ANALISIS PHYLOGENIC TREE DAN CONSENSUS SEQUENCE VIRUS NEWCASTLE DISEASE ISOLAT ASAL WILAYAH KERJA BALAI VETERINER LAMPUNG TAHUN

Transkripsi

1 ANALISIS PHYLOGENIC TREE DAN CONSENSUS SEQUENCE VIRUS NEWCASTLE DISEASE ISOLAT ASAL WILAYAH KERJA BALAI VETERINER LAMPUNG TAHUN Liza Angeliya Laboratorium Bioteknologi, Balai Veteriner Lampung ABSTRAK Penyakit Newcastle disease pada unggas disebabkan oleh virus ND yang tergolong dalam famili Paramyxoviridae, genus Avulavirus, spesies Avian paramyxovirus. Avian paramyxovirus Tipe I (APMV-I) adalah merupakan sinonim dari virus ND yang memiliki genotip bervariasi. Virus ND genotip VII dinyatakan sebagai penyebab kejadian penyakit ND di Asia sejak tahun Wabah ND tahun 2010 di indonesia pernah dilaporkan disebabkan oleh virus ND genotip VII. Penelitian ini bertujuan menentukan genotip virus ND asal Balai Veteriner Lampung tahun Amplifikasi fragmen gen F menggunakan primer asal Balai Veteriner Lampung dan dilanjutkan sekuensing. Data hasil sekuensing dianalisis dengan software Mega5. Berdasarkan analisis phylogenic tree dan consensus sequence isolat asal Balai Veteriner Lampung tahun termasuk dalam genotip VII subtipe a (VIIa) dan d (VIId). Kata kunci: analisis phylogenic tree, analisis consensus sequence, newcastle disease, Lampung ABSTRACT PHYLOGENIC TREE AND CONSENSUS SEQUENCE ANALYSIS OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS ISOLATES IN DISEASE INVESTIGATION CENTER LAMPUNG WORKING AREA FROM 2010 TO Newcastle disease is an infectious poultry disease that caused by Newcastle disease virus which is belongs to family Paramyxoviridae, genus Avulavirus and Avian paramyxovirus spesies. Avian paramyxovirus type I (APMV-I) is a synonym of the ND virus that has genotypes varians. ND virus genotype VII caused Newcastle disease outbreak in Asia since around Outbreaks of ND in Indonesia 2010 have been reported due to the ND virus genotype VII. The purpose of this study to genotiping the ND virus isolates in Disease Investigation Center Lampung from 2010 to Amplification of F gene fragment using primers designed by Disease Investigation Center Lampung and continued sequencing. Data of sequencing results were analyzed with Mega5 soft ware. Based on the phylogenic tree and consensus sequences analysis of isolates origin Disease Investigation Center Lampung from 2010 to 2013 included in genotype VII subtype a (VIIa) and d (VIId). Key words: phylogenic tree analysis, consensus sequence analysis, newcastle disease, Lampung 474

2 PENDAHULUAN Newcastle disease (ND) adalah penyakit pada unggas yang masih menjadi permasalahan penting karena menimbulkan kerugian ekonomi pada industri peternakan unggas baik di Indonesia maupun di dunia (Tabbu, 2000; Robinson, 1961; Hodder et al., 1993). Penyakit ND disebabkan oleh virus yang tergolong dalam famili Paramyxoviridae, genus Avulavirus, spesies Avian paramyxovirus serogrup Avian paramyxovirus Tipe I (APMV-I). Avian paramyxovirus Tipe I (APMV-I) adalah merupakan sinonim dari virus ND yang memiliki genotip yang bervariasi (Alexander and Senne, 2008). Virus ND terbagi menjadi empat panzootik besar. Genotip II dan IV merupakan epizootik pertama dari virus ND. Genotip V dan VI berhubungan dengan panzootik kedua dan ketiga. Genotip VII saat ini berkaitan dengan kejadian pandemik keempat dari ND (Lien et al., 2007). Genotip VII dinyatakan sebagai penyebab kejadian penyakit ND di Asia sejak sekitar tahun Genotip VII subgenotip VIId berdasarkan gen F merupakan patogen yang dominan di negara China (Liu et al., 2008; Rui et al., 2010), Korea (Kwon et al., 2003) dan Taiwan (Lien et al., 2008). Wabah ND di indonesia pernah dilaporkan di Banjarmasin, Sukorejo, Sragen, Kudus. Wabah tersebut disebabkan oleh virus ND genotip VII (Xiao et al., 2012). Analisis phylogenic tree dan consensus sequence pada posisi asam amino tertentu dapat digunakan untuk menentukan genotip dari virus ND (Qin et al., 2008). Penelitian ini menggunakan analisis phylogenic tree dan consensus sequence pada fragmen gen F untuk menentukan genotip virus ND asal Balai Veteriner Lampung tahun Fragmen gen F yang dianalisis pada posisi nukleotida ke MATERI Sampel yang digunakan adalah 12 isolat ND yang telah dikoleksi dari beberapa daerah di wilayah kerja Balai Veteriner Lampung. Sebanyak 12 isolat berasal dari ayam yang dipelihara di lokasi wabah maupun paska wabah ND. Data mengenai sampel tersebut dapat dilihat pada Tabel

3 Tabel 1. Isolat ND yang dilakukan pengujian No Kode sampel Asal sampel Tahun Jenis ayam /Ay/BPPV/02.10 Jati Agung 2010 Layer /PBM/LP/BPPV/02.11 Prabumulih 2011 Buras /Ay/BPPV/10.11 Batang Hari 2011 Layer /Ay/BPPV/10.11 Natar 2011 Layer /Ay/BPPV/01.11 Batu Raja Timur 2011 Buras /Ay/BPPV/01.12 Metro 2012 Buras /Ay/BPPV/02.12 Kota Palembang 2012 Buras /Ay/BPPV/09.12 Bandar Lampung 2012 Buras /Ay/BPPV/01.13 Bekri 2013 Buras /Ay/BPPV/11.13 Muara Enim 2013 Buras /Ay/BPPV/11.13 Muara Enim 2013 Buras /Ay/BPPV/12.13 Way Kanan 2013 Buras Bahan-bahan yang diperlukan pada teknik molekuler antara lain: Purelink viral RNA/DNA minikit (Invitrogen) yang terdiri dari: viral lysis buffer, wash buffer (I dan II), proteinase K (20 mg/ml), carrier RNA, Nukleasease free water, viral spin columns with collection tubes, wash tubes 2,0 ml, recovery tubes 1,5 ml, purelink filter plate, receiver plate, deep well plate dan foil tape; Primer forward dan reverse (Tabel. 2); Super Script III One Step RT-PCR Platinum Taq HiFi (Invitrogen) yang terdiri dari: Super Script III RT/Platinum Taq mix, 2x reaction mix (0,4 mm dari masing-masing dntp dan 6mM MgSO 4 ), 50mM MgSO 4 ; TBE buffer 1 x; Sybr safe dan 100 bp DNA Ladder (Invitrogen). Isolat yang digunakan sebagai kontrol berasal dari Balai Veteriner Lampung. Isolat virus ND digunakan sebagai kontrol positif dan isolat virus Avian Influenza sebagai kontrol negatif, serta nuclease free water (NFW) sebagai non template control (NTC). Tabel 2. Sekuen nukleotida primer forward dan reverse gen F Primer Sekuen 5'-3' Produk Posisi Keterangan Forward GCTGTATCTGTCTGACAAGCTCTC Balai Veteriner F 565 bp Reverse AGGTTGAGTTCTACACCAACCTGT Lampung 476

4 METODOLOGI Amplifikasi gen F menggunakan program RT (suhu 50 0 C selama 30 menit) sebanyak 1 siklus; pre denaturasi (suhu 95 0 C selama 5 menit) sebanyak 1 siklus; denaturasi (suhu 95 0 C selama 15 detik), annealing (suhu 54 0 C selama 45 detik), elongasi (suhu 72 0 C selama 60 detik) sebanyak 35 siklus; post elongasi (suhu 72 0 C selama 4 menit) sebanyak 1 siklus (Angeliya dan Cahyaningsari, 2012). Produk PCR yang diperoleh dilanjutkan dengan sekuensing. Analisis data hasil sekuensing menggunakan perangkat lunak molecular evolution genetics analysis (MEGA) versi 5. Data yang diperoleh dilakukan multiple alignment dengan clustal W, prediksi asam amino dan analisis phylogenic tree. Gambaran phylogenic tree dibuat dengan metoda Neighbor-Joining menggunakan parameter model Kimura2. Data pembanding diambil dari sekuen isolat virus ND yang ada di national center for biotechnology information (ncbi/ HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis filogenetik berdasarkan fragmen gen F sepanjang 524 nukleotida. Posisi nukleotida yang dianalisis dalam penelitian ini adalah nukleotida nomer 103 sampai 626 pada gen F. Sebanyak 12 isolat asal Balai Veteriner Lampung dibandingkan dengan isolat Virus ND yang berasal dari gene bank. Hasil analisis filogenetik dapat dilihat pada Gambar 1. Phylogenic tree menunjukkan bahwa dari semua virus yang dianalisis membentuk 9 genotip yaitu genotip I-IX. Isolat dalam penelitian ini berada dalam kelompok genotip VII. Isolat tersebut berada bersama dengan NDV/cockatoo/Indonesia/90 (AY562985), NDV/Jakarta/2007 (JX393313), Banjarmasin/2010 (HQ697254), Kudus/2010 (HQ697259), Sragen/2010 (HQ697258), Bali/2007 (AB605247), Sukorejo/2010 (HQ697255), TW/2000 (AF358786), Muscovy duck/china/2011 (FJ872531) dan GD09-1/2011 (HQ17357). Isolat dalam penelitian ini berhubungan dekat dengan isolat asal Indonesia yang pernah dilaporkan sebelumnya di Bali (Adi et al., 2010) dan di Sukorejo, Banjarmasin, Sragen, Kudus (Xiao et al., 2012). Hasil analisis filogenik menunjukkan bahwa isolat dalam penelitian ini berhubungan jauh dengan isolat asal Amerika (JX901372) dan isolat GB asal Inggris (AF109885). Isolat yang berasal dari Amerika dan Inggris termasuk dalam genotip V dan VI. Hal ini menunjukkan bahwa isolat asal Balai Veteriner Lampung tahun yang 477

5 meliputi wilayah Sumatera bagian selatan merupakan virus Indonesia dan bukan merupakan virus asal negara-negara tersebut. Hasil analisis phylogenic tree menunjukkan bahwa isolat ND asal Balai veteriner Lampung masih sama dengan virus yang menyebabkan kasus ND di Bali tahun 2007 (Adi et al., 2010), Sukorejo, Sragen, Kudus dan Banjarmasin (Xiao et al., 2012) serta di negara-negara Asia seperti Taiwan (Lien et al., 2007; Ke et al., 2010), China (Liu et al., 2008) yang merupakan genotip VII. Isolat tersebut sangat berbeda dengan strain La Sota yang termasuk dalam genotip II. Strain La Sota digunakan sebagai strain vaksin di wilayah kerja Balai Veteriner Lampung dan Indonesia pada umumnya. Virus yang bersirkulasi di wilayah kerja Balai Veteriner Lampung yang meliputi Sumatera bagian selatan ini secara genotip berbeda dengan isolat vaksin yang digunakan. Hal ini menunjukkan bahwa wabah penyakit ND yang terjadi di wilayah kerja Balai Veteriner bukan disebabkan oleh virus ND yang berasal dari isolat vaksin tetapi virus lapang genotip VII yang merupakan penyebab wabah penyakit ND di Indonesia seperti yang pernah dilaporkan di Indonesia sebelumnya (Adi et al., 2010; Xiao et al., 2012). Virus ND asal Bali tahun 2007 (AB605274) merupakan ND genotip VIIa (Adi et al., 2013) sedangkan virus ND cockatoo/indonesia/14698/90 (AY562985) adalah genotip VIIc berdasarkan data yang diperoleh dari gen bank. Isolat ND asal Jakarta yang diisolasi pada tahun 1997 (JX393313) merupakan virus ND genotip VIIb berdasarkan consensus sequence pada posisi asam amino tertentu. Isolat tersebut memiliki R 101, A 176, H 272, F 314 yang merupakan consensus sequence yang membedakan genotip VIIb dari VIIa, VIIb dan VIIc (Qin et al., 2008). Xiao et al. (2012) melaporkan bahwa isolat virus ND asal Indonesia yang meliputi Banjarmasin (HQ697254), Kudus (HQ697259), Sukorejo (HQ697255) dan Sragen (HQ697258) merupakan genotip VII. Isolat Banjarmasin (HQ697254), Kudus (HQ697259) dan Sragen (HQ697258) termasuk dalam VIId berdasarkan consensus sequence. Isolat tersebut memiliki V 52 dan G 520 yang merupakan sekuen pada genotip VIId sedangkan genotip VIIa dan VIIb memiliki I 52 dan V 520. Consensus sequence antara genotip VIIa, VIIc dan VIId banyak memiliki persamaan. Substitusi asam amino pada genotip VIId yang menciri adalah pada I 52 menjadi V 52. Tabel di atas menunjukkan bahwa isolat ND nomer 8, 9 dan 12 memiliki I 52 akan tetapi pada phylogenic tree masuk dalam percabangan genotip 478

6 VIId yang dekat dengan isolat 5, 6, 7, 10 dan 11 yang memiliki V 52. Isolat-isolat tersebut dalam phylogenic tree berada pada percabangan dengan isolat Banjarmasin (HQ697254), Kudus (HQ697259) dan Sragen (HQ697258) yang memiliki V 52 dan G 520 sehingga isolat ND nomer 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 dan 12 dalam penelitian ini merupakan virus ND genotip VIId. Isolat ND nomer 1, 2, 3 dan 4 pada urutan consensus sequence memiliki urutan yang berbeda dengan isolat 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 dan 12. Data dalam tabel tersebut tidak dapat membedakan antara genotip VIIa dan VIIc. Isolat asal Bali tahun 2007 (AB605274) yang merupakan genotip VIIa (Adi et al., 2013) memiliki F 314. Asam amino F 314 juga dimiliki oleh isolat asal Sukorejo (HQ697255). Isolat ND nomer 1, 2, 3 dan 4 berdasarkan analisis phylogenic tree berada dalam percabangan bersama dengan isolat asal Sukorejo dan Bali. Sehingga isolat tersebut digolongkan dalam genotip VIIa Sampel 5 Sampel 6 51 Sampel 7 Sampel Sampel 11 Banjarmasin HQ VIId Kudus 2010 HQ Sragen 2010 HQ Sampel Sampel 9 Sampel Bali 2007 AB Sukorejo HQ Sampel 1 Sampel 2 VIIa VII 90 Sampel Sampel 4 NDV cockatoo/indonesia/14698/90/ay taiwan AF muscovyduckchina FJ ND sh09 GU isolat GD09-1 HQ VIIc VIId Aus 32-III M24700 Herts 33 AY Jakarta 1997 JX ND Sterna/Astr/2755/2001 AY ND-chicken-Sweden-97GU GB AF usa2009 JX ND strain 1.3 EF ND strain 248VB EF ND QH1 FJ miyadera M18456 F48E9 AY FJ.1/85 AF VIIb VI V VIII III IV IX lasota DQ B I TakaakiAF II china EU australia 1998 GU D26/76 M Malaysia 2009 JQ V4 JX I 0.01 Gambar 6. Phylogenic tree Isolat asal wilayah kerja Balai Veteriner Lampung. Bootstrap 1000, tanda : isolat penelitian, posisi nukleotida pada

7 KESIMPULAN Berdasarkan analisis phylogenic tree dan consensus sequence, fragmen gen F posisi nukleotida nomer 103 sampai 626 isolat ND asal Balai Veteriner Lampung tahun merupakan virus ND genotip VII. Sebanyak 4 isolat termasuk dalam genotip VIIa dan 8 isolat adalah genotip VIId. DAFTAR PUSTAKA Adi, A. A. A. M., Kardena, I. M., Astawa, N. M., Putra, K. S. A., Hayashi, Y., and Matsumoto, Y., Isolation and characterization of pathogenic newcastle disease virus from natural case in Indonesia. J. Med. Vet. Sci. (72) 3: Adi, A. A. A. M., Astawa, N., Putra, K., Hayashi, Y., and Matsumoto, Y., Molecular Characterization of The Complete Genom of A Viscerotropic Velogenic Newcastle Disease Virus Bali-1/07. Alexander, D. J., and Senne, D. A., Newcastle disease and other Paramyxovirus Infection. In: Disease of Poultry 12 th ed. Syaif, Y. M., Fadly, A.M., Glysson, J.R., Mc.Douggald, L.B., Nolan, L.K. and Swyne, D.E. Blackwell publishing professional. IOWA. USA: Angeliya, L., dan Cahyaningsari, D., 2012, Pengembangan Metode Diagnosa Newcastle Disease dengan Menggunakan teknik RT-PCR di BPPV regional III. Prosiding Rapat Teknis dan Pertemuan Ilmiah Kesehatan Hewan. Kementerian Pertanian. 1(3): Hodder, A. N., Liu, Z. Y., Sellecck, P. W., Corino, G. L., Shiell, B. J., Grix, D. C., Morrow, C. J., and Gorman, J. J., Characterization of field isolats of newcastle disease virus using antipeptide antibodies dalam Avian Disease. 38: Ke, M. G., Yu, S. W., Ho, C. H., Chu, P. Y., Ke, L. Y., Lin, K. H., Tsai, Y. C., Liu, H. J., and Lin, M. Y., Characterization of newly emerging newcastle disease viruses during in Taiwan. Virus Research. 147: Kwon, H. J., Cho, S. H., Ahn, Y. J., Seo, S. H., Choi, K. S., and Kim, S. J., Molecular epidemiology of Newcastle Disease in Republic Korea. Veterinary Microbiology. 95: Lien, Y. Y., Lee, J. W., Su, H. Y., Tsai, H. J., Tsai, M. C., Hsieh, C. Y., and Tsai, S. S., Phylogegenic characterization of newcastle disease viruses isolated in Taiwan During Veterinary Microbiology. 123: Liu, H., Wang, Z., Wu, Y a., Wu, Y b., Sun, C., Zheng, D., Xu, T., and Li, J., Molecular characterization an phylogenetic analysis of new newcastle 480

8 disease virus isolated from the mainland China. Veterinary Science. 85: Robinson, L., Modern Poultry Husbandry. Crosby Lockwood ltd. London: Rui, Z., Yu, S. W., Ho, C. H., Chu, P. Y., Ke, L. Y., Lin, K. H., Tsai, Y. C., Liu, H. J. and Lin, M. Y., Phylogenetic characterization of newcastle disease virus isolated in the mainland of China during Veterinary Microbiology. 141: Tabbu, C. R., Penyakit Ayam dan Penanggulangannya. Kanisius. Yogyakarta. 15: Qin, Z. M., Tan, L. T. Xu, H. Y., Ma, B. C., Wang, Y. L., Yuan, X. Y., and Liu, W. J., Pathotypical characterization and molecular epidemiology of newcastle disease virus isolats from different host in China from 1996 to Journal of Clinical Microbiology. 46: Xiao, S., Paldurai, A., Nayak, B., Samuel, A., Bharoto, E. E., Prajitno, T. Y., Collins, P. L., and Samala, S. K., Complete genome sequences of newcastle disease virus strains circulating in chicken populations of Indonesia. Journal of Virolog: