Bab IV Hasil dan Pembahasan

Transkripsi

1 Bab IV Hasil dan Pembahasan

2 Dalam bab ini akan dibahas hasil-hasil yang diperoleh dari prosedur kerja yang sesuai dengan tahapan-tahapan yang telah dikemukakan pada Bab III Metodologi Penelitian untuk memperoleh mtdna daerah D-loop Elephas maximus indicus. Adapun pembahasan dimulai dari pengumpulan sampel, penyiapan template DNA, hasil amplifikasi setiap sampel secara in vitro dengan metode PCR dan hasil sequencing. Selanjutnya dilakukan analisis terhadap hasil sequencing dengan melakukan perbandingan terhadap mtdna gajah yang telah diteliti sebelumnya dan telah dipublikasikan di GenBank. IV.1 Pengumpulan Sampel Pada penelitian ini digunakan tiga sampel gajah Sumatera (Elephas maximus sumatrensis) yang berada di Kebun Binatang Bandung. Dua gajah memiliki hubungan keluaraga yang merupakan induk dan anak, sementara satu gajah lainnya tidak memiliki hubungan darah namun semuanya berasal dari daerah yang sama yaitu dari Way Kambas. Sumber sel diambil dari akar rambut. Data fisik masing-masing individu yang digunakan untuk sampel mtdna dapat dilihat pada abel IV.1 abel IV.1 Data fisik individu sampel mtdna mitokondria gajah Sumatera. Pengambilan ketiga sampel dibantu oleh petugas Kebun Binatang Bandung. Nama Gajah Kode Sampel Jenis Kelamin Usia Daerah Asal Yani Betina 40 tahunan Way Kambas Yamon Jantan 9 tahun Way Kambas Ira Betina 40 tahunan Way Kambas IV.2 Penyiapan emplat mtdna Sampel rambut yang telah didapat diambil akarnya lalu dipotongan kecil-kecil kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml setelah itu dilakukan lisis yang bertujuan untuk memecah dinding sel dan mengeluarkan seluruh isi sel 26

3 termasuk DNA. Pemecahan dinding sel sampel ini dilakukan senyawa kimiawi dengan menggunakan bufer lisis yang mengandung ween-20 (Merck) dan proteinase K. ween-20 adalah deterjen non-ionik yang dalam larutannya membentuk micelles. Struktur molekul ween-20 memiliki bagian hidrofilik yang tersusun oleh senyawa ester atau alkohol dan bagian hidrofobik yang merupakan senyawa hidrokarbon. Interaksi bagian hidrofilik micelles ween-20 dengan senyawa fosfolipid membran sel membuat senyawa fosfolipid membran larut membentuk campuran micelles dengan ween-20. Pemanasan pada suhu 50 C menyebabkan struktur membran sel menjadi rusak dan mengaktifkan kerja proteinase K. Penambahan enzim proteinase K adalah untuk mendegradasi enzimenzim DNAse dan protein lainnya. Enzim proteinase K selanjutnya dideaktivasi pada suhu 95 C selama 6 menit. Ekstrak DNA hasil lisis langsung dijadikan templat untuk PCR [Noer et al., 1994]. Setelah inkubasi diatas kemudian dilakukan sentrifuga agar molekul mtdna terpisah dengan molekul-molekul lainnya berdasarkan perbedaan massa karena massa mtdna yang kecil maka dengan sentrifugasi akan berada di sekitar bagian atas supernatan. Supernatan tersebut kemudian dipipet dengan hati-hati dan dimasukkan ke dalam tabung aliquot baru. Penyimpanan templat dilakukan pada frezeer bersuhu C. IV.3 Amplifikasi Fragmen 450 pb mtdna dengan Metode PCR Hasil lisis diamplifikasi secara in vitro dengan metode PCR. Komponen dan komposisi pereaksi sangat menentukan keberhasilan suatu PCR. Salah satu komponen tidak disertakan dalam pembuatan master mix akan membuat reaksi PCR tidak berjalan, begitu juga jumlah bahan yang kurang atau terlalu berlebih akan memberikan hasil yang tidak dinginkan. Komponen terpenting dan berbeda dalam tiap reaksi PCR adalah templat dan primer. Primer yang digunakan untuk sampel gajah pada penelitian ini adalah sepasang primer P22F/P22R untuk mengamplifikasi sebagian daerah D-loop pada posisi nukleotida sampai berukuran 450 pb. Urutan nukleotida masing-masing primer yaitu: primer P22F 5 - CCGACGGCAAGCGC -3, primer P22R 5 - CAGCAAGCCGGAGGACA -3. Kriteria khusus untuk primer, yaitu: harus terletak pada arah yang benar, jumlah G-C lebih besar dari jumlah A-, ujung 3 27

4 harus G atau C, bila dapat primernya tidak mempunyai komplemen di untai lain selain untai awal dan ujung-ujung jangan saling berkomplemen karena dapat membentuk polindron atau loop. Skema penempelan dan arah masing-masing primer PCR dapat dilihat pada Gambar IV.1. Amplifikasi dengan PCR dilakukan dengan menggunakan mesin PCR merek GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, AS). Siklus PCR pada penelitian ini meliputi tiga tahap yaitu, tahap inisiasi atau denaturasi awal, tahap ekstensi, dan tahap pemantapan. ahap persiapan dilakukan pada suhu 94 C selama satu menit sebanyak satu kali. ahap ekstensi terbagi menjadi tiga tahap yaitu; tahap denaturasi pada suhu 94 C selama satu menit yang bertujuan untuk melepaskan semua ikatan hidrogen yang menghubungkan dua rantai DNA sehingga menghasilkan DNA untai tunggal, kemudian dilanjutkan oleh tahap penempelan primer (annealing) pada suhu 48 C selama satu menit. Suhu pada tahap annealing ditentukan oleh jenis primer. Pada penelitian ini dilakukan optimasi suhu dimana dilakukan beberapa kali PCR dengan suhu annealing berbeda dari range 45 0 C sampai 50 0 C dan hasil yang memperlihatkan pita paling jelas pada gel agarosa adalah pada suhu 48 0 C dan setelah itu tahap perpanjangan rantai (elongation) pada suhu 72 C selama satu menit. Ketiga tahap ekstensi ini dilakukan sebanyak 30 siklus. ahap terakhir adalah pemantapan, dilakukan pada 72 C selama empat menit yang bertujuan untuk meyakinkan bahwa untai tunggal DNA yang tersisa sudah terkopi semua. D-loop P22F P22R Gambar IV.1 Skema penempelan dan arah primer PCR P22F dan P22R pada templat mtdna. Simulasi primer terhadap gajah India (Elephas maximus indicus), pada daerah D-loop. Primer P22F posisi arah maju, sedangkan primer P22R posisi memiliki arah IV.4 Analisis Hasil balik. PCR 28

5 Hasil PCR kemudian dianalisis dengan metode elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,5 % (b/v) menggunakan standar puc19/hinfi dengan lima fragmen DNA berukuran 1419 pb, 517 pb, 396 pb, 214 pb dan 75 pb. Proses amplifikasi melalui PCR dinyatakan berhasil apabila kontrol positif memberikan hasil positif yaitu dengan munculnya satu pita dan kontrol negatif memberikan hasil negatif yaitu tidak munculnya pita pada gel serta sampel menghasilkan pita pada daerah 0,4 kb (Gambar IV.2) pb 517 pb 396 pb 214 pb 75 pb 0,4 kb 0,6 kb Gambar IV.2 Fragmen 0,4 kb mtdna hasil PCR menggunakan primer P22F dan P22R. (1). Standar DNA puc19/hinfi, (2). Kontrol negatif reaksi PCR (3). Kontrol positif reaksi PCR (4). Sampel (hasil presipitasi DNA), (5). Sampel, (6). Sampel, (7). Sampel. Kondisi elektroforesis: gel agarose 1,5%; bufer AE 1X; volume sampel 5 L; loading buffer 3 L; tegangan 80V selama 35 menit. Pada Gambar IV.2 semua sampel memberikan hasil amplifikasi fragmen berukuran 0,4 kb yang terletak hampir sejajar dengan pita 396 kb standar DNA puc19/ HinfI, Untuk kontrol positif digunakan sampel DNA E. coli dengan primer CA-1 dan CA-2 yang sudah menunjukan hasil positif sebelumnya untuk menunjukan bahwa proses PCR berjalan dengan baik. Kontrol positif memberikan hasil amplifikasi fragmen berukuran 0,6 kb (Gambar IV.2). Sedangkan untuk kontrol negatif digunakan ddh O steril sebagai templat. Kontrol negatif tidak 2 memberikan hasil amplifikasi. Oleh karena itu fragmen hasil amplifikasi yang diperoleh dipastikan bukan suatu kontaminan karena hasil PCR kontrol negatif 29

6 yang tidak mengandung templat DNA tidak menunjukkan adanya pita pada gel elektroforesis. Hasil elektroforesis gel agarosa ini juga membuktikan bahwa metode lisis sel rambut yang telah dilakukan ternyata berhasil. IV.5 Hasil Sequensing dan Urutan Nukleotida Sampel Sequencing hasil PCR dilakukan oleh Macrogen Inc. dan hasil yang diperoleh berupa elektroforegram yang menunjukkan urutan nukleotida sampel. Gambar IV.3. merupakan contoh elektroforegram yang didapat dari sampel dalam penelitian ini. Gambar IV.3 Elektroforegram hasil sampel menggunakan primer P22F. Kurva berwarna hijau menunjukkan basa adenin, kurva berwarna biru menunjukkan basa sitosin, kurva berwarna hitam menunjukkan basa guanin dan kurva berwarna merah menunjukkan basa timin. Data elektroforegram hasil sekuensing ditunjukkan dalam bentuk puncak-puncak karakteristik untuk masing-masing nukleotida yang merupakan hasil fluoresensi masing-masing pewarna (dye) yang dibawa oleh ddnp. Nukleotida A memberikan puncak berwarna hijau, G warna hitam, C warna biru, warna merah. Notasi N memiliki arti bahwa terdapat puncak yang tidak jelas yang disebabkan bertumpuknya beberapa puncak pada satu posisi atau terlalu rendahnya puncak yang dihasilkan dari nukleotida tersebut sehingga mesin sequencing tidak dapat memutuskan notasi nukleotidanya dalam bentuk yang 30

7 mewakili lambang basa tertentu. Notasi N ini dapat diperbaiki secara manual dengan mengamati puncak dan mengganti notasi yang sesuai. Dari data elektroforegram terutama setelah dilakukan pembacaan ulang secara manual dan menyesuaikannya dengan daerah D-loop mtdna gajah Asia maka diperoleh urutan nukleotida sampel. Urutan nukleotida berdasarkan data elektroforegram hasil sekuensing pada Gambar IV.3 dapat dilihat pada Gambar IV.4 Gambar IV.4 Urutan nukleotida sampel hasil sekuensing menggunakan primer P22F. Hasil pembacaan menunjukkan jumlah nukleotida sebanyak 412 pb di daerah D-loop gajah Sumatera. Pada penelitian ini telah berhasil dilakukan sekuensing terhadap tiga sampel gajah Sumatera. Sekuensing fragmen menghasilkan 419 pb untuk sampel, 415 pb untuk sampel dan 412 pb untuk sampel. IV.6 Mutasi-Mutasi pada Sampel Untuk melihat mutasi yang terjadi pada sampel dilakukan analisis homologi dimana dalam analisis ini akan membandingkan data elektroforegram mtdna sampel yang didapatkan dari hasil sekuensing dengan data mtdna yang didapatkan dari GenBank. Analisis mutasi pada setiap sampel dilakukan dengan menggunakan program komputer Seqman (DNASAR). Program komputer tersebut akan mempermudah analisis karena mutasi yang terjadi akan ditandai dengan warna merah. Gambar IV.5. adalah contoh mutasi yang terjadi pada mtdna daerah D-loop gajah. program seqman akan mengalurkan urutan nukleotida sampel dalam format abi karena akan memberikan data mengenai elektroforegram sampel. Sedangkan untuk data mtdna gajah dari GenBank 31

8 digunakan format seq karena tidak diperolehnya data elektroforegram urutan nukleotida mtdnanya. Gambar IV.5 Mutasi sampel. Urutan nukleotida pada posisi ini mengalami mutasi dari menjadi C. Mutasi ini dinamakan substitusi transisi pirimidin ke pirimidin. Fragmen 0,4 kb mtdna hasil elektroforesis yang disekuensing merupakan bagian dari daerah D-loop mtdna gajah Sumatera. Fragmen ini berada pada posisi pada gajah Asia pada (Gambar IV.1), pada gajah Afrika, dan pada. Penomoran nukleotida disesuaikan dengan urutan gajah Asia (Elephas maximus) [Rogaev et al., 2006], gajah Afrika (Loxodonta africana)[hauf et al., 2000] dan (Mammuthus primigenius)[krause et al., 2006]. Jumlah sampel yang berhasil disekuensing adalah tiga sampel, yaitu sampel, dan. Urutan nukleotida hasil sekuensing setiap sampel dibandingkan terhadap urutan nukleotida gajah Asia (accession number DQ316068), gajah Afrika (accession number AJ224821) dan (accession number DQ188829) (Gambar IV.6). Jumlah total nukleotida yang dapat dibaca adalah 403 pb dari rata-rata 420 yang berhasil di sequensing. Mutasi ketiga sampel dapat dilihat pada gambar IV.6. ACAGCAA ACCAGCAA CACCCCAA CACCCCAA CGGGACC GGGACC AACACC AACACC ACCCCGAGA ACCCCGAGA

9 33 ACAGCAA ACAGCAA ACAGCAA ACAGCAA AACCACAAC AACCACAAC AACCACAAC AACCACAAC AACCACAAC AACCACAAC AAGGGGG AAGGGGG AAGGGGG AACGGGGG AACGGGGG AACGGGGG CAGGACCA CAGGACCA CAGGACCA CAGGACCA CAGGACCA CAGGACCA CCGAGGA CCGAGGA CCGAGGA CCGAGGA CCGAGGA CCGAGGA GCAGCA GCAGCA GCAGCA GCAGCA GCAGCA GCAGCA GGCCGCGA GGCCGCGA GGCCGCGA GGCCGCGA GGCCGCGA GGCCGCGA GAGAAA GAGAAA GAGAAA GAGAAA GAGAAA GAGAAA CG CG CG CG CG CG CACCCCAA CACCCCAC CACCCCAC CACCCCAC GCAAC GCAAC GCAAC GCAAC GCAAC GCAAC CCACCAAA CCACCAAA CCACCAAA CCACCAAA CCACCAAA CCACCAAA AAGACA AAGACA AAGACA AAGACA AAGACA AAGACA GGAC GGAC GGAC GGAC GGAC GGAC GGCCAACA GGCCCAACA GGCCCAACA GGCCAACA GGCCAACA GGCCAACA GACGGCAC GACGGCAC GACGGCAC GACGGCAC GACGGCAC GACGGCAC GGGACC -GGGACC -GGGACC -GGGACC CGGCCC CGGCCC GGACAA GGACAA GGACAA GGACAA GGACAA GGACAA ACGCCCA ACGCCCA ACGCCCAC ACGCCCA ACGCCCA ACGCCCA ACAGCCCA ACAGCCCA ACAGCCCA ACAGCCCA ACAGCCCA ACAGCCCA AAGG AAGG AAGG AAGG AAGG AAGG CAGCAAGCA CAGCAAGCA CAGCAAGCA CAGCAAGCA CAGCAAGCA CAGCAAGCA GGAAAG GGAAAG GGAAAG GGAAAG GGAAAG GGAAAG AACACC AACACC AACACC AACACC CCCGCC CCCGCC CCCGCC CCCGCC CCCGCC CCCGCC CCGGCAC CCGGCAC CCGGCAC CCGGCAC CCGGCAC CCGGCAC CCCC CCCC CCCC CCCC CCCC CCCC GACAAACA GACAAACA GACAAACA GACAAACA GACAAACA GACAAACA GGAGCGG GGAGCGG GGAGCGG GGAGCGG GGAGCGG GGAGCGG ACGAGC ACGAGC ACGAGC ACGAGC ACGAGC ACGAGC GGGAA GGGAA GGGAA GGGAA GGGAA GGGAA ACCCCGAGA ACCCCGAGA ACCCCGAGA ACCCCGAGA CGGGCCCAC CGGGCCCAC CGGGCCCAC CGGGCCCAC CGGGCCCAC CGGGCCCAC GGCAC GGCC GGCAC GGCAC GGCAC GGCAC AAAAAGACA AAAAAGACA AAAAAGACA AAAAAGACA AAAAAGACA AAAAAGACA AACGGG AACGGG AACGGG AACGGG AACGGG AACGGG ACAGCA ACAGCA ACAGCA ACAGCA ACAGCA ACAGCA GAGCGAA GAGCGAA GAGCGAA GAGCGAA GAGCGAA GAGCGAA CAGCAAGC CAGCAAGC CAGCAAGC CAGCAAGC CAGCAAGC CAGCAAGC Gambar IV.6. Homologi urutan nukleotida pada fragmen 403 pb ketiga sampel urutan nukleotida gajah Sumatera dengan urutan nukleotida gajah Asia, gajah Afrika dan. Mutasi ditandai dengan lingkaran warna kuning. Urutan nukleotida yang termutasi berwarna merah.

10 Dari gambar IV.6 Analisis homologi urutan nukleotida mtdna ketiga gajah Sumatera tidak mengalami mutasi sepanjang 403 pb, sedangkan ketika membandingkan urutan nukleotida gajah sumatera menunjukkan adanya tiga mutasi terhadap gajah India yaitu, A15736C, 15820C, dan adanya delesi C pada posisi erhadap gajah Afrika terdapat enam mutasi yaitu, C15716, A15734C, 15818C, 15862A, C16029 dan pada posisi mengalami delesi. erhadap mengalami lima mutasi yaitu, A15739C, 15823C, C15898, dan C16034, dan delesi pada posisi Gambar IV.7. Mutasi gajah Sumatera terhadap gajah Asia (Elephas maximus indicus). erjadi mutasi pada posisi nukleotida 15736, dan Daerah yang termutasi ditandai dengan tanda panah. Hasil homologi dengan menggunakan program seqman DNAStar menunjukan pada fragmen mtdna gajah Sumatera terhadap gajah Asia subspesies gajah India (Elephas maximus indicus) terdapat tiga mutasi, yaitu mutasi basa A (puncak hijau) menjadi C (puncak biru) pada posisi nukleotida erjadi delesi basa C (puncak biru) pada posisi Pada posisi nukleotida terjadi mutasi (puncak merah) menjadi C (puncak biru) (Gambar IV.7). 34

11 A. B. C. D. Gambar IV.8 Mutasi mtdna gajah Sumatera terhadap gajah Afrika. erjadi mutasi pada posisi nukleotida 15716, 15735, 15734, 15818, dan Daerah yang termutasi ditandai dengan tanda panah. Hasil homologi sampel ketiga gajah Sumatera terhadap gajah Afrika menunjukkan beberapa mutasi, yaitu mutasi basa C (biru) menjadi basa (merah) pada posisi nukleotida Mutasi basa A (hijau) menjadi basa C (biru) pada posisi nukleotida Delesi terjadi pada basa pada posisi nukleotida (Gambar IV.8.A). mutasi basa (merah) menjadi basa C (biru) pada posisi nukleotida (Gambar IV.8.B). Mutasi basa (merah) menjadi basa A (hijau) pada posisi nukleotida (Gambar IV.8.C). Mutasi basa C (biru) menjadi basa (merah) pada posisi nukleotida (Gambar IV.8.D). Pada posisi terdapat kesalah pembacaan oleh mesin sequensing dimana seharusnya di posisi 35

12 15617 terdapat basa C (puncak biru) sehingga memang tidak terjadi mutasi pada posisi tersebut. Jumlah basa yang termutasi pada urutan nukleotida gajah Sumatera terhadap gajah Afrika (Loxodonta africana) adalah enam mutasi pada fragmen 0,4 kb. Gambar IV.9 Mutasi mtdna gajah Sumatera terhadap (Mammuthus primigenius). erjadi mutasi pada posisi nukleotida 15739, 15740, 15823, 15898, dan Daerah yang termutasi ditandai dengan tanda panah. Mutasi yang terjadi pada tiga urutan nukleotida gajah Sumatera terhadap urutan nukleotida terdapat lima mutasi yang masing-masing adalah mutasi basa A ( hijau) menjadi basa C (biru) pada posisis nukleotida Delesi basa terjadi pada posisi nukleotida Mutasi basa (merah) menjadi basa C pada posisi nukleotida Mutasi basa C (biru) menjadi basa (merah) pada posisi nukleotida dan mutasi basa C (biru) menjadi basa (merah) pada posisi nukleotida (Gambar IV.9) 36

13 G. Afrika G. Asia A A C C A C A C A C - C A C - C A C C A Gambar IV.10 Skema pola mutasi yang terjadi sepanjang 403 bp pada tiga urutan nukleotida gajah Sumatera terhadap gajah Asia, gajah Afrika dan. erjadi 7 mutasi secara umum yang ditandai dengan line 1 sampai 7. Mutasi yang terjadi dilihat secara vertikal. Pada gambar IV.10. jika dilihat pada lajur 2 dan 4 kita akan menemukan pola mutasi dimana untuk ketiga gajah Sumatera memiliki urutan nukleotida yang berbeda dengan spesies gajah lainnya. Hal ini mengindikasikan bahwa gajah Sumatera adalah individu tersediri yang beda dengan spesies atau bahkan subspesies lainnya. Namun jika dilihat pada lajur 1, 5, 6 dan 7 pola mutasi pada daerah ini memperjelas bahwa urutan nukleotida gajah Sumatera banyak kesamaan urutan nukleotida dengan gajah Asia hal ini mengindikasikan bahwa kekerabatan gajah Sumatera dan gajah India sangat dekat. Berbeda dengan pola mutasi pada lajur 1 dan 5 dimana pada urutan nukleotida gajah Afrika terjadi mutasi. Sementara urutan nukleotida gajah yang lainnya tidak terjadi mutasi hal ini diduga karena hubungan kekerabatan gajah Afrika dan spesies lain dalam penelitian ini cukup jauh. Sebaliknya dilajur yang sama dapat dilihat bahwa urutan nukleotida gajah Asia dan menunjukan kesamaan, hal ini mengindikasikan bahwa kekerabatan gajah Asia dan mammoth cukup dekat. 37

14 IV.7 Analisis Pohon Pilogenetik Data urutan nukleotida gajah Sumatera hasil sekuensing dianalisis menggunakan program komputer Megalign M versi dari DNAstar untuk melihat kekerabatan dengan pohon pilogenetik. Prinsip dari program ini adalah mengelompokan individu berdasarkan jumlah mutasi urutan nukleotida yang terjadi. G. Asia G. Sumatera G. Afrika Gambar IV.11 Pohon pilogenetik yang dianalisis menggunakan program Megalign M. Data yang dianalisis yaitu tiga sampel gajah Sumatera, gajah Asia, gajah Afrika,. Data yang dianalisis oleh program tersebut berdasarkan urutan nukleotida ketiga gajah Sumatera hasil sekuensing sebesar 403 pb dan ketiga data gajah lainnya dari database GenBank yaitu gajah Asia, gajah afrika dan. Urutan nukleotida gajah Asia (Elephas maximus indicus) diambil dari posisi nukloetida sampai dengan ukuran sebesar 1901 pb. Urutan nukleotida gajah Afrika (Loxodonta africana) diambil dari posisi nukleotida sampai

15 sebesar 1865 pb. Urutan nukleotida (Mammuthus primigenius) diambil sebesar 1769 pb dari posisi nukleotida sampai Data pohon pilogenetik memperkuat data sebelumnya bahwa gajah Sumatera sangat dekat kekerabatannya dengan gajah Asia yang diwakili oleh gajah India. Hal ini terjadi karena gajah Sumatera dan gajah India merupakan subspesies dari gajah Asia atau dengan kata lain merupakan satu spesies yang sama. Sementara untuk ternyata lebih dekat kekerabatannya dengan gajah Asia dibandingkan dengan gajah Afrika, hal ini mendukung dugaan penelitian sebelumnya bahwa Rekontruksi pilogenik Elephantinae clade yang dikerjakan menduga bahwa Mammuthus primigenius dan Elephas maximus adalah sister species yang menyimpang segera setelah nenek monyang mereka terpisah dari nenek moyang garis keturunan Loxodonta Africana [Rogaev et al., 2006]. Ini menunjukan bahwa gajah Asia dan merupakan satu nenek moyang sementara dengan gajah Afrika kekerabatannya cukup jauh. 39