Studi Keanekaragaman Nukleotida Gen Car A beberapa Species Salmonella dengan Teknologi PCR

Transkripsi

1 Studi Keanekaragaman Nukleotida Gen Car A beberapa Species Salmonella dengan Teknologi PCR Nurhasanah Jurusan Kimia, FMIPA Universitas Lampung Jl. S. Brojonegoro No.1 Bandar lampung nurani12@yahoo.com Abstract CarA genes, known as carbamoil phosphate sintetase encode gene, are possessed by all organisms. This research aims to study the biodiversity cara genes nucleotide of several Salmonella species. We, here, reported 0.7 kb cara genes nucleotide fragment from several Salmonella species. This fragment was obtained through the PCR chromosome DNA from each of Salmonella used by utilizing CA-3/Prev primers. The fragment obtained was similar to the DNA amplification chromosome of S. thyphi and S. parathypi reported previously. The result revealed that 0.7 kb fragment showed the biodiversity of cara genes nucleotide possessed by several Salmonella species. Keywords: Gen cara, Salmonella, PCR 124 Pendahuluan Salmonella merupakan organisme prokariotik yang termasuk dalam famili Enterobacteriaceae, Ordo Eubacteriales, klas Schizomicetes dan divisi Protophyta. Genus ini umumnya dipandang sebagai patogen, terutama sebagai penyebab septisemia (infeksi pada darah), gangguan pada saluran pencernaan (gastroenteritis) pada hewan dan manusia, serta demam tifoid pada manusia 1. Semua species Salmonella mempunyai banyak kesamaan sifat baik secara fisik maupun kimia. Species ini merupakan bakteri gram negatif, bersifat fakultatif anaerob, berbentuk batang lurus dan bergerak dengan flagella yang peritrik (non-polar), dapat memfermentasikan glukosa dan manosa, juga memiliki sifat khas yaitu kemampuannya untuk menghasilkan gas H 2 S 2. Setiap mikroorganisme memiliki ukuran gen yang berbeda. Gen merupakan segmen DNA yang mengode suatu produk fungsional seperti molekul RNA atau polipeptida. Salah satu contohnya adalah operon CarAB yang terdiri atas dua gen yaitu gen CarA dan gen CarB. Sistim gen CarAB juga merupakan salah satu housekeeping genes yaitu gen-gen yang diekspresikan oleh semua jenis sel atau organisme hidup termasuk bakteri. Sampai saat ini, mikroorganisme yang operon CarABnya telah ditentukan secara lengkap adalah Eschericia coli K12 dan Salmonella typhimurium 3. Berdasarkan studi fungsi operon CarAB kedua bakteri ini merupakan pengode dua subunit enzim karbamoil fospat sintetase. Semua species Salmonella juga mempunyai sistim operon CarAB, tetapi urutan nukleotida gen tersebut baru diketahui pada dua species yaitu Salmonella typhi dan Salmonella typhimurium. Urutan nukleotida gen cara S. typhi didapat dengan cara memperbanyak DNA kromosom S.typhi Lister menggunakan

2 J. Sains Tek., Agustus 2004, Vol. 10, No. 2 primer yang dirancang berdasarkan urutan nukleotida operon carab E.coli K12 yang datanya telah lengkap PCR dengan primer yang dirancang berdasarkan urutan nukleotida gen cara kedua organisme tersebut membuka peluang untuk digunakan dalam mempelajari keanekaragaman nukleotida gen car A bakteri lainnya. Teknologi PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan teknik perbanyakan fragmen DNA secara in vitro yang dibatasi oleh dua buah primer. 4 Teknologi ini dapat digunakan untuk pengembangan ilmu dasar maupun ilmu terapan seperti kedokteran, pertanian, forensik dan lain-lain. PCR juga dapat digunakan untuk mendiagnosis ada tidaknya organisme tertentu dalam suatu specimen 5. Selain itu, dengan teknologi ini dapat dipelajari filogenetik dan evolusi genetik serta keanekaragaman genetik dari berbagai organisme 6. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari keanekaragaman nukleotida gen car A dari beberapa species Salmonella. Hal ini dilakukan dengan cara mengamplifikasi DNA kromosom dari masing-masing bakteri Salmonella menggunakan primer CA-3/Prev yang dirancang berdasarkan urutan nukleotida gen car A bakteri S. typhi dan S. paratyphi. Metode Penelitian Sampel utama dalam penelitian ini adalah bakteri Salmonella paratyphi E, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Eschericia coli K12, Salmonella derby, Salmonella virginia dan puc19/- Hinf I. Sedangkan bahan kimia yang digunakan adalah media biakan Luria Bertani untuk memperbanyak bakteri (bakto tripton 15 b/v, bakto yeast ekstrak 0,5 % b/v, NaCl 1% b/v dan bakto agar 1,5 % b/v dalam aquades), pereaksi PCR (buffer PCR 10 x, 10 mm dntp, primer CA-3 20 pmol/:l, primer Prev 20 pmol/:l, 0,75 unit enzim Taq DNA polimerase), gel agarosa 1 %, buffer TAE 1X, EtBr 10 :g/ml. Pembuatan Media Biakan dan Penanaman Bakteri Media yang digunakan untuk memperbanyak biakan bakteri adalah media padat LB (Luria Bertani). Media ini disterilisasi dalam autoclave selama 20 menit pada tekanan 15 lb/sq. Setelah selesai proses sterilisasi dan suhu media sekitar 50 o C, media dituangkan ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan sampai membeku. Pengerjaan ini dilakukan dalam kondisi aseptik. Setelah membeku media dapat disimpan pada -4 o C dan siap untuk digunakan 7. Penanaman bakteri ke dalam media padat LB dilakukan dengan cara mengambil sedikit masing-masing biakan bakteri Salmonella paratyphi E, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Eschericia coli K12, Salmonella derby, Salmonella virginia yang ada pada stok gliserol menggunakan tusuk gigi steril kemudian digoreskan secara zig-zag pada masingmasing cawan petri yang telah berisi media pada LB steril. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama jam, sehingga didapatkan koloni tunggal dari masing-masing biakan bakteri 7. Penyiapan Templat DNA Masing-masing satu koloni bakteri yang telah tumbuh dilisis dalam tabung eppendorf menggunakan 200 :L buffer lisis (50 mm Tris-HCl ph 8,5; 1 mm EDTA ph 8,5; 0,5 % Tween-20, 10 :L proteinase K 10 mg/ml dan aquades). 125

3 Campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu 55 o C dalam incubator, dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 95 o C selama 10 menit. Campuran reaksi yang dihasilkan disentrifugasi pada g selama 3 menit dan supernatan yang didapat diambil sebagai templat DNA 8. Reaksi PCR Sebanyak 5 :L templat dari masingmasing bakteri dimasukkan ke dalam masing-masing tabung eppendorf yang telah berisi komponen pereaksi PCR, kemudian dimasukkan ke dalam alat DNA Thermal Cycler. Tahap pertama yaitu denaturasi awal dilakukan pada suhu 94 o C selama 1 menit. Tahap kedua, masuk siklus PCR yang terdiri dari tiga tahap yaitu denaturasi 94 o C, 1 menit; penempelan primer (annealing) 50 o C, 1 menit dan polimerisasi 72 o C, 1 menit, reaksi dilakukan sebanyak 30 siklus. Tahap akhir, proses polimerisasi pada suhu 72 o C, 4 menit 9,10. Analisis Hasil PCR Hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1 % (b/v) menggunakan DNA electrophoresis cell. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan agarosa dalam buffer TAE 1x. Larutan dipanaskan hingga agarosa melarut semua dan didinginkan sampai kurang lebih suhu 50 o C dan ditambahkan 1 µl EtBr 10 µg/ml. Kemudian larutan agar dituangkan ke dalam cetakan yang memiliki sisir pembentuk sumur gel dan didiamkan sampai membeku. Setelah terbentuk gel pada cetakan, sisir diangkat sehingga terlihat sumur gel. Sebanyak 10 µl sampel hasil PCR dicampurkan dengan 2 µl loading buffer dan dimasukkan ke dalam masing-masing sumur gel 7. Proses elektroforesis dilakukan selama 45 menit pada tegangan 80 volt dalam buffer TAE 126 1x. Analisis ukuran fragmen dilakukan dengan menggunakan penanda puc19/- HinfI. Penampakan hasil elektroforesis dilakukan menggunakan lampu UV dan difoto dengan kamera Polaroid. Hasil dan Pembahasan DNA templat dari masing-masing bakteri didapatkan dengan menggunakan metoda lisis secara kimia dimana salah satu komponen pereaksi lisis adalah senyawa Tween-20. Senyawa ini merupakan detergen non ionic yang terdiri dari bagian hidrofilik yang disusun oleh senyawa ester/alkohol dan bagian hidrofobik yang merupakan rantai panjang hidrokarbon. Interaksi hidrofobik dan hidrofilik antara Tween-20 dengan senyawa lipid sebagai komponen utama penyusun dinding sel bakteri mampu merubah struktur dinding sel dari pola yang teratur dan kompak menjadi tidak teratur. Pemanasan pada proses aktivasi proteinase K suhu 55 o C selama 1 jam juga dapat membantu merusak dinding sel bakteri sehingga pecah dan menghasilkan ekstrak sel yang mengandung DNA yang dapat digunakan sebagai templat pada proses PCR. Proses PCR DNA templat dari masingmasing bakteri ini dilakukan dengan menggunakan sepasang primer CA-3 dan Prev. Primer CA-3 didapatkan dari penentuan urutan nukleotida gen cara S. typhi sedangkan primer Prev didapat dari penentuan urutan nukleotida S. paratyphi. Pasangan primer ini dapat mengamplifikasi DNA kromosom S. paratyphi menghasilkan fragmen ukuran 0,7 kb. Diharapkan pasangan primer ini juga dapat menghasilkan fragmen 0,7 kb untuk beberapa species Salmonella yang belum diuji

4 J. Sains Tek., Agustus 2004, Vol. 10, No ,7 kb Gambar 1. Fragmen 0,7 kb dari masing-masing bakteri. Jalur 1 adalah DNA penanda yaitu puc19 yang dipotong dengan enzim restriksi HinfI (puc19/hinfi); jalur 2 adalah kontrol positif PCR yaitu DNA S. paratyphi E, jalur 3 S.typhi, jalur 4 E.coli K12, jalur 5 S. typhimurium, jalur 6 S.derby dan jalur 7 S. Virginia yang diamplifikasi dengan primer CA-3/Prev; jalur 8 adalah kontrol negatif. Pada Gambar 1, jalur 1 merupakan marker puc19/hinfi yang menghasilkan beberapa pita fragmen yaitu 1419 pb, 517 pb, 396 pb, 214 pb, 75 pb dan 65 pb. Jalur 2 adalah S. paratyphi E yang digunakan sebagai kontrol PCR. Sampel untuk kontrol PCR ini digunakan sampel DNA bakteri yang telah berhasil diuji dan digunakan dalam proses ini untuk menunjukkan bahwa proses PCR berjalan dengan baik. Gambar 1 yang didapat dari hasil analisis PCR, memperlihatkan fragmen 0,7 kb untuk beberapa spesies Salmonella yang lain. Fragmen yang didapatkan dari hasil amplifikasi DNA kromosom masing-masing bakteri Salmonella ini juga diyakini bukan merupakan suatu kontaminan. Hal ini dibuktikan dengan adanya hasil PCR kontrol negatif yang tidak mengandung templat DNA bakteri apapun. Pada kontrol negatif ini, templat DNA diganti dengan ddh 2 O steril dan tidak menunjukkan adanya pita pada gel agarosa. Hasil pengamatan tersebut menunjukkan bahwa beberapa spesies Salmonella yang lain dapat teramplifikasi pada daerah tersebut dan menghasilkan fragmen 0,7 kb dengan primer CA-3/Prev. Ini menunjukkan bahwa urutan nukleotida yang dimiliki oleh masing-masing bakteri spesies Salmonella mempunyai sebagian urutan nukleotida gen cara yang sama dengan urutan nukleotida S. typhi dan S. paratyphi. Kesimpulan Metode PCR yang dilakukan terhadap sejumlah bakteri menunjukkan adanya keanekaragaman nukleotida gen cara yang tidak hanya dimiliki oleh S. typhi dan S. paratyphi, tetapi juga dimiliki oleh beberapa spesies Salmonella lainnya. Ini dibuktikan dengan teramplifikasinya fragmen 0,7 kb dengan primer CA-3/Prev yang dirancang berdasarkan urutan nukleotida S. typhi dan S. paratyphi. Namun untuk membuktikan adanya homology 100 % dari urutan nukleotida fragmen 0,7 kb gen cara masing-masing spesies Salmonella dengan gen cara dari S. typhi maupun S. paratyphi perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan melakukan sequensing nukleotida fragmen 0,7 kb dari masing-masing spesies Salmonella. Ucapan Terimakasih Diucapkan terimakasih kepada Bapak Achmad Saifuddin Noer, Ph.D atas izin penggunaan seluruh fasilitas di Laboratorium Rekayasa Genetika. Juga kepada seluruh staf di Laboratorium Rekayasa Genetika PAU ITB atas saran 127

5 dan bantuannya sehingga penelitian ini dapat terlaksana dengan baik. Daftar Pustaka 1. Keusch, G.T Salmonellosis, Braundwald et. al., (editor). Harrison s Principle of Internal Medicine. 12 th ed. Vol. 1. Health Professions Edition. Singapore Butler, T Typhoid Fever. Wyngaarden, J.B., Smith, L.H.,and Bennet, J.C., (Editor). Textbook of Medicine. 19 th ed. Vol. 2. W.B. Saunders Company. Philadelphia, Rudiretna, A Gen Mirip CarA Pada Salmonelle typhi. Disertasi. Pascasarjana Institut Teknologi Bandung. 4. Newton, C.R. and Graham, A nd ed. PCR, Imtroduction to Biotechniques. BIOS Scientific Publisher Ltd. Oxford. 5. Chaudry, R., Lakshmi, B.V., Nisar, N., Ray, K., and Kumar, D Standarisation of Polymerase Chain Reaction for the Detection of Salmonella typhi in Typhoid Fever. J. Clinical Pathology : Selander, R. K., Beltran, P., Smith, N.H., Helmuth, R., Rubin, F. A., Kopecko, D. J., Ferris, K., Tall, B. D., Cravioto, A., Musser, J. M Evolutionary Genetic Relationships of Clones of Salmonella Serovars That Cause Human Typhoid and Other Enteric Fevers. J.Infection and Immunity : Sambrook, J. Fritsh, E.F. Maniatis, T Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2 nd ed. Vol Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA. 8. Noer, A.S., Martasih, F., Mulyani S., Muktiningsih, dan Wirahadikusumah, M Analisis Variasi Urutan Nukleotida D-Loop MtDNA Manusia dari Beberapa Daerah di Indonesia. Prosiding Seminar Kimia Bersama UKM-ITB Pertama. 9. Innnis, M.A., and Gelfand, H Optimization of PCR. In Innis, M.A., et al.(eds): PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications. Academic Press Inc. California. pp Perkin Elmer DNA Thermal Cycler; Users Manual. The Perkin Elmer Coorperation. USA. 128