ibu Fida Madayanti, Ph.D, dan Ibu Dr. Pingkan Aditiawati selaku Tim Promotor yang telah berkenan membimbing, memberikan dorongan, nasehat dan arahan dengan penuh kesabaran selama penulis melakukan penelitian hingga selesainya disertasi ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kapada: Direktur Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Republik Indonesia yang telah memberikan beasiswa kepada penulis selama mengikuti pendidikan Program Doktor di Program Studi Kimia, FMIPA, ITB. Dekan Sekolah Pascasarjana, Ketua Program Studi Kimia beserta seluruh staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan kesempatan dan pelayanan selama penulis mengikuti pendidikan di Program Studi Kimia, FMIPA, ITB. Rektor, Dekan FMIPA, dan Ketua Departemen Kimia, Universitas Sriwijaya, yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan di Program Studi Kimia, FMIPA, ITB. viii

9 Bapak Dr. Hadi Sutedjo, Bapak Achmad Saefuddin Noer, Ph.D, Ibu Dessy Natalia, Ph.D, dan Bapak Dr. Rukman Hertadi, atas segala saran dan motivasi yang telah diberikan kapada penulis. Bapak Dr. Zeilly Nurachman yang telah mengizinkan penulis menggunakan alat filter holder. Kepala Lab Kimia Analitik, Program Studi Kimia, FMIPA, ITB, yang telah mengizinkan penulis menggunakan alat AAS dan Sdr. Aman Sentausa, MSi yang telah membantu penulis dalam menganalisis sampel air menggunakan alat AAS. Rekan-rekan dan semua sahabat yang setia dalam suka maupun duka (Prima Endang S, MSi, Santi Nurbaiti, MSi, Hira Helwati, MSi, Agustina Lulus, MSi, Dr. Laksmi Ambarsari, Made Puspasari, MSi, Baiq Vera El Viera, MSi, Febriani, MSi, Muhtar Kosim, SSi, Savante, MSi, Dwita, MSi, Eka Susanti, MSi, Fernita, MSi, Rusdi, SSi) yang telah memberikan segala bantuan, dukungan, dan semangat. Pak Yayat, Bu Esar, Bu Untari, Pak Edi, Pak Dadan, dan Pak Kurdi atas bantuan dan kerjasamanya selama penulis bekerja di laboratorium penelitian. Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada orang tua penulis, Ibu Hj. Ai Hotimah, Bapak H. Yuhana Saefullah, dan Ibu Aisyah, atas segala perhatian, kasih sayang, dan doa. Kakak-kakak dan Adikadik beserta keluarga yang telah memberikan perhatian dan dorongan semangatnya. Suami dan putra-putra tercinta Adry, Azmi, dan Ali yang selalu menjadi sumber inspirasi dan motivasi, dengan segala doa dan dukungannya. Semoga Allah SWT membalas dengan kebaikan yang lebih banyak. Akhirnya penulis berharap disertasi ini dapat bermanfaat sebagai karya ilmiah bagi pembaca yang budiman. Bandung, Juli 2008 Penulis ix

10 DAFTAR ISI ABSTRAK... ii ABSTRACT... iv LEMBAR PENGESAHAN... vi PEDOMAN PENGGUNAAN DISERTASI... vii UCAPAN TERIMA KASIH... viii DAFTAR ISI... x DAFTAR GAMBAR... xii DAFTAR TABEL... xv DAFTAR LAMPIRAN... xvii DAFTAR SINGKATAN... xviii BAB I Pendahuluan... 1 I.1 Latar Belakang Masalah... 1 I.2 Masalah Penelitian... 3 I.3 Tujuan Penelitian... 3 I.4 Cara Pendekatan dan Metode Penelitian yang Digunakan... 4 I.5 Pelaksanaan Penelitian secara Garis Besar... 4 I.6 Sistematika Disertasi... 5 BAB II Tinjauan Pustaka... 6 II.1 Keberadaan Mikroba di Alam... 6 II.2 Mikroba Termofilik dan Hipertermofilik... 8 II.3 Studi Komunitas Mikroba II.3.1 Analisis tradisional II.3.2 Analisis molekular terhadap komunitas mikroba II.4 Analisis Filogenetik II.4.1 Metode Jarak (Distance Methods) II.4.2 Metode Karakter Diskrit II.5 Kawah Kamojang BAB III Alat, Bahan dan Metode Penelitian III.1 Alat-alat III. 2 Bahan-bahan III. 3 Metode Penelitian III.3.1 Pengambilan sampel x

11 III.3.2 Isolasi mikroba dengan cara filtrasi III.3.3 Isolasi mikroba dengan cara kultivasi III.3.4 Pewarnaan Gram mikroba III.3.5 Isolasi DNA kromoson III.3.6 Elektroforesis gel agarosa III.3.7 Amplifikasi DNA III.3.8 Amplifikasi DNA III.3.9 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) III.3.10 Pewarnaan DNA dengan perak nitrat (Silver staining) III.3.11 Ekstraksi DNA dari gel DGGE III.3.12 Penentuan urutan DNA III.3.13 Analisis filogenetik III.3.14 Analisis kandungan kimia air kawah BAB IV Hasil dan Pembahasan IV.1 Kondisi Fisik dan Kimia Kawah Hujan IV.2 DNA Kromosom Mikroba IV.2.1 DNA kromosom sampel Kawah Hujan A IV.2.2 DNA kromosom sampel Kawah Hujan B IV.3 Fragmen gen 16S rrna IV.3.1 Fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan A IV.3.2 Fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B IV.4 Profil DGGE Fragmen Gen 16S rrna IV.4.1 Profil DGGE sampel Kawah Hujan A IV.4.2 Profil DGGE sampel Kawah Hujan B IV.4.3 Urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan IV.5 Kekerabatan terdekat Sampel Mikroba Kawah Hujan IV.5.1 Kekerabatan terdekat sampel Kawah Hujan A IV.5.2 Kekerabatan terdekat sampel Kawah Hujan B IV.6 Mikroba Kultur Tunggal IV.6.1 DNA kromosom mikroba kultur tunggal IV.6.2 Gen 16S rrna mikroba kultur tunggal IV.6.3 Kemiripan tertinggi mikroba kultur tunggal IV.7 Diskusi Umum BAB V Kesimpulan Daftar Pustaka xi

12 DAFTAR GAMBAR Gambar II.1 Pohon filogenetik universal berdasarkan urutan rrna subunit kecil (disalin dari Pace, 1997)... 8 Gambar II.2 Prinsip metode-metode fingerprinting DNA yang digunakan untuk analisis komunitas mikroba Gambar IV.1 Keadaan Kawah Hujan pada saat pengambilan sampel Gambar IV.2 Hasil filtrasi sampel Kawah Hujan A Gambar IV.3 Perbandingan DNA kromosom sampel Kawah Hujan A menggunakan metode ekstraksi berbeda Gambar IV.4 Mikroba hasil pewarnaan Gram sampel Kawah Hujan A hasil kultivasi (perbesaran 400 kali) Gambar IV.5 DNA kromosom kultur isolat Kawah Hujan A Gambar IV.6 Hasil filtrasi sampel Kawah Hujan B Gambar IV.7 Perbandingan DNA kromosom sampel Kawah Hujan B menggunakan metode ekstraksi berbeda Gambar IV.8 Mikroba hasil pewarnaan Gram sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi (perbesaran 400 kali) Gambar IV.9 DNA kromosom kultur sampel Kawah Hujan B Gambar IV.10 Elektroforegram fragmen gen 16S rrna hasil amplifikasi sampel filtrasi Kawah Hujan A yang diencerkan berseri Gambar IV.11 Elektroforegram fragmen gen 16S rrna hasil amplifikasi sampel kultivasi Kawah Hujan A Gambar IV.12 Elektroforegram fragmen gen 16S rrna hasil amplifikasi sampel Kawah Hujan B Gambar IV.13 Profil DGGE komunitas mikroba Kawah Hujan A dan penomoran pita-pita yang dipotong dan direamplifikasi Gambar IV.14 Elektroforegram hasil DGGE Kawah Hujan A Gambar IV.15 Profil DGGE komunitas mikroba Kawah Hujan B dan penomoran pita-pita yang dipotong dan direamplifikasi Gambar IV.16 Elektroforegram hasil reamplifikasi pita-pita DGGE Gambar IV.17 Elektroforegram hasil reamplifikasi gel DGGE tanpa pita xii

13 Gambar IV.18 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rrna sampel filtrasi Kawah Hujan A dengan metode lisis sel enzimatis Gambar IV.19 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rrna sampel filtrasi Kawah Hujan A dengan metode lisis sel bead-beating Gambar IV.20. Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan A hasil filtrasi Gambar IV.21 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel filtrasi Kawah Hujan A dengan urutan pembanding Gambar IV.22 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna multi kopi Gambar IV.23 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan A hasil kultivasi dalam beberapa media Gambar IV.24 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan A hasil kultivasi Gambar IV.25 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rrna sampel filtrasi Kawah Hujan B dengan metode lisis sel enzimatis Gambar IV.26 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rrna sampel filtrasi Kawah Hujan B dengan metode lisis sel bead-beating Gambar IV.27 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B hasil filtrasi menggunakan metode lisis enzimatis dengan urutan nukleotida pembandingnya Gambar IV.28. Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B hasil filtrasi menggunakan metode lisis enzimatis dengan urutan pembanding dari kelas gamma Proteobakteria Gambar IV.29AHasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B hasil filtrasi menggunakan lisis sel bead-beating yang dekat dengan kelompok archaea Gambar IV.29B Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B hasil filtrasi menggunakan lisis sel bead-beating yang dekat dengan Aeromonas Gambar IV.30 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media P xiii

14 Gambar IV.31 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media PB Gambar IV.32 Pohon filogenetik urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media ¼ LB Gambar IV.33 Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel kultivasi Kawah Hujan B dalam media P dengan urutan pembanding Gambar IV.34A Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media ¼ LB dengan pembandingnya yang dekat dengan Alicyclobacillus Gambar IV.34B Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rrna sampel Kawah Hujan B hasil kultivasi dalam media ¼ LB dan pembandingnya yang dekat dengan kelas gamma Proteobakteria Gambar IV.35 Elektroforegram DNA kromosom kultur tunggal sampel Kawah Hujan A Gambar IV.36 Elektroforegram hasil amplifikasi gen 16S rrna kultur tunggal sampel Kawah Hujan A xiv

15 DAFTAR TABEL Tabel III.1 Jenis primer yang digunakan dalam reaksi amplifikasi PCR dan sekuensing Tabel IV.1. Perbedaan kondisi fisik dan kimia Kawah Hujan A dan B Tabel IV.2 Media yang digunakan untuk kultivasi sampel Kawah Hujan A 46 Tabel IV.3 Kekerabatan terdekat kelompok mikroba yang terdeteksi pada sampel Kawah Hujan A dan Kawah Hujan B Tabel C-1 Nomor akses urutan nukleotida sampel yang dideposit di GenBank Tabel H-1. Absorban rata-rata larutan standar Ca dan sampel hasil pengukuran dengan metode AAS pada panjang gelombang 422 nm Tabel H-2. Absorban rata-rata larutan standar Mg dan sampel hasil pengukuran dengan metode AAS pada panjang gelombang 285,2 nm Tabel H-3. Absorban rata-rata larutan standar Fe dan sampel hasil pengukuran dengan metode AAS pada panjang gelombang 248,3 nm Tabel H-4. Absorban rata-rata larutan standar Mn dan sampel hasil pengukuran dengan metode AAS pada panjang gelombang 279,5 nm Tabel H-5. Absorban rata-rata larutan standar Na dan sampel hasil pengukuran dengan metode AAS pada panjang gelombang 589 nm Tabel H-6. Absorban rata-rata larutan standar K dan sampel hasil pengukuran dengan metode AAS pada panjang gelombang 766,5 nm Tabel H-7. Absorban rata-rata larutan standar Pb dan sampel hasil pengukuran dengan metode AAS pada panjang gelombang 217 nm xv

16 Tabel H-8. Absorban rata-rata larutan standar Cu dan sampel hasil pengukuran dengan metode AAS pada panjang gelombang 324,7 nm xvi

17 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran A. Komposisi Media Pertumbuhan Mikroba (Atlas, 1993) Lampiran B. Prosedur Analisis Penjajaran Nukleotida dan Konstruksi Pohon Filogenetik Lampiran C. Accession Number GenBank Urutan Nukleotida Sampel Kawah Hujan Lampiran D. Contoh Elektroforegram Hasil Sekuensing Lampiran E. Posisi Daerah Variabel dan Daerah Lestari pada Gen 16S rrna Escherichia coli Lampiran F. Hasil Penjajaran Urutan Gen 16S rrna Kultur Tunggal (Geobacillus) Lampiran G. Hasil Penjajaran Urutan Gen 16S rrna Kultur Tunggal yang Dekat dengan genus Enterobacter Lampiran H. Penentuan Kadar Logam dengan AAS xvii

18 DAFTAR SINGKATAN Singkatan Nama AAS APS BLASTN b/v C DGGE DNA dntp EDTA FAME g kb km LB m M mg ml mm mm NCBI OD PCR pb ppm RDP RISA rrna Atomic absorption spectroscopy Ammonium persulfate Basic local alignment search tool (nucleotide) Berat per volum Celcius Denaturing gradient gel electrophoresis Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside triphosphate Ethylene diamine tetra acetic acid Fatty acid methyl ester Gram Kilo basa Kilo meter Luria-Bertani Meter Molar Mili gram Mili liter Mili meter Mili molar National Centre of Biotechnological Information Optical density Polymerase chain reaction Pasang basa Part per million Ribosomal Database Project Ribosomal intergenic spacer analysis Ribosomal ribonucleic acid xviii

19 RNA SDS SSCP TEMED TGGE TRFLP UV v/v μg μl Ribonucleic acid Sodium dodesyl sulfate Single strand conformation polymorphism N,N,N,N -tetra-etilen-diamine Temperature gradient gel electrophoresis Terminal restriction fragment length polymorphism Ultra violet Volum per volum Mikro gram Mikro liter xix