IDENTIFIKASI MOLEKULER KELAINAN GENETIK SITRULINEMIA DAN DEFICIENCY OF URIDINE MONOPHOSPHATE SYNTHASE

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI MOLEKULER KELAINAN GENETIK SITRULINEMIA DAN DEFICIENCY OF URIDINE MONOPHOSPHATE SYNTHASE (DUMPS) PADA POPULASI SAPI PERAH FRIESIAN-HOLSTEIN NUR KHABIBAH SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa Identifikasi Molekuler Kelainan Genetik Sitrulinemia dan Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMPS) pada Populasi Sapi Perah Friesian-Holstein adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Agustus 2009 Nur Khabibah NIM G

3 ABSTRACT NUR KHABIBAH. Molecular Identification of Genetic Defects of Citrullinaemia and Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMPS) in Populations of Holstein-Friesian Cattle. Under direction of R.R. DYAH PERWITASARI and ANNEKE ANGGRAENI. Genetic disorder is hereditary which can cause physical disorder or the anomaly in the function of the body. Citrullinemia and deficiency of uridine monophosphate synthase (DUMPS) is one of the genetic disorders in Holstein- Friesian cattle. Probably, the spread of citrullinemia and DUMPS is through the use of semen by superior bulls in the artificial insemination (AI) program. The production and distribution of the frozen semen of Holstein-Friesian cattle in Indonesia, mainly by Institute for Artificial Insemination in Singosari, East Java, and Lembang, West Java. The frozen semen of Holstein-Friesian cattle is from imported bulls from a number of countries such as America, Canada, France, New Zealand and Japan. The aim of this research was to determine composition of genes caused two kinds of genetic disorders in Holstein-Friesian cattle, that is citrullinemia and DUMPS. The samples were taken from the government breeding stations and dairy farmers with the total number of 676. The method to determine genotype of ASS and UMPS genes is PCR-RFLP. Then the product of the total ASS gene was digested by Ava II and UMPS gene with Ava I (Fermentas). The result of amplification between ASS and UMPS genes was visualized in gel polyacrylamide 6%, followed by silver staining. Based on genotyping of ASS and UMPS genes, there was a carrier cattle of citrullinemia at population Pondok Rangon. The frequency of carrier cattles at dairy farmers was 3.85% with the frequency of alleles mutant of On the other hand, the result of mutation UMPS identification on the government breeding stations and dairy farmers showed that there was no carrier DUMPS. The absence of genetic disorders of citrullinemia or DUMPS at the government breeding stations showed that imported Holstein-Friesian cattle was free from the two disorders. However, the control on these disorders should always be conducted, especially on the bull which was the source of sperm because the bulls used in AI program have a big potential to spread a genetic disorder at dairy farmers. Key words: citrullinaemia, DUMPS, genetic disorder, Holstein-Friesian cattle, PCR-RFLP

4 RINGKASAN NUR KHABIBAH. Identifikasi Molekuler Kelainan Genetik Sitrulinemia dan Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMPS) pada Populasi Sapi Perah Friesian-Holstein. Dibimbing oleh R.R. DYAH PERWITASARI dan ANNEKE ANGGRAENI. Kelainan genetik adalah kelainan bersifat menurun yang menyebabkan kelainan fisik atau fungsi tubuh. Beberapa kejadian kelainan genetik pada sapi perah sebagian besar disebarkan oleh pejantan unggul. Semen pejantan unggul dijadikan sebagai sumber semen dalam perkawinan inseminasi buatan. Dua diantara kelainan genetik tersebut adalah sitrulinemia dan deficiency of uridine monophosphate synthase (DUMPS). Kedua kelainan genetik tersebut mengakibatkan kelainan pada metabolisme tubuh sapi. Kejadian tersebut dapat menimbulkan kerugian bagi peternak. Produksi dan distribusi semen beku sapi perah Friesian-Holstein (FH) di dalam negeri terutama dihasilkan di Balai Besar Inseminasi Buatan Singosari Jawa Timur dan Balai Inseminasi Buatan Lembang Jawa Barat. Semen beku sapi perah FH berasal dari pejantan yang diimpor dari sejumlah negara seperti Amerika Serikat, Kanada, Perancis, Australia, New Zealand dan Jepang. Dengan demikian, kemungkinan penyebaran kelainan genetik sitrulinemia dan DUMPS dapat pula sampai ke Indonesia. Sejalan dengan perkembangan teknik analisis DNA, kejadian mutasi dapat diketahui sejak awal dengan relatif mudah. Teknik ini dapat mengetahui adanya mutasi sampai ke tingkat molekul DNA. Teknik analisis DNA telah berhasil dilakukan di beberapa negara untuk menguji kelainan genetik pada sapi perah FH. Identifikasi dini dilakukan terutama terhadap pejantan yang dijadikan sebagai sumber semen. Tujuan penelitian ini adalah memetakan komposisi genotipe gengen yang menyebabkan dua kelainan genetik pada populasi sapi perah FH, yaitu sitrulinemia dan DUMPS. Sampel darah sapi perah FH diambil melalui vena jugularis dan sebagian dari vena koksigalis. Sampel berasal dari pusat pembibitan sapi perah pemerintah dan peternakan sapi perah rakyat dengan jumlah total 676. Sampel diekstraksi dengan DNA isolation Mini Kit for fresh blood (Geneaid) untuk mengisolasi molekul DNA. Metode untuk menentukan genotipe gen argininosuccinate synthase (ASS) untuk kelainan sitrulinemia dan gen uridine 5-monophosphate synthase (UMPS) untuk kelainan DUMPS adalah PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism). Amplifikasi gen ASS dan gen UMPS menggunakan mesin PCR Thermal Cycler MP4 (TaKaRa). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen ASS dengan runutan F:GTG TTC ATT GAG GAC ATC, R:CCG TGA GAC ACA TAC TTG dengan suhu penempelan 61 C. Amplifikasi gen UMPS menggunakan primer dengan runutan F: GCA AAT GGC TGA AGA ACA TTC TG, R: GCT TCT AAC TGA ACT CCT CGA GT dengan suhu penempelan C. Selanjutnya produk total gen ASS dipotong dengan enzim Ava II dan gen UMPS dengan enzim Ava I (Fermentas). Hasil amplifikasi gen ASS dan gen UMPS divisualisasikan pada gel poliakrilamid 6% dilanjutkan dengan pewarnaan perak.

5 Pemotongan produk PCR gen ASS sepanjang 176 pb menghasilkan dua fragmen DNA untuk individu normal homozigot. Pada individu heterozigot (karier sitrulinemia) menghasilkan tiga fragmen DNA. Panjang fragmen DNA individu normal homozigot (CC) yaitu 98 pb dan 78 pb. Panjang ketiga fragmen DNA individu karier sitrulinemia atau heterozigot (Cc) masing-masing sebesar 176 pb, 98 pb dan 78 pb. Sementara itu pemotongan produk PCR gen UMPS sepanjang 108 pb menghasilkan tiga fragmen DNA yang merupakan individu normal. Panjang ketiga fragmen pada individu normal homozigot (DD) masingmasing berukuran 53 pb, 36 pb dan 19 pb. Berdasarkan penentuan genotipe gen ASS dan gen UMPS ditemukan satu sapi karier sitrulinemia pada lokasi peternakan sapi perah rakyat Pondok Rangon. Frekuensi sapi karier pada peternakan rakyat tersebut sebesar 3.846% dengan frekuensi alel mutan sebesar Satu sapi karier sitrulinemia di peternakan rakyat kemungkinan berasal dari sapi betina impor sebelum tahun Hal ini didukung dengan tidak ditemukannya sapi karier di pusat pembibitan sapi perah pemerintah. Hal lain yang mendukung adalah kecilnya frekuensi alel mutan pada peternakan sapi perah rakyat. Hasil identifikasi mutasi gen UMPS pada pusat pembibitan sapi perah maupun peternakan sapi perah rakyat tidak ditemukan sapi karier DUMPS. Tidak teridentifikasinya kelainan genetik baik sitrulinemia maupun DUMPS pada pusat pembibitan sapi perah pemerintah menunjukkan sapi perah FH yang diimpor bebas dari kedua kelainan tersebut. Meskipun demikian, pemantauan terhadap kelainan ini harus tetap dilakukan terutama pada pejantan yang dijadikan sebagai sumber sperma. Hal ini dikarenakan sapi yang digunakan pada program inseminasi buatan mempunyai potensi yang besar untuk penyebaran kelainan genetik pada peternakan sapi perah rakyat. Kata kunci: DUMPS, kelainan genetik, PCR-RFLP, sapi perah FH, sitrulinemia

6 Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa ijin IPB.

7 IDENTIFIKASI MOLEKULER KELAINAN GENETIK SITRULINEMIA DAN DEFICIENCY OF URIDINE MONOPHOSPHATE SYNTHASE (DUMPS) PADA POPULASI SAPI PERAH FRIESIAN-HOLSTEIN NUR KHABIBAH Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Mayor Biosains Hewan SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

8 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Suharsono, DEA

9 Judul Tesis : Identifikasi Molekuler Kelainan Genetik Sitrulinemia dan Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMPS) pada Populasi Sapi Perah Friesian-Holstein Nama : Nur Khabibah NIM : G Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc Ketua Ir. Anneke Anggraeni, M.Si. Ph.D Anggota Diketahui Koordinator Mayor Biosains Hewan Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Bambang Suryobroto Prof. Dr. Khairil A. Notodiputro, M.S Tanggal Ujian: 20 Agustus 2009 Tanggal Lulus:..

10 Kesempurnaan adalah milik Alloh Jalla Wa Alla Segala puji bagi Alloh yang Maha Kasih dan tak pilih kasih, yang telah memberikan limpahan karunia, kekuatan, ketabahan dan kesabaran sehingga aku dapat menyelesaikan dan mempersembahkan karya ini untuk Orang-orang terkasih: Ayah (Alm) Ibu dan kakak-kakakku yang tiada henti dan tak kenal lelah dalam berdoa dan memberikan semangat serta kasih sayangnya Suami atas segala doa, ketulusan dan kesabarannya Saudaraku atas kerjasama, doa dan semangatnya

11 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan karunia-nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian yang berjudul Identifikasi Molekuler Kelainan Genetik Sitrulinemia dan Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMPS) pada Populasi Sapi Perah Friesian- Holstein ini dilaksanakan sejak bulan Februari hingga September 2008 di Laboratorium Bagian Biosistematika dan Ekologi Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari M.Sc dan Ibu Ir. Anneke Anggraeni, M.Si. Ph.D selaku pembimbing atas saran dan bimbingannya dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku dosen penguji luar komisi yang telah meluangkan waktu dan memberikan arahan dalam kelengkapan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih penulis ucapkan juga kepada Bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si dari Departemen Biologi atas saran, arahan serta bimbingan dalam pelaksanaan penelitian. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari M.Sc atas penyediaan dana penelitian dari Program Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) No. 715/LB.620/I.1/2008. Di samping itu, terima kasih penulis sampaikan pada Departemen Agama Republik Indonesia atas Program Beasiswa Untuk Daerah (BUD) pada program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Penulis sampaikan terima kasih atas ijin pengambilan sampel dan bantuan selama pengambilan sampel kepada Pimpinan dan Karyawan pada Direktorat Jendral Peternakan, Badan Penelitian Dan Pengembangan Pertanian, Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari, Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang, Balai Embrio Transfer (BET) Cipelang, Balai Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) Baturraden, Balai Pengembangan Pembibitan Ternak Sapi Perah (BBPT-SP) Cikole, serta Peternakan rakyat terkait sehingga pelaksanaan penelitian ini dapat berlangsung dengan baik. Di samping itu, terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc dari Departemen Ilmu Produksi, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor atas ijin penggunaan beberapa sampel darah untuk penelitian ini. Akhirnya ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada ibu dan seluruh keluarga atas doa dan kasih sayang yang tiada henti-hentinya. Kepada suami atas seluruh kekuatan, kesabaran, ketulusan dan doanya serta teman-teman atas perhatian dan dukungannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2009 Nur Khabibah

12 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pekalongan pada tanggal 2 Pebruari 1977 dari ayah H. Malibary Fatch (Alm) dan Ibu HJ. Siti Tis atun. Penulis merupakan putri ke empat dari empat bersaudara. Tahun 1995 penulis masuk Universitas Negeri Semarang melalui jalur Penelusuran Minat dan Kemampuan (PMDK), selanjutnya memilih program studi pendidikan biologi. Tahun 2000 penulis lulus dari Universitas Negeri Semarang. Pada tahun 2007 penulis masuk IPB melalui program Beasiswa Utusan Daerah (BUD) Departemen Agama bekerja sama dengan IPB. Penulis memilih program studi Biologi Mayor Biosains Hewan. Penulis adalah Guru Madrasah Aliyah Negeri (MAN) 3 Pekalongan, mengajar mata pelajaran Biologi mulai tahun 2005 sampai sekarang.

13 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... DAFTAR SINGKATAN... DAFTAR ISTILAH... Halaman PENDAHULUAN Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 2 Manfaat Penelitian... 2 TINJAUAN PUSTAKA Tinjauan Umum Sapi Perah FH di Indonesia... 3 Kelainan Genetik pada Sapi Perah... 4 Sitrulinemia... 5 Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase (DUMPS) 6 Metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)... 8 Sampel Pool DNA 10 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Bahan Sampel Metode Ekstraksi DNA Sampel Pool DNA Amplifikasi Gen Pemotongan Produk PCR dengan Enzim Restriksi Visualisasi Produk PCR Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Faktor yang Berpengaruh dalam Keberhasilan Amplifikasi Amplifikasi Gen ASS dan Gen UMPS Amplifikasi Gen ASS Amplifikasi Gen UMPS Identifikasi Genotipe Berdasarkan Gen ASS dan Gen UMPS Identifikasi Genotipe Gen ASS Identifikasi Genotipe Gen UMPS xii xiii xiv xv xvi

14 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 31

15 DAFTAR TABEL Halaman 1. Identifikasi kelainan DUMPS di beberapa negara Sampel darah yang digunakan dalam penelitian Hasil identifikasi genotipe; frekuensi karier serta frekuensi alel normal dan alel mutan gen ASS pada sapi perah FH Hasil identifikasi genotipe; frekuensi karier serta frekuensi alel normal dan alel mutan gen UMPS pada sapi perah FH... 23

16 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Fragmen DNA produk PCR dan hasil pemotongan enzim Ava II gen ASS ekson 5 kromosom 11 sapi perah FH pada gel poliakrilamid 6% Fragmen DNA hasil pemotongan enzim Ava II gen ASS ekson 5 kromosom 11 sapi perah FH pada gel poliakrilamid 6% Sebagian urutan basa nukleotida gen ASS Bos taurus (nomor akses GenBank BC102474) Fragmen DNA produk PCR gen UMPS ekson 5 kromosom 1 sapi perah FH pada gel poliakrilamid 6% Fragmen DNA hasil pemotongan enzim Ava I gen UMPS ekson 5 kromosom 1 sapi perah FH pada gel poliakrilamid 6% Sebagian urutan basa nukleotida gen UMPS Bos taurus (nomor akses GenBank X65125)... 20

17 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Nomor akses urutan basa nukleotida lengkap gen ASS Nomor akses urutan basa nukleotida lengkap gen UMPS... 33

18 DAFTAR SINGKATAN AMP ASS ATP BBIB BET BIB BPPT SP BPTU dntp DNA DUMPS EDTA FH KPSBU LMKK MgCl NaCl PAGE PCR Pi RFLP rpm SDS STE TBE UMP UMPS : adenosine monophosphate : arginine succinate synthase : adenosine triphosphate : Balai Besar Inseminasi Buatan : Balai Embrio Transfer : Balai Inseminasi Buatan : Balai Pengembangan dan Pembibitan Ternak Sapi perah : Balai Pembibitan Ternak Unggul : deoxyribonucleic triphosphate : deoxyribonucleic acid : deficiency of uridine monophosphate synthase : ethylene diamine tetraacetic acid : Friesian-Holstein : Koperasi Peternakan Susu Bandung Utara : Linmack Kriss King : magnecium chloride : natrium chloride : polyacrylamide gel electrophoresis : polymerase chain reaction : phyrophosphate : restriction fragmen length polymorphism : revolutions per minute : sodium dodecyl sulfate : sodium chloride-tris-edta : Tris-borat-EDTA : uridine monophosphate : uridine monophosphate synthase

19 DAFTAR ISTILAH Alel : bentuk tertentu suatu gen pada lokus Alel mutan : bentuk tertentu suatu gen pada lokus yang mengalami perubahan Alel normal : bentuk tertentu suatu gen pada lokus yang tidak mengalami perubahan Amplifikasi DNA : proses perbanyakan utas DNA Autosom : kromosom yang terletak pada sel tubuh Bibit ternak : semua hasil pemuliaan ternak yang memenuhi persyaratan tertentu untuk dikembangbiakkan Blastula : tahapan pembelahan zigot pada saat sel-sel membentuk cekungan Breeding : cara perkawinan, yaitu perkembangbiakan ternaknya dilakukan dengan jalan perkawinan antara hewanhewan dari satu spesies Denaturasi : proses membukanya rantai DNA akibat perlakuan panas Deoksiribonukleotida trifosfat : bahan pensintesis molekul nukleotida yang terdiri atas datp, dctp, dgtp dan dttp Enzim restriksi : enzim yang berfungsi untuk memotong situs restriksi pada utas DNA yang dikenalinya Fibroblast : tipe sel yang mensintesis matrik ekstraseluler dan kolagen, struktur kerangka dari jaringan hewan yang berperan dalam penyembuhan luka Gen : unit terkecil pewarisan sifat yang terdapat di dalam kromosom Genotipe : komposisi gen pada individu Heterozigot/ karier : alel-alel yang menempati lokus berbeda untuk setiap kromosom pada individu Homozigot : alel-alel yang menempati lokus sama untuk setiap kromosom pada individu

20 Implantasi : proses penempelan zigot di dalam dinding rahim Individu : satu organisme Inseminasi buatan : peletakan sperma ke dalam saluran reproduksi hewan betina dengan cara buatan tanpa kopulasi alami Kodon : tiga nukleotida dalam bentuk asam nukleat yang spesifik untuk asam amino tertentu pada sintesis protein Kromosom : struktur makromolekul besar yang memuat DNA yang membawa informasi genetik dalam sel Laktasi : periode menyusui Leukosit : sel darah putih Lokus : posisi atau lokasi gen pada kromosom Mutasi : perubahan yang terjadi pada bahan genetik (DNA maupun RNA), baik pada taraf urutan gen maupun pada taraf kromosom Nukleotida : struktur pembentuk DNA dan RNA Oligonukleotida primer : sekuen oligonukleotida pendek (15 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA Ovum : sel telur yang dihasilkan di dalam ovarium hewan betina PCR : teknik perbanyakan utas DNA Populasi : kelompok besar individu yang memiliki bangsa dan spesies tertentu Resesif : sifat suatu gen yang ekspresinya ditutupi oleh alel dominan pasangannya Sampel pool DNA : kumpulan DNA dalam satu tabung dengan konsentrasi yang terukur Semen : cairan yang mengandung sperma yang dikeluarkan dari saluran reproduksi hewan jantan Straw : tabung tipis dan panjang sebagai tempat kemas semen Vena jugularis : pembuluh darah vena yang terletak di leher

21 Zigot : sel diploid yang terbentuk dari penggabungan sel sperma dan sel telur

22 PENDAHULUAN Latar Belakang Pemerintah saat ini terus mengkampanyekan kesadaran minum susu pada masyarakat. Untuk menunjang hal tersebut, perbaikan mutu peternakan sapi perah terus ditingkatkan. Salah satu usaha perbaikan mutu ternak sapi perah yang dilakukan adalah melaksanakan program inseminasi buatan (IB). Program IB dilakukan dengan menggunakan pejantan unggul. Pejantan unggul kadangkala mewariskan kelainan atau penyakit genetik pada generasi berikutnya. Pejantan unggul yang karier terhadap kelainan genetik secara morfologis tampak normal. Pejantan tersebut tetap digunakan dalam program IB karena pejantan karier secara morfologis tidak dapat dibedakan dengan pejantan normal. Keadaan ini memungkinkan kelainan genetik dapat menyebar dengan cepat di peternakan sapi perah. Beberapa kejadian kelainan genetik akibat mutasi pada gen tertentu sapi perah Friesian-Holstein (FH) telah diketahui di beberapa negara. Dua di antaranya adalah sitrulinemia dan deficiency of uridine monophosphate synthase (DUMPS). Kelainan genetik sitrulinemia dan DUMPS muncul pada individu bergenotipe resesif. Berdasar hukum dominan-resesif Mendel, sapi bergenotipe resesif dapat muncul dari perkawinan antar sapi heterozigot. Homozigot resesif pada sitrulinemia dan DUMPS bersifat letal. Karena sifat letal itulah dua kelainan genetik tersebut dapat merugikan peternak. Indonesia sebagai salah satu negara pengimpor sapi perlu mewaspadai penyebaran kelainan genetik tersebut. Terlebih lagi, sertifikat sapi unggul sebelum tahun 2000-an belum mencantumkan bebas kelainan genetik. Dengan demikian, diperlukan pengetahuan untuk mengidentifikasi lebih dini kelainan genetik. Identifikasi ini terutama dilakukan pada pejantan yang digunakan sebagai sumber semen dalam program inseminasi buatan. Sejalan dengan perkembangan teknik analisis DNA, kejadian mutasi dapat diketahui sejak awal dengan mudah. Teknik ini dapat mengetahui mutasi sampai ke tingkat molekul DNA. Teknik analisis DNA telah berhasil dilakukan di beberapa negara untuk menguji kelainan genetik pada sapi perah FH. Dua di antara negara yang telah menyatakan bebas dari kelainan genetik DUMPS yaitu

23 Polandia (Kamiński et al. 2005) dan Rumania (Vătăşescu et al. 2006). India telah berhasil menyatakan bebas dari kelainan genetik sitrulinemia (Patel et al. 2006) pada populasi sapi perah FH. Mutasi pada gen penyebab kelainan genetik sitrulinemia dapat dianalisis salah satunya dengan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) menggunakan primer spesifik. Produk PCR selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi di antaranya adalah enzim Ava II (Patel et al. 2006). Sitrulinemia disebabkan oleh adanya mutasi CGA (kodon untuk arginin) menjadi TGA (kodon stop). Dari mutasi tersebut menyebabkan situs pada urutan nukleotida gen sitrulinemia tidak dikenali oleh Ava II. Mutasi pada gen penyebab kelainan genetik DUMPS dapat dianalisis dengan teknik yang sama seperti analisis mutasi gen penyebab sitrulinemia. Produk PCR pada gen penyebab DUMPS dipotong dengan enzim restriksi di antaranya adalah enzim Ava I (Rahimi et al. 2006). Deficiency of uridine monophosphate synthase disebabkan mutasi CGA (kodon untuk arginin) menjadi TGA (kodon stop). Mutasi tersebut menyebabkan situs pada urutan nukleotida gen DUMPS tidak dikenali oleh Ava I. Hasil yang diperoleh dari kegiatan identifikasi molekuler dapat digunakan sebagai acuan dalam program perkawinan. Individu yang teridentifikasi karier tidak boleh masuk dalam program perkawinan. Melalui tatalaksana perkawinan yang baik, kelainan genetik dapat diminimalkan keberadaannya dalam populasi untuk menjamin keberlangsungan produksi ternak. Tujuan Penelitian Memetakan komposisi genotipe gen-gen penyebab kelainan genetik sitrulinemia dan DUMPS pada populasi sapi perah FH. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat untuk mendukung manajemen perkawinan sapi perah FH dalam program inseminasi buatan. Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai pijakan dalam: 1. menentukan genotipe pejantan di Balai Inseminasi Buatan 2. menentukan genotipe induk di Balai Pembibitan ternak

24 TINJAUAN PUSTAKA Tinjauan Umum Sapi Perah FH di Indonesia Sapi perah merupakan hasil domestikasi dari Bos taurus primigenius sekitar 2000 tahun yang lalu (Anderson & Kiser 1966; Mason 1984; Gillespie 1992). Sapi perah FH berkembang dari sapi perah di Eropa. Sapi perah termasuk dalam famili Bovidae. Salah satu ciri dari famili ini mempunyai sepasang tanduk yang tidak bercabang (Mason 1984). Sapi perah yang berkembang di Eropa adalah jenis Bos taurus (Gillespie 1992). Ciri khas dari Bos taurus yaitu tidak mempunyai punuk. Sapi perah masuk ke Indonesia sejak jaman penjajahan Belanda (Sudono 1999). Pemerintah Belanda mendatangkan sapi perah FH untuk memenuhi kebutuhan susu bagi karyawan Belanda (Ibrahim et al. 1992). Pada tahun telah dilakukan pemuliaan bibit sapi perah di Indonesia dengan mengimpor pejantan FH dari Belanda (Sudono 1999). Setelah Indonesia merdeka, pertumbuhan populasi sapi perah terus meningkat. Hal ini ditandai dengan adanya pembangunan usaha-usaha sapi perah oleh swasta (Yusdja 2005). Kebijakan importasi sapi perah dalam jumlah besar dan teratur, cukup memberikan kontribusi dalam perkembangan sapi perah (Anggraeni & Iskandar 2008). Menurut Ibrahim et al. (1992), selama tahun pemerintah Indonesia mengimpor sapi perah FH dara sekitar ekor. Sapi-sapi tersebut terutama diimpor dari Australia dan Selandia Baru serta dalam jumlah kecil dari Amerika Serikat (Diwyanto et al. 2006). Jumlah populasi sapi perah di Indonesia sampai dengan tahun 2007 mencapai ekor. Penyebaran sapi perah FH tersebut paling banyak di pulau Jawa. Populasi sapi perah FH di Jawa Timur diperkirakan sebanyak ekor (36.79%), Jawa Tengah ekor (30.54%) dan Jawa Barat ekor (27.19%) (Ditjen Peternakan 2007). Sapi perah FH mempunyai sifat jinak dan lebih mudah menyesuaikan diri dengan lingkungan (Gillespie 1992). Menurut Damron (2006) sapi perah FH betina menghasilkan susu dengan jumlah paling tinggi dibanding dengan bangsa sapi perah lainnya. Rata-rata produksi susu sapi perah FH di Amerika Serikat mencapai pound ( kg) dalam satu masa laktasi. Susu sapi perah

25 FH di Amerika Serikat mengandung kadar lemak relatif rendah yaitu 3.6%. Menurut Diwyanto et al. (2006), produksi susu sapi perah FH di Indonesia khususnya di Jawa Tengah dan Jawa Barat mencapai kg dalam satu masa laktasi. Perkawinan sapi perah FH di Indonesia, sebagian besar menggunakan sistem IB (Diwyanto et al. 2006). Semen beku yang digunakan dalam IB sebagian besar diproduksi oleh sapi perah FH pada Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) dan Balai Inseminasi Buatan (BIB). Sebagian semen beku yang lain diimpor dari Amerika, Kanada, Perancis, Australia, Selandia Baru dan Jepang (Diwyanto et al. 2006). Penyebaran semen beku di wilayah sentra sapi perah sebagian besar dilakukan oleh BBIB Singosari dan BIB Lembang (Diwyanto et al. 2006). Diwyanto dan Herliantien (2006) melaporkan bahwa penggunaan IB telah mencapai lebih dari 90% populasi sapi perah betina. Keunggulan penggunaan perkawinan IB diantaranya dapat mempercepat penyebaran sifat-sifat unggul dalam populasi (Foote 2002). Perkawinan IB lebih efektif dan efisien dibanding dengan perkawinan alami pada sapi perah (Diwyanto & Herliantien 2006). Sebagai ilustrasi, perkawinan alami satu jantan hanya mampu melayani betina pertahun. Pada inseminasi buatan satu jantan dalam sekali ejakulasi dapat diproduksi sekitar 200 straw atau lebih. Dengan demikian jika sperma satu pejantan ditampung dua kali dalam satu minggu, maka dalam satu tahun dapat diambil straw. Jumlah tersebut dapat dipakai untuk membuahi sapi betina (Diwyanto & Herliantien 2006). Kelainan Genetik pada Sapi Perah Kelainan genetik adalah kelainan bersifat menurun yang menyebabkan kelainan fisik atau fungsi tubuh (Čitek et al. 2006). Salah satu dampak yang ditimbulkan oleh kelainan genetik yaitu kematian pada sapi dengan kelainan genetik (letal) (Maciejowski & Zieba 1982). Penyebaran kelainan genetik dapat terjadi melalui proses perkawinan (Basrur & King 2005). Kelainan ini sebagian besar disebabkan oleh peristiwa mutasi pada tingkat gen maupun kromosom (Maciejowski & Zieba 1982).

26 Kelainan genetik pada sapi sebagian besar terjadi pada individu bergenotipe resesif homozigot. Resesif homozigot dapat muncul dari perkawinan antar individu karier atau heterozigot (Healy 1996). Individu dengan genotipe heterozigot tampak seperti individu normal (Basrur & King 2005). Hal ini terjadi karena sifat resesif tertutupi oleh sifat dominan pasangannya (Maciejowski & Zieba 1982). Keadaan ini memberi peluang sifat resesif tetap berada dalam populasi (Čitek & Bláhová 2004). Dua di antara beberapa kelainan genetik pada sapi perah yang telah diidentifikasi adalah: sitrulinemia (Robinson et al. 1993; Padeeri et al. 1999; Nassiry et al. 2005; Patel et al. 2006; Čitek et al ) dan DUMPS (Shanks et al. 1987; Čitek et al. 2006; Patel et al. 2006; Rahimi et al. 2006; Vătăşescu et al. 2006). Kelainan genetik tersebut menyebabkan kelainan pada metabolisme tubuh. Kelainan metabolisme tubuh kadangkala mengakibatkan kematian pada sapi dengan kelainan genetik (Dennis et al. 1989). Sitrulinemia Sitrulinemia pertama kali ditemukan pada manusia tahun 1962 (Healy et al. 1996). Sekitar tahun 1989 kelainan ini ditemukan juga pada sapi perah FH (Harper et al. 1989). Menurut Dennis et al. (1989) sitrulinemia merupakan defisiensi enzim argininosuccinate synthase (ASS) yang bersifat menurun. Enzim ASS merupakan salah satu enzim yang berperan penting dalam siklus urea terutama dalam pembentukan urea. ASS berperan dalam mengubah sitrulin dan aspartat menjadi arginin suksinat. Perubahan tersebut dilakukan dengan cara menghidrolisis adenosine triphosphate (ATP) menjadi adenosine monophosphate (AMP) dan pyrophosphate (P i ) pada siklus urea yang terjadi di dalam hati (Jenkinson et al. 1996). Jika terjadi defisiensi ASS maka akan terjadi penumpukan sitrulin yang menyebabkan pembentukan urea di dalam hati terhenti. Sitrulinemia pada sapi perah FH disebabkan perubahan basa pada kodon 86 berupa transisi sitosin (CGA/arginin) menjadi timin (TGA/stop kodon). Mutasi tersebut terjadi pada ekson 5 gen penyandi enzim arginin suksinat sintase kromosom 11 (Padeeri et al. 1999). Sapi dengan defisiensi ASS mempunyai jumlah asam amino lebih sedikit dibanding sapi normal. Jumlah asam amino sapi

27 defisiensi ASS sebanyak 85 sedangkan sapi normal sebanyak 412 (Dennis.et.al..1989). Konsentrasi enzim ASS dalam leukosit pada sapi heterozigot sebesar 0.28 ± 0.10 miliunit/mg protein. Konsentrasi enzim ASS dalam leukosit pada sapi normal homozigot sebesar 0.40 ± 0.25 miliunit/mg protein. Konsentrasi enzim ASS pada sapi heterozigot lebih kecil dibanding pada sapi normal homozigot. Meskipun begitu, konsentrasi enzim ASS pada sapi heterozigot masih dalam batas normal. Tanda-tanda klinis sapi resesif homozigot (penderita sitrulinemia) yaitu: mengalami ataxia (lemah otot), kebutaan, sitrulin dalam darah meningkat hingga mencapai 200 kali dibanding normal. Konsentrasi enzim arginin suksinat sintase menurun secara ekstrim di hati, dan biasanya mengakibatkan kematian setelah kelahiran (Dennis et al. 1989). Healy (1996) melaporkan kejadian sitrulinemia di Australia dengan frekuensi karier sebesar 13% dari 98 sapi FH yang diuji. Robinson et al. (1993) melaporkan kejadian sitrulinemia di Amerika sebesar 0.27% dengan jumlah sapi yang diuji sebanyak 367 ekor. Kejadian sitrulinemia di Australia diketahui berasal dari salah satu pejantan yang diimpor dari Amerika. Pembawa kelainan sitrulinemia di Australia diperkirakan berasal dari keturunan sapi Holstein Amerika yaitu Linmack Kriss King (LMKK) (Healy 1996). Berdasarkan kejadian tersebut, beberapa negara pengimpor sapi perah FH melakukan deteksi kelainan sitrulinemia. Beberapa negara pengimpor sapi perah FH di antaranya adalah India (Patel et al. 2006); Iran (Nassiry et al. 2005) dan Chekoslovakia (Čitek et al. 2006). Hasil identifikasi dari India, Iran dan Chekoslovakia menyatakan tidak ada kejadian sitrulinemia pada sapi perah FH mereka. Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase Deficiency of uridine monophosphate synthase pertama kali ditemukan pada sapi perah tahun 1985 (Smith et al. 1985). Pada tahun 1987 sapi perah FH di Amerika terdeteksi mengalami kelainan tersebut (Shanks et al. 1987). Deficiency of uridine monophosphate synthase merupakan kelainan genetik yang disebabkan oleh defisiensi enzim uridin 5-monophosphate synthase (UMPS). Enzim UMPS

28 adalah salah satu enzim yang berperan dalam biosintesis pirimidin (Robinson et al. 1983). Akibat dari kelainan ini dapat terjadi gangguan pada biosintesis pirimidin, yaitu ketidakmampuan uridin 5-monophosphate synthase (UMPS) untuk mengkatalisis asam urotik menjadi UMP (Shanks & Robinson 1989). Kelainan genetik DUMPS pada sapi perah FH disebabkan perubahan basa pada kodon 405. Perubahan basa itu berupa transisi sitosin (CGA/arginin) menjadi timin (TGA/stop kodon). Mutasi tersebut terjadi pada ekson 5 gen penyandi enzim UMPS kromosom nomor 1 (Schwenger et al. 1994). Menurut Robinson et al. (1983) UMPS pada sapi dalam keadaan resesif homozigot mengandung asam amino yang lebih sedikit daripada UMPS sapi normal. Ciri-ciri sapi heterozigot atau karier DUMPS, selama laktasi mengalami penumpukan asam orotat pada susu, urin dan darah (Shanks & Robinson 1990). Menurut Robinson et al. (1983) konsentrasi orotat di dalam susu bervariasi tergantung kondisi ternak seperti pada saat melahirkan, masa laktasi, dan jumlah laktasi. Rata-rata hewan ternak mempunyai orotat ± μg/ml. Sapi karier mempunyai orotat lebih dari 300 μg/ml bahkan ada yang mencapai μg/ml. Dampak kandungan orotat yang tinggi pada sapi karier belum diketahui. Ciri lain dari sapi heterozigot yaitu interval melahirkan lebih lama dari sapi normal setelah kelahiran anak pertama (Shank et al. 1987). Defisiensi UMPS pada sapi Friesian-Holstein dalam keadaan resesif homozigot menyebabkan embrio mati pada saat implantasi di dalam uterus (Rahimi et al. 2006). Perkembangan zigot hanya sampai pembelahan blastula saja dan biasanya gugur tidak lama setelah implantasi (Schwenger et al. 1994). Sapi resesif homozigot tidak pernah dijumpai dalam keadaan dewasa. Kasus penyebaran DUMPS telah diidentifikasi di beberapa negara. Salah satu di antaranya di pusat inseminasi buatan sapi perah FH Amerika Serikat dengan frekuensi kejadian sebesar 29.33%, sedangkan pada peternakan rakyat sebesar 1.39% (Shanks et al.1989). Kelainan ini juga ditemukan di Taiwan dengan frekuensi kejadian sebesar 0.14% (Lin et al. 2001) (Tabel 1). Penyebaran kelainan genetik DUMPS terjadi karena pemakaian pejantan pembawa kelainan genetik dalam IB (Robinson et al. 1983). Beberapa negara seperti India (Patel et al. 2006), Chekoslovakia (Čitek et al. 2006), Rumania (Vătăşescu et al. 2006), Iran (Rahimi et al. 2006) dan Turki (Akyuz & Ertugrul 2008) melakukan identifikasi terhadap kelainan genetik DUMPS. Hasil identifikasi tersebut ternyata tidak ditemukan karier DUMPS. Menurut Čitek dan Bláhová (2004), penyebaran kelainan genetik dapat dipercepat melalui

29 penggunaan inseminasi buatan. Dengan demikian, identifikasi kelainan genetik DUMPS diperlukan untuk mengantisipasi kerugian yang ditimbulkan pada sapi perah (Kamiński et al. 2005). Tabel 1 Identifikasi kelainan DUMPS di beberapa negara Negara Jml Jml Frekuensi Pustaka Total Karier karier Amerika Utara % Shanks et al Illionis % Shanks et al Taiwan % Lin et al India % Patel et al Chekoslovakia % Čitek et al Rumania % Vătăşescu et al Iran % Rahimi et al Turki % Akyuz & Ertugrul 2008 Metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) Polymerase chain reaction (PCR) merupakan metode enzimatis untuk memperbanyak fragmen DNA secara eksponensial dengan cara in vitro (Mullis & Faloona 1989). Dengan menggunakan metode PCR, dapat diperoleh fragmen DNA (110 bp, 5 X mol) sebesar kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit (Mullis & Faloona 1989). Teknik PCR dipengaruhi oleh empat komponen utama yaitu: DNA cetakan, oligonukleotida primer, deoksiribonukleotida trifosfat (dntp) dan enzim DNA polymerase (Sambrook & Russell 2001). Lebih lanjut Sambrook dan Russell (2001) serta Naqvi (2007) secara garis besar memaparkan prinsip kerja PCR yaitu denaturasi, penempelan primer (annealing) dan pemanjangan (elongasi). Proses dari denaturasi, penempelan dan pemanjangan disebut sebagai satu siklus. Proses ini biasanya berlangsung siklus. Suhu denaturasi dan ekstensi bersifat permanen, masing-masing pada 95 C dan 72 C, sedangkan suhu penempelan bergantung pada panjang pendeknya primer.

30 Metode PCR-RFLP merupakan teknik PCR yang menggunakan enzim restriksi (Viljoen et al. 2005). Enzim restriksi ini bersifat sangat spesifik dalam memotong urutan nukleotida yang dikenalinya (Naqvi 2007). Enzim tersebut mengenali urutan nukleotida tertentu dalam urutan nukleotida suatu gen. Urutan nukleotida yang mampu dikenali oleh enzim restriksi disebut situs restriksi (Naqvi 2007). Panjang situs restriksi ini terdiri dari empat sampai enam nukleotida (Dowling et al. 1996). Jika situs restriksi mengalami mutasi (meskipun pada satu basa) maka enzim restriksi tidak mampu mengenalinya. Menurut Vătăşescu et al. (2006) metode PCR-RFLP mampu mendeteksi individu karier sitrulinemia dan DUMPS dengan baik. Metode tersebut mempunyai keuntungan yaitu dapat dilakukan dengan mudah dan cepat. Enzim restriksi yang digunakan untuk deteksi kelainan sitrulinemia (enzim Ava II) (Patel et al. 2006) dan DUMPS (enzim Ava I) (Rahimi et al. 2006) tidak dapat mengenali alel mutan. Situs restriksi pada alel mutan kedua kelainan genetik tersebut tidak dikenali oleh enzim restriksi. Hasil kerja enzim restriksi dapat dilihat pada perbedaan jumlah potongan pita DNA yang diperoleh setelah proses visualisasi pada gel poliakrilamid (Palumbi 1996). Selain gel poliakrilamid, proses visualisasi dapat pula menggunakan gel agarosa. Pita DNA yang diperoleh dari teknik tersebut selanjutnya dianalisis untuk mengetahui frekuensi alel normal dan alel mutan. Panjang fragmen DNA produk PCR gen ASS adalah 176 pb. Produk PCR gen ASS setelah dipotong dengan Ava II pada individu normal akan dihasilkan dua pita DNA yang berukuran 98 pb dan 78 pb. Pada individu karier akan dihasilkan tiga pita DNA masing-masing berukuran 176 pb, 98 pb, dan 78 pb. Secara teori individu resesif homozigot akan menghasilkan satu pita berukuran 176 pb (Robinson et al. 1993). Ava II mengenali situs ggacc pada alel normal dan memotong antara g dengan g. Pada alel mutan tidak ada situs ggacc sehingga Ava II tidak mengenali situs tersebut. Panjang fragmen DNA produk PCR gen UMPS adalah 108 pb. Produk PCR gen UMPS setelah dipotong dengan Ava I pada individu normal akan dihasilkan tiga pita DNA yang berukuran 53 pb, 36 pb, dan 19 pb. Pada individu karier akan dihasilkan empat pita DNA masing-masing berukuran 89 pb, 53 pb, 36 pb, dan 19 pb. Secara teori individu resesif homozigot akan menghasilkan dua pita berukuran

31 89 pb dan 19.pb (Schwenger et al. 1993). Ava I mengenali situs c(c/t)cg(a/g)g pada alel normal dan memotong antara c dengan c/t. Pada alel mutan tidak ada situs c(c/t)cg(a/g)g sehingga Ava I tidak mengenali situs tersebut dan tidak terjadi pemotongan. Sampel Pool DNA Sampel Pool DNA adalah metode pengelompokan DNA hasil ekstraksi dari sampel yang digunakan dalam kegiatan riset ke dalam satu tempat (pool) (Sham et al. 2002). Analisis sampel pool DNA dilakukan untuk mengetahui keberadaan alel normal maupun alel mutan. Jika dalam sampel pool DNA ditemui alel mutan, maka semua anggota pool tersebut diperiksa satu persatu. Metode pool DNA merupakan cara yang praktis dalam proses deteksi terhadap alel penyebab berbagai kelainan genetik. Metode ini secara efisien dapat mengurangi pembiayaan untuk keperluan pereaksi PCR. Dengan demikian proses penentuan genotipe dapat dilakukan dengan murah dalam skala besar, dibanding bila tiap sampel diuji satu persatu (Sham et al. 2002). Selain itu, metode sampel pool DNA dapat mengefisiensikan peralatan (Yang et al. 2003) dan waktu (Churchill et al. 1993) yang dibutuhkan dalam proses deteksi. Berbagai uji terhadap metode sampel pool DNA yang telah dilakukan (Churchill et al. 1993; Zhou et al. 2001; Sham et al. 2002; Yang et al. 2003; Meaburn et al. 2006; Szyda et al. 2008) menunjukkan bahwa metode ini dapat menjadi metode penentuan genotipe alternatif yang cukup akurat, efisien dan praktis. Menurut Szyda et al. (2008) satu sampel pool DNA dapat digunakan antara sampel DNA. Yang et al. (2003) merekomendasikan isi satu sampel pool DNA sampai 30 sampel. Dengan demikian, waktu deteksi lebih singkat, hasil deteksi lebih cepat diketahui dan akurat.

32 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan September 2008 di Bagian Biosistematika dan Ekologi Hewan Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Bahan Sampel Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berupa darah sapi perah FH. Jumlah keseluruhan sampel yang digunakan sebanyak 676 berasal dari 12 lokasi terdiri dari tujuh lokasi dari pusat pembibitan sapi perah pemerintah dan lima lokasi dari peternakan sapi perah rakyat (Tabel 2). Sampel dari pusat pembibitan sapi perah pemerintah meliputi: Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari di Jawa Timur, Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang di Jawa Barat, Balai Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) Baturraden di Jawa Tengah, Balai Embrio Transfer (BET) Cipelang di Jawa Barat, dan Balai Pengembangan dan Pembibitan Ternak Sapi Perah (BPPT-SP) Cikole di Jawa Barat. Sampel dari peternakan sapi perah FH rakyat meliputi: peternakan Fakultas Peternakan (FAPET) IPB, Koperasi Peternakan Susu Bandung Utara (KPSBU) Cilumber, KPSBU Pasar Kemis di Jawa Barat, Ngantang di Jawa Timur, Boyolali di Jawa Tengah, Lembang di Jawa Barat, dan Pondok Rangon di Jakarta. Sampel-sampel tersebut diambil pada tahun 2008 kecuali sampel dari BPTU Baturraden, Peternakan Rakyat Pondok Rangon, BIB Lembang dan Peternakan Rakyat Lembang, dikoleksi berturut-turut pada tahun 2002, 2004, 2006 dan Cara pengambilan sampel. Darah diambil dari vena jugularis dan sebagian dari vena koksigalis. Sebanyak 1 sampai 2 ml darah diambil menggunakan siring 10 ml berukuran 21 G X 1 ½ dan vaccutainer yang berheparin dan tidak berheparin. Sampel darah yang diambil berupa darah total (sel darah dan plasma darah) dan koagulan (sel darah) (Tabel 2).

33 Tabel 2 Sampel darah yang digunakan dalam penelitian No. Lokasi Tahun Koleksi Jenis kelamin Jumlah sampel Tipe sampel Pusat Pembibitan: 1 BBIB Singosari darah total 2 BIB Lembang darah total 3 BPTU Baturraden sel darah putih 4 BET Cipelang Koagulan 5 BPPT-SP Cikole darah total Peternakan Rakyat: 6 FAPET IPB darah total 7 KPSBU Cilumber darah total 8 KPSBU Pasar Kemis darah total 9 Boyolali darah total 10 Ngantang darah total 11 Lembang darah total 12 Pondok Rangon koleksi sampel dalam bentuk DNA Jumlah Total 676 Perlakuan awal sampel darah sebelum ekstraksi. Seluruh sampel koleksi tahun 2008 ditambah etanol absolut sebanyak dua kali volume darah kecuali sampel dari BET Cipelang dan FAPET IPB. Etanol absolut ditambahkan dengan cara berangsur-angsur sambil dikocok, sehingga sel-sel darah terselubungi oleh alkohol dengan tujuan agar darah tidak membusuk. Darah yang diambil dari Peternakan FAPET IPB langsung ditambah Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) dan dimasukkan dalam tabung tanpa heparin. Hal ini dilakukan karena lokasi pengambilan dekat dengan laboratorium, sehingga dapat segera dilakukan isolasi DNA. Sebelum ditambah etanol absolut, sampel ditambah NaCl 0.2% kemudian disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 10 menit. Setelah supernatan dibuang, dilakukan penambahan etanol absolut sebanyak dua kali volume darah (konsentrasi etanol tidak kurang dari 50%) kemudian disimpan pada suhu ruang (Farajallah et al. 1998). Sampel darah dari BET berupa gumpalan darah yang telah diambil serumnya. Serum digunakan untuk analisis penyakit oleh pihak BET. Sampel

34 berupa gumpalan darah tersebut disimpan dalam kotak es untuk penyimpanan sementara. Sampel ditambah etanol absolut sebanyak dua kali volume darah. Penambahan etanol dilakukan agar total konsentrasi etanol tidak kurang dari 50% untuk penyimpanan sampel dalam waktu yang lama. Penyimpanan sampel permanen. Volume seluruh sampel darah diseragamkan kemudian ditambah etanol absolut sebanyak dua kali volume darah, sehingga total konsentrasi etanol tidak kurang dari 50% (Smith et al. 1987) kemudian ditambah 1 mm EDTA. Sampel selanjutnya dikocok agar alkohol tersebar merata di dalam tabung. Sampel kemudian disimpan pada suhu ruang (25. C). Penyimpanan darah semacam ini dapat bertahan dalam jangka waktu yang lama. Metode Ekstraksi DNA Isolasi molekul DNA total menggunakan DNA isolation Mini Kit for fresh blood (Geneaid). Ada empat tahapan sebagaimana tertera pada manual kit, yaitu: lisis, pengikatan, pencucian dan pengendapan DNA. Modifikasi dilakukan pada tahapan lisis DNA. Sampel yang disimpan dalam etanol dicuci sebanyak dua kali menggunakan air suling untuk membuang etanol sebelum menggunakan kit. Sebanyak 200 μl sampel darah diambil dan dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml, kemudian ditambahkan air suling sebanyak 800 μl, selanjutnya disentrifugasi rpm selama 10 menit. Endapan sel yang diperoleh dilarutkan dalam bufer 1x sodium chloride-tris- EDTA (STE) (0.5 M sodium; 0.2 μm Tris-HCl; 0.02 M EDTA; ph 8.0), kemudian dilisis dengan proteinase-k dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 56 C (Farajallah et al. 1998). Selain menggunakan proteinase-k, digunakan juga Sodium Dodecyl Sulfate 1% (SDS), kemudian diinkubasi suhu 70 C selama 10 menit. Tahapan selanjutnya mulai dari tahapan kedua sampai akhir mengikuti petunjuk di manual kit.

35 Sampel Pool DNA Metode untuk menentukan genotipe gen ASS dan gen UMPS adalah PCR-RFLP. Sebanyak 676 sampel dipakai untuk mengidentifikasi genotipe gen ASS dan 483 sampel untuk gen UMPS. Setiap 6 sampai 10 sampel DNA hasil ekstraksi dengan konsentrasi terukur dimasukkan ke dalam satu tabung 1.5 ml. Masing-masing sampel diambil 10 μl kemudian disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 1 menit, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 C selama satu jam. Kumpulan DNA dalam tabung 1.5 ml ini disebut dengan sampel pool DNA (Sham et al. 2002). Jika dalam 1 sampel pool DNA diketahui ada alel mutan maka anggota sampel pool DNA diperiksa satu persatu. Amplifikasi Gen Amplifikasi gen ASS dan gen UMPS menggunakan mesin PCR Thermal Cycler MP4 (TaKaRa). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen ASS adalah F:GTG TTC ATT GAG GAC ATC, dan R:CCG TGA GAC ACA TAC TTG (Dennis et al. 1989) dengan suhu penempelan 61 C. Amplifikasi gen UMPS menggunakan primer F: GCA AAT GGC TGA AGA ACA TTC TG, dan R: GCT TCT AAC TGA ACT CCT CGA GT (Schwenger et al. 2006) dengan suhu penempelan C. Campuran untuk mengamplifikasi gen ASS dan UMPS terdiri dari ng DNA sapi FH, masing-masing primer sebanyak 1 μm, dntp mix 120 μm, MgCl μm dan Taq polymerase RBC 1 unit beserta bufernya. Kondisi PCR untuk amplifikasi gen ASS dalam mesin TaKaRa yaitu pradenaturasi pada suhu 94 C selama 5 menit yang dilanjutkan dengan 30 siklus (denaturasi 94 C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 61 C selama 1 menit, ekstensi DNA pada suhu 68 C selama 5 detik) dan diakhiri dengan pemanjangan akhir DNA pada suhu 72 C selama 7 menit. Kondisi PCR untuk amplifikasi gen UMPS dengan kondisi PCR untuk amplifikasi gen ASS secara keseluruhan hampir sama hanya berbeda pada suhu penempelan. Suhu penempelan yang digunakan untuk amplifikasi gen UMPS dapat berkisar dari suhu 60 C sampai dengan 61 C.

36 Pemotongan Produk PCR dengan Enzim Restriksi Pemotongan gen ASS. Produk PCR dipotong dengan enzim Ava II (Fermentas) yang mampu mengenali alel normal gen ASS (Patel et al. 2006). Campuran untuk memotong 2 μl produk PCR yaitu: 3 unit enzim Ava II; 0.4 μl bufer; 0.3 μl air suling steril. Enzim memotong produk pada suhu 37 C selama satu malam (± 18 jam) dalam inkubator. Pemotongan gen UMPS. Produk PCR tunggal dipotong dengan enzim Ava I (Fermentas) yang mampu mengenali alel normal gen UMPS (Rahimi et al. 2006). Campuran untuk memotong produk PCR gen UMPS mempunyai volume yang sama dengan campuran yang digunakan untuk memotong produk gen ASS. Enzim Ava I memotong produk pada suhu 37 C selama 3 jam hingga satu malam dalam inkubator. Visualisasi produk PCR Visualisasi produk PCR dan hasil restriksi dilakukan menggunakan metode Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Tegelström 1986) yang dimodifikasi oleh Farajallah et al. (1998). Elektroforesis dijalankan pada tegangan 180 mv selama 30 menit dalam bufer 1x TBE (0.5 M Tris; 0.65 M asam borat; 0.02 M EDTA). Analisis Data Frekuensi alel dihitung dengan menggunakan rumus Nei (1987), yaitu: x i = (2n ii + n ij ) 2n x i = frekuensi alel A i n ii = jumlah individu bergenotipe A i A i n ij = jumlah individu bergenotipe A i A j n = jumlah total individu

37 HASIL DAN PEMBAHASAN Faktor yang Berpengaruh dalam Keberhasilan Amplifikasi Jumlah sampel darah sapi perah FH yang digunakan untuk identifikasi gen ASS sebanyak 676. Keberhasilan amplifikasi gen ASS sebesar 97.63% (660 sampel). Jumlah sampel yang tidak teramplifikasi pada gen ASS sebanyak 16 (2.37%). Sampel tersebut berasal dari BPTU Baturraden sebanyak sepuluh (1.48%) koleksi tahun Enam sampel (0.89%) lainnya berasal dari peternakan rakyat Pondok Rangon koleksi tahun Jumlah sampel yang digunakan untuk identifikasi gen UMPS sebanyak 483. Sampel yang digunakan untuk identifikasi gen UMPS telah teramplifikasi seluruhnya (100%). Isolasi DNA merupakan salah satu langkah awal yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi DNA. Keberhasilan amplifikasi DNA juga ditentukan oleh konsentrasi DNA sampel, taq polimerase, deoksiribonukleotida trifosfat (dntp), ion Mg, dan primer (Sambrook & Russell 2001). Pada penelitian ini, kemungkinan ada dua faktor yang menyebabkan 16 sampel DNA tidak teramplifikasi. Kemungkinan yang pertama adalah sampel DNA sering keluarmasuk dari ruang penyimpanan. Sampel yang sering keluar-masuk dari ruang penyimpanan dapat menyebabkan kerusakan DNA (Dessauer et al. 1996). Perubahan suhu yang cukup ekstrim dapat menyebabkan fragmen DNA putus. Perubahan suhu tersebut ditunjukkan oleh perbedaan suhu ruang penyimpanan (- 20 C) dengan suhu di luar ruang penyimpanan (± 25 C). Menurut Viljoen et al. (2005) salah satu faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi adalah kualitas dan keutuhan DNA. Kemungkinan yang kedua adalah kontaminasi sampel oleh NaCl. Konsentrasi NaCl lebih dari 50 mm dalam sampel dapat menghambat aktivitas taq polimerase dalam proses pengikatan nukleotida baru (Innis et al. 1988). Taq polimerase mempunyai kemampuan polimerisasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease dari arah 3 ke arah 5. Taq polimerase mempunyai ph paling aktif yaitu 9 dan suhu sekitar 75 C-80 C. Jika aktivitas taq polimerase terhambat, maka tidak ada proses pengikatan nukleotida baru pada utas yang sedang disintesis.

38 Amplifikasi gen ASS dan gen UMPS Amplifikasi gen ASS Berdasarkan penanda 100 pb, ukuran produk PCR hasil amplifikasi gen ASS dengan menggunakan metode PCR-RFLP adalah sepanjang 176 pb (Gambar 1). Panjang produk PCR gen ASS yang diperoleh mengacu pada Dennis et al. (1989). Produk PCR tersebut dipotong dengan enzim Ava II menghasilkan dua fragmen DNA untuk individu normal (CC) dan tiga fragmen DNA untuk individu karier. Panjang masing-masing fragmen DNA individu normal tersebut yaitu 98 pb dan 78 pb (Gambar 2). Pada individu karier sitrulinemia atau heterozigot (Cc) panjang masing-masing fragmen DNA tersebut sebesar 176 pb, 98 pb dan 78 pb (Gambar.1). Panjang fragmen DNA hasil pemotongan enzim Ava II berdasarkan Patel et al. (2006). Gambar 1 Fragmen DNA produk PCR dan hasil pemotongan enzim Ava II gen ASS ekson 5 kromosom 11 sapi perah FH pada gel poliakrilamid 6%. M: penanda 100 pb, Pr: produk PCR (176.pb), Cc: individu karier sitrulinemia (176 pb, 98 pb dan 78.pb).

39 CC CC CC M 200 pb 98 pb 78 pb 100 pb Gambar 2 Fragmen DNA hasil pemotongan enzim Ava II gen ASS ekson 5 kromosom 11 sapi perah FH pada gel poliakrilamid 6%. M: penanda 100 pb, CC: individu normal homozigot (98 pb dan 78 pb). Gambar 3 Sebagian urutan basa nukleotida gen ASS Bos taurus (nomor akses GenBank BC102474). Deret nukleotida yang bergaris bawah adalah situs penempelan primer dengan ukuran produk PCR sepanjang 176.pb (Dennis et al. 1989). Anak panah merupakan titik pemotongan enzim Ava II (g gacc). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen ASS terdiri atas primer forward dan primer reverse mengacu pada Dennis et al. (1989). Primer tersebut mengapit basa nukleotida gen ASS. Secara teori panjang pasang basa nukleotida mulai dari forward sampai reverse dapat diukur berdasarkan urutan basa nukleotida gen ASS pada GenBank nomor akses BC (Gambar 3). Panjang pasang basa nukleotida yang diapit oleh primer forward dan reverse disebut dengan produk PCR gen ASS. Produk PCR gen ASS selanjutnya dipotong dengan enzim Ava II (Patel et al. 2006). Enzim Ava II mengenali situs ggacc dan memotong antara g dengan g. Enzim Ava II memotong produk PCR diantara nukleotida ke 78 dan 79 dari primer forward pada alel normal gen ASS. Alel normal (C) gen ASS memiliki satu situs pemotongan, sehingga menghasilkan dua

40 fragmen DNA. Alel mutan (c) tidak memiliki situs pemotongan sehingga fragmen DNA tidak terpotong. Pada individu sapi perah FH bergenotipe normal homozigot terdapat dua fragmen DNA. Pada individu sapi perah FH bergenotipe heterozigot atau karier terbentuk tiga fragmen DNA. Amplifikasi gen UMPS Berdasarkan penanda 100 pb, ukuran produk PCR hasil amplifikasi gen UMPS dengan menggunakan metode PCR-RFLP adalah sepanjang 108 pb (Gambar 4). Panjang produk PCR gen ASS yang diperoleh mengacu pada Schwenger et al. (2006). Produk PCR dipotong dengan enzim Ava I menghasilkan tiga fragmen DNA pada individu normal. Tiga fragmen DNA pada individu normal (DD) tersebut masing-masing berukuran 53 pb, 36 pb dan 19 pb. (Gambar 5). Panjang fragmen DNA hasil pemotongan enzim Ava II berdasarkan Rahimi et al. (2006). Pr Pr M 200 pb 108 pb 100 pb Gambar 4. Fragmen DNA produk PCR gen UMPS ekson 5 kromosom 1 sapi perah FH pada gel poliakrilamid 6%. M: penanda 100 pb; Pr: produk PCR sebesar 108 pb. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen UMPS terdiri atas primer forward dan primer reverse mengacu pada Schwenger et al. (2006). Primer tersebut mengapit basa nukleotida gen UMPS. Secara teori panjang pasang basa nukleotida mulai dari forward sampai reverse dapat diukur berdasarkan urutan basa nukleotida gen UMPS pada GenBank nomor akses X65125 (Gambar 6). Panjang pasang basa nukleotida yang diapit oleh primer forward dan reverse disebut dengan produk PCR gen UMPS. Produk PCR gen UMPS selanjutnya dipotong dengan enzim Ava I (Rahimi et al. 2006). Enzim Ava I digunakan untuk

41 memotong produk PCR karena dapat mengenali situs pemotongan pada alel normal. Alel normal (D) memiliki dua situs pemotongan sehingga menghasilkan tiga fragmen DNA. Pada alel mutan terjadi mutasi sitosin (c) menjadi timin (t) di runutan basa nukleotida ke 1283 (Gambar 6). Tempat mutasi tersebut tidak dikenali oleh enzim Ava I. Adanya mutasi tersebut mengakibatkan alel mutan hanya mempunyai satu situs pemotongan enzim Ava I. Fragmen DNA yang terbentuk pada alel mutan sebanyak dua fragmen setelah dipotong dengan Ava I. Gambar 5. Fragmen DNA hasil pemotongan enzim Ava I gen UMPS ekson 5 kromosom 1 sapi perah FH pada gel poliakrilamid 6 %. M: penanda 100 pb; DD: individu normal homozigot (53 pb, 36 pb dan 19 pb). Gambar 6. Sebagian urutan basa nukleotida gen UMPS Bos taurus (nomor akses GenBank X65125). Deret nukleotida yang bergaris bawah adalah situs penempelan primer dengan ukuran produk PCR sepanjang 108 pb (Schwenger et al. 2006). Anak panah merupakan titik pemotongan enzim Ava I (c ycgrg; y = c/t; r = a/g).