KERAGAMAN GENETIK JATI RAKYAT DI JAWA BERDASARKAN PENANDA RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) AL-KHAIRI E

Transkripsi

1 KERAGAMAN GENETIK JATI RAKYAT DI JAWA BERDASARKAN PENANDA RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) AL-KHAIRI E PROGRAM STUDI BUDI DAYA HUTAN FAKULTAS KEHUTANAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008

2 KERAGAMAN GENETIK JATI RAKYAT DI JAWA BERDASARKAN PENANDA RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kehutanan Pada Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor AL-KHAIRI E PROGRAM STUDI BUDI DAYA HUTAN FAKULTAS KEHUTANAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008

3 RINGKASAN AL-KHAIRI (E ). Keragaman Genetik Jati Rakyat Di Jawa Berdasarkan Penanda Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Dibimbing oleh Iskandar Z. Siregar. Indonesia merupakan negara keempat terbesar dalam hal produksi kayu Jati setelah Burma, India, dan Thailand. Pertambahan jumlah penduduk di dunia, khususnya di Indonesia, membuat jumlah permintaan akan kayu Jati meningkat melebihi jumlah yang dapat diproduksi. Kebutuhan kayu Jati olahan untuk Indonesia, baik skala domestik maupun ekspor pada tahun 1999 sebesar 2,5 juta m 3 /tahun dan baru terpenuhi sebesar 0,8 juta m 3 /tahun. Saat ini, kesenjangan (gap) yang lebar antara permintaan dan persediaan kayu Jati dipenuhi oleh pihak-pihak yang tidak berwenang dengan cara yang mudah dan ilegal. Kontribusi sumber bahan baku resmi yang paling besar adalah hutan tanaman sebesar 60,46 %, Hak Pengusahaan Hutan sebesar 21,93 %, Izin Pemanfaatan Kayu 14,31%, Hutan Rakyat 1,68 %, impor 1,28 %, dan Perum Perhutani 0,34 %. Salah satu sumber bahan baku untuk industri kayu nasional adalah dari hutan rakyat. Hutan Jati Rakyat di Indonesia telah ada sejak tahun 2005 seluas ha dengan potensi mencapai m 3, dimana jumlah pohon mencapai batang (terdiri dari jumlah pohon siap tebang sebanyak batang dengan potensi produksi kayu minimal m 3 ). Potensi hutan Jati rakyat tersebut sebagian besar masih terkonsentrasi di Jawa, Sulawesi, Nusa Tenggara Barat, Bali dan Sumatra. Keberhasilan pengembangan hutan rakyat terutama ditentukan oleh pengelolaan sumberdaya genetik Jati dan tempat tumbuhnya. Oleh karena itu perlu dilakukan riset dan pengembangan pengetahuan pengelolaan serta peningkatan teknologi untuk program pemanfaatan sumberdaya genetik agar hutan Jati rakyat dapat berkembang dengan baik. Salah satu teknologi penanda genetik yang dapat digunakan untuk mengetahui status keragaman genetik adalah RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menduga keragaman genetik dan hubungan kekerabatan Jati rakyat (Tectona grandis Linn. f.) yang dikembangkan di tiga populasi yaitu Jawa Barat-Banten (Populasi 1), Jawa Timur (Populasi 2) dan Jawa Tengah (Populasi 3). Penelitian dilakukan di dua tempat, pertama tempat pengambilan sampel daun Jati (Tectona grandis Linn. f.) dari tiga populasi yaitu Jawa Barat-Banten (Rangkasbitung, Bogor), Jawa Timur (Ngawi, Bojonegoro, Kebonharjo) dan Jawa Tengah (Cepu, Kendal, Randublatung). Kedua, tempat penelitian elektroforesis dan analisis ADN dilakukan di Laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari Juli 2007.

4 Dari penelitian untuk Jati Rakyat dengan teknik RAPD diperoleh satu primer dari 4 primer yang diseleksi. Primer yang digunakan untuk metode RAPD tersebut adalah OPO10, OPO11, OPO12 dan OPY11. Dari empat primer tersebut yang dipilih adalah primer OPO12, karena teramplifikasi dengan baik dibandingkan dengan tiga primer yang lainnya. Urutan basa primer OPO12 adalah 5' CAGTGCTGTG '3 dengan 11 lokus polimorfik. Untuk ukuran fragmen berkisar antara 100 bp-2642 bp. Dengan teknik tersebut diperoleh hasil sebagai berikut: populasi Jati Rakyat Jawa Tengah (Populasi 3) memiliki nilai rata-rata na = , ne = , PLP = % dan H e = , nilai ini merupakan nilai yang paling besar diantara 2 populasi yang lain. Sedangkan populasi Jati Rakyat Jawa Barat-Banten (Populasi 1) memiliki nilai rata-rata na, ne, PLP dan H e yang paling kecil (na = , ne = , PLP = % dan H e = ). Pada variasi genetik antar populasi dapat dilihat bahwa populasi Jati Rakyat Jawa Tengah (Populasi 3) berada pada satu klaster pertama dengan Jati Rakyat Jawa Timur (Populasi 2). Sedangkan klaster selanjutnya bergabung dengan Jati Rakyat Jawa Barat- Banten (Populasi 1). Dari hasil analisis gerombol tersebut menunjukkan bahwa jarak genetik terdekat adalah antara populasi Jati Rakyat Jawa Tengah (Populasi 3) dengan Jati Rakyat Jawa Timur (Populasi 2) yaitu (Lampiran 4). Data ini menunjukkan bahwa populasi Jati Rakyat Jawa Tengah (Populasi 3) dan populasi Jati Rakyat Jawa Timur (Populasi 2) memiliki struktur genetik yang mirip (kekerabatan yang dekat). Jarak genetik terdekat antara populasi adalah Jati Ngawi (Jatim) dengan populasi Jati Kebonharjo (Jatim) yaitu Data ini menunjukkan bahwa populasi Jati Ngawi (Jatim) dan populasi Jati Kebonharjo (Jatim) memiliki struktur genetik yang mirip (kekerabatan yang dekat). Dari dendrogram tersebut dapat juga dilihat bahwa populasi Jati Rangkasbitung (Jabar-Banten) dan populasi Jati Bogor (Jabar-Banten) membentuk satu kelompok (klaster). Berdasarkan penelitian tersebut, dapat disimpulkan bahwa hasil analisis keragaman genetik dengan teknik RAPD yang diterapkan pada tanaman Jati Rakyat (Tectona grandis Linn. f.) menunjukkan bahwa Jati Rakyat Jawa Tengah (Populasi 3) memiliki nilai ratarata na = , ne = , PLP = 90.91% dan H e = , nilai ini merupakan nilai yang paling besar diantara 2 populasi lainya. Populasi Jati Rakyat Jawa Timur (Populasi 2) memiliki nilai rata-rata na, ne, PLP dan H e (na = , ne = , PLP = 90.91% dan H e = ), sedangkan populasi Jati Rakyat Jawa Barat-Banten (Populasi 1) memiliki nilai rata-rata na, ne, PLP dan H e yang paling kecil (na = , ne = , PLP = 63.64% dan H e = ). Berdasarkan analisis gerombol, jarak genetik terdekat adalah antara Propinsi Jati Rakyat Jawa Tengah (Populasi 3) dengan Jati Rakyat Jawa Timur (Populasi 2) yaitu , sedangkan Jarak genetik terdekat antar populasi adalah populasi Jati Ngawi (Jatim) dengan populasi Jati Kebonharjo (Jatim) yaitu Data ini menunjukkan bahwa populasi Jati Ngawi (Jatim) dan populasi Jati Kebonharjo (Jatim) memiliki struktur genetik yang mirip (kekerabatan yang dekat). Sedangkan populasi yang memisah dan menunjukkan hubungan kekerabatan terjauh dengan populasi-populasi lainnya adalah Jati rakyat dari Randublatung.

5 Lembar Pengesahan Judul : KERAGAMAN GENETIK JATI RAKYAT DI JAWA BERDASARKAN PENANDA RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD) Nama NRP : Al-khairi : E Menyetujui, Pembimbing (Dr. Ir. Iskandar Z. Siregar, M.For.Sc) NIP Mengetahui, Dekan Fakultas Kehutanan IPB, (Dr. Ir. Hendrayanto, M.Agr) NIP Tanggal :...

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pekan Baru tanggal 9 Juni 1984 dari Ayah bernama H. Abdullah Efendy dan Ibu Hj. Nurdianis H.N. Penulis merupakan anak bungsu dari delapan bersaudara. Pada tahun 1990 penulis masuk di Sekolah Dasar Negeri 005 Lubuk Bendahara, kemudian pada tahun 1996 penulis melanjutkan pendidikan di MTS Darul-Fallah Labuhan Batu, Rantau Prapat, sampai dengan tahun Setelah itu penulis melanjutkan pendidikan di SMU Negeri 3 Plus YPMhb Sumut sampai tahun Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan penulis memilih Program Studi Budidaya Hutan, Departemen Manajemen Hutan, Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor. Selama perkuliahan, penulis mengikuti Praktek Pengenalan dan Pengelolaan Hutan (P3H) di Getas. Sedangkan Praktek Umum Kehutanan (PUK) dilaksanakan di BKPH Rawa Timur, BKPH Gunung Slamet, KPH Banyumas Timur. Praktek Umum Pengelolaan Hutan (PUPH) di kampus praktek lapang Universitas Gadjah Mada Getas, Jawa Timur. Kemudian Pada bulan Februari-April 2006 penulis mengikuti Kuliah Kerja Nyata di Desa Cikarawang, Kecamatan Dramaga, Kotamadya Bogor.

7 KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia dan rahmat-nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kehutanan di Institut Pertanian Bogor. Dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2007 penulis memilih judul "Keragaman Genetik Jati Rakyat Di Jawa Berdasarkan Penanda Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)". Penelitian ini berisikan kajian keragaman genetik dan hubungan kekerabatan Jati rakyat (Tectona grandis Linn. f.) yang dikembangkan di beberapa propinsi di Pulau Jawa yaitu Jawa Barat-Banten (Populasi 1), Jawa Timur (Populasi 2) dan Jawa Tengah (Populasi 3). Dengan penuh kerendahan hati penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Ayah, Bunda, dan seluruh keluarga besar atas semua dukungan dan do anya 2. Bapak Dr. Ir. Iskandar Z. Siregar, M.For.Sc selaku dosen pembimbing atas segala bantuan dan bimbingannya 3. Bapak Dr. Ir. Agus Hikmat, M.Sc selaku dosen penguji 4. Ibu Istie Sekartining Rahayu, S.Hut, M.si selaku dosen penguji 5. Tedi Yunanto, S.Hut atas semua bantuan dan ilmunya 6. Teman-teman BDH 39 atas bantuan dan dukungannya Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat khususnya bagi pembangunan hutan di Indonesia. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran untuk penyempurnaannya. Bogor, Maret 2008 Penulis

8 i DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI... i DAFTAR TABEL... iii DAFTAR GAMBAR... iv DAFTAR LAMPIRAN... v BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Tujuan Hipotesis Manfaat Penelitian... 3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Jati (Tectona grandis Linn. f.) Taksonomi dan tata nama Penyebaran dan habitat Pemanfaatan Ciri-ciri morfologi Prinsip-prinsip Genetika Asam Deoksiribonukleat (ADN) Keragaman Genetik Jati (Tectona grandis Linn. f.) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Alat dan Bahan Bahan tanaman Alat-alat Penelitian Metode Penelitian Ekstraksi ADN Seleksi primer PCR (Polymerase Chain Reaction... 23

9 ii 3.4. Analisis Data BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Ekstraksi ADN dan PCR Ekstraksi ADN Pengujian Primer Seleksi primer dengan metode PCR Hasil RAPD Interpretasi dan Analisis Data Variasi genetik antar propinsi BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 38

10 iii DAFTAR TABEL No. Teks Halaman 1. Lokasi pengambilan sampel Jati Rakyat (Tectona grandis Linn. f.) Bahan-bahan Ekstraksi ADN dan RAPD Alat-alat Ekstraksi ADN, RAPD dan Analisis Data Komposisi bahan untuk ekstraksi ADN Urutan basa nukleotida 35 primer (Operon Technology) Komposisi bahan untuk reaksi PCR Tahapan-tahapan dalam proses PCR untuk teknik RAPD Pengukuran variasi genetik antar propinsi (Nei s 1972)... 30

11 iv DAFTAR GAMBAR No. Teks Halaman 1. Pohon Jati Daun, Bunga dan Buah Tectona grandis Linn. f ADN dapat ditemukan pada inti sel, kloroplasma dan mitokondria Tahapan-tahapan pada proses PCR (Polymerase Chain Reaction) Daun Jati (Tectona grandis Linn. f.) Foto alat-alat penelitian Bagan prosedur penelitian Cara penilaian pita dengan sistem skoring Hasil ekstraksi ADN Foto hasil seleksi primer pada ADN daun Jati Hasil PCR dengan primer OPO Dendrogram jarak genetik Jati Rakyat antar propinsi Dendrogram jarak genetik Jati Rakyat antar populasi... 32

12 v DAFTAR LAMPIRAN No. Teks Halaman 1. Tabel hasil skoring Analisis genetik dengan POPGENE Jarak genetik Jati rakyat antar populasi Jarak genetik Jati rakyat antar propinsi... 42

13 BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Jati (Tectona grandis Linn. f.) merupakan salah satu jenis kayu komersial yang memiliki nilai ekonomis tinggi dan diminati oleh banyak orang, baik dalam maupun luar negeri. Hingga saat ini, Jati masih menjadi komoditas mewah dikarenakan kualitasnya yang tinggi, walaupun harga belinya mahal. Harga jual yang mahal di pasar internasional (US$ 640/m 3 untuk kayu papan Jati Jawa tahun 1989), menyebabkan kayu Jati lebih diutamakan sebagai kayu mewah (Palupi, 2006). Indonesia merupakan negara keempat terbesar dalam penyediaan kayu Jati setelah Burma, India, dan Thailand, dengan jumlah produksi per tahun sekitar m 3 selama kurun waktu Pada tahun 1989, Indonesia mampu mengekspor kayu papan Jati sebesar m 3 dengan nilai US$ 29,4 juta dan sejak tahun 1990, jumlah kayu papan Jati yang diekspor dikurangi untuk dapat memenuhi permintaan industri furnitur dalam negeri (Dephut, 2002). Pertambahan jumlah penduduk dunia, khususnya Indonesia, membuat jumlah permintaan akan kayu Jati meningkat. Kebutuhan kayu Jati olahan untuk Indonesia, baik skala domestik maupun ekspor pada tahun 1999 sebesar 2,5 juta m 3 /tahun dan baru terpenuhi sebesar 0,8 juta m 3 /tahun (Leksono 2001 dalam Siregar 2005). Dewasa ini, kesenjangan (gap) yang lebar antara permintaan dan persediaan kayu Jati dipenuhi oleh pihak-pihak yang tidak berwenang dengan cara yang mudah dan ilegal. Menurut Murthy (1992), kesenjangan yang lebar antara permintaan dan produksi kayu Jati hanya bisa dipenuhi dengan meningkatkan produksi dan menciptakan hutan yang lestari dengan cara memperkenalkan jenisjenis yang cepat tumbuh (fast-growing species) dan memiliki hasil yang tinggi (high-yielding species), mengurangi panjangnya daur, dan menerapkan strategi genetik dan pemuliaan pohon seperti breeding dan bioteknologi. Selama ini industri kayu secara umum masih banyak menyerap kayu dari sumber lain karena jatah produksi tebangan yang diberikan tidak mencukupi. Hal ini mengakibatkan praktek illegal logging yang marak terjadi tahun 2003 yang kemudian berangsur-angsur hilang seiring dengan digelarnya Operasi Hutan

14 2 Lestari 2005 oleh Dephut. Kontribusi sumber bahan baku resmi yang paling besar adalah hutan tanaman sebesar 60,46 %, Hak Pengusahaan Hutan sebesar 21,93 %, Izin Pemanfaatan Kayu 14,31%, Hutan Rakyat 1,68 %, impor 1,28 %, dan Perum Perhutani 0,34 %. Dengan demikian apabila dilihat berdasarkan lokasinya, Sumatera dan Kalimantan tetap merupakan sentra produksi bahan baku dan industri kayu nasional (Dephut, 2002). Berdasarkan pernyataan di atas, salah satu sumber bahan baku andalan untuk industri kayu nasional adalah hutan rakyat. Dan salah satu jenis pohon yang dikembangkan pada hutan rakyat adalah Jati. Potensi hutan Jati rakyat di Indonesia telah ada sejak awal tahun 2005 seluas ha dengan potensi mencapai m 3, (jumlah pohon mencapai batang, dan yang siap tebang sebanyak batang dengan potensi produksi kayu minimal m 3 ). Potensi hutan Jati rakyat tersebut sebagian besar masih terkonsentrasi di Jawa, Sulawesi, Nusa Tenggara Barat, Bali dan Sumatra (Effendi, 2005). Pasar kayu Jati dunia meliputi jangkauan yang luas untuk pasar kayu Jati mentah, kayu untuk bahan baku industri dan pulp, serta pasar untuk produk kerajinan. Pasar produk kerajinan dari kayu Jati sangat membutuhkan pasokan kayu Jati yang besar. Bahkan Asosiasi Kerajinan Kayu seperti Asosiasi Industri Meubel dan Kerajinan Indonesia menjanjikan memberikan sertifikasi produk kayu Jati rakyat yang memasok kebutuhan kayu mereka untuk produk kerajinan (Away, 2001). Adanya potensi besar industri yang mampu menyerap Jati rakyat dan dukungan regulasi insentif dari pemerintah, maka masa depan pengembangan hutan Jati rakyat menjadi lebih baik, sehingga memiliki keuntungan ganda baik dari sisi finansial ekonomis maupun dari sisi kesejahteraan rakyat di sekitar hutan. Namun kemampuan riset petani Indonesia masih rendah, sehingga pemerintah harus terus mengembangkan strategi yang lebih komprehensif untuk meningkatkan produk hasil pengembangan hutan Jati rakyat. Keberhasilan pengembangan hutan Jati Rakyat terutama ditentukan oleh pengelolaan dan pemanfaatan sumberdaya genetik Jati dan tempat tumbuhnya. Oleh karena itu perlu dilakukan riset dan pengembangan pengetahuan pengelolaan serta

15 3 peningkatan teknologi untuk program konservasi genetik dan pemuliaan agar hutan Jati rakyat dapat berkembang dengan baik. Salah satu dasar yang dibutuhkan untuk melakukan program konservasi genetik dan pemuliaan adalah data mengenai struktur genetik (sifat genotipe) jenis tanaman tersebut. Dan metode yang dapat dilakukan untuk penelusuran sifat tanaman dari segi genotipenya adalah metode isozim dan ADN. Namun teknik isozim memiliki kelemahan yaitu sulit untuk mendeteksi keragaman genetik diantara gen-gen yang memiliki hubungan dekat. Salah satu metode untuk analisis ADN adalah dengan menggunakan metode Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). RAPD adalah metode untuk mendeteksi dengan cepat genom yang polimorfik. RAPD adalah modifikasi dari PCR yang dikembangkan pada tahun 1990 oleh J. Williams (Williams et al dalam Kaidah 1999). 1.2 Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman genetik dan hubungan kekerabatan Jati rakyat (Tectona grandis Linn. f.) yang dikembangkan di beberapa propinsi di Pulau Jawa. 1.3 Hipotesis Hipotesis yang diuji adalah adanya keragaman genetik dan hubungan kekerabatan Jati rakyat (Tectona grandis Linn. f.) di beberapa populasi yang diteliti di Pulau Jawa. 1.4 Manfaat Penelitian Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah memberikan informasi dasar tentang keragaman genetik Jati rakyat (Tectona grandis Linn. f.) yang terdapat di Pulau Jawa untuk program konservasi genetik dan pemuliaan masa datang.

16 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Jati (Tectona grandis Linn. f.) Taksonomi dan tata nama Jati merupakan salah satu jenis pohon besar yang menggugurkan daun pada saat musim kemarau. Pada kondisi lingkungan yang baik, Jati dapat tumbuh mencapai tinggi m. Pohon Jati memiliki kulit batang tebal, abu-abu atau coklat muda keabu-abuan (Gambar 1). Jati adalah sejenis pohon penghasil kayu bermutu tinggi yang dikenal dunia dengan nama teak (bahasa Inggris). Nama ini berasal dari kata thekku, dalam bahasa Malayalam, bahasa di negara bagian Kerala di India selatan. Nama ilmiah Jati adalah Tectona grandis Linn.f. Dalam sistem klasifikasi tumbuhan, tanaman Jati mempunyai penggolongan sebagai berikut: Divisi : Spermatophyta Kelas : Angiospermae Sub-kelas : Dicotyledoneae Ordo : Verbenales Famili : Verbenaceae Genus : Tectona Spesies : Tectona grandis Linn. f. Gambar 1 Pohon Jati

17 5 Selain jenis Tectona grandis Linn. f, famili Verbenaceae juga memiliki 2 jenis lain yang mirip Jati di Indonesia, yaitu Tectona hamiltoniana Wall. yang tumbuh di daerah kering Myanmar dan Tectona philippinensis Benth & Hooker yang tumbuh di hutan Batangas dan Mindoro (Pulau Iling), Filipina. Dari ketiga jenis Tectona tersebut, Tectona grandis-lah yang mempunyai kualitas paling baik (Sumarna, 2001). Selain itu, ada jenis-jenis pohon atau tumbuhan lain yang dinamai Jati meski tidak berkerabat, yaitu Jati sabrang, Jati putih, dan Jati pasir Penyebaran dan habitat Jati secara alami menyebar di India, Myanmar, Thailand dan bagian barat Laos sampai ke Jawa. Jati menyebar pada garis lintang 90 o LU di India sampai garis lintang 25 o LU di Myanmar dan tersebar antara garis bujur 70 o -100 o BT. Hutan Jati biasanya terpisah oleh pegunungan, tanah-tanah datar, tanah-tanah pertanian dan tipe hutan lainnya. Di Indonesia, Jati bukan tanaman asli, akan tetapi ditanam sejak beberapa abad lalu di Pulau Kangean, Muna, Sumbawa dan Jawa oleh pemerintah Belanda yang dibawa dari India (Departemen Kehutanan, 2002). Jati tumbuh di hutan-hutan gugur yang menggugurkan daun di musim kemarau. Iklim yang cocok adalah yang memiliki musim kering yang nyata, namun tidak terlalu panjang, dengan curah hujan antara mm/tahun dan dengan intensitas cahaya yang cukup tinggi sepanjang tahun. Ketinggian tempat yang optimal adalah antara m dpl, meski Jati bisa tumbuh hingga 1300 m dpl. Tanah yang sesuai adalah yang agak basa, dengan ph antara 6 8, sarang (memiliki aerasi yang baik), mengandung cukup banyak kapur (Ca, calcium) dan fosfor (P). Jati tidak tahan tergenang air. Pada masa lalu, Jati sempat dianggap sebagai jenis asing yang dimasukkan (diintroduksi) ke Jawa, ditanam oleh orang Hindu ribuan tahun yang lalu. Namun pengujian variasi isozyme yang dilakukan oleh Kertadikara (1994) menunjukkan bahwa Jati di Jawa telah berevolusi sejak puluhan hingga ratusan ribu tahun yang silam (Mahfudz et al. 2004). Karena nilai kayunya, Jati kini juga dikembangkan di luar daerah penyebaran alaminya. Di Afrika tropis, Amerika tengah, Australia, New Zealand,

18 6 Pasifik dan Taiwan. Di Indonesia sendiri, selain di Jawa dan Muna, Jati juga dikembangkan di Bali dan Nusa Tenggara. Di hutan Ngawi dan Muna, Jati tumbuh sempurna di lahan-lahan berkapur. Terdapat sekurang-kurangnya kayu Jati log dengan volume sebesar 8,6 ribu m 3 pada 2001, dan setahun kemudian meningkat menjadi 12,2 ribu, lalu menjadi 5,9 ribu pada 2003, dan meningkat lagi menjadi 21,1 ribu m 3 pada 2004 (Aminuddin, 2006). Jati di Muna biasa disebut kulidawa yang artinya Jati yang asalnya dari Jawa. Benih Jati tersebut dibawa oleh Paelangkuta, ketika kapitalao (panglima perang) itu pulang dari membantu rakyat Jepara berperang melawan Inggris. Orang Muna menyebut Jati mereka sebagai Jati Muna (Kompas, 2006). Jati sejak lama digunakan sebagai bahan baku pembuatan kapal laut, termasuk kapal-kapal VOC yang melayari samudera pada abad ke Pemanfaatan Kayu Jati mengandung semacam minyak dan endapan di dalam sel-sel kayunya, sehingga dapat awet digunakan di tempat terbuka meski tanpa divernis. Untuk interior, selain dimanfaatkan sebagai bahan baku furnitur, kayu Jati juga digunakan dalam struktur bangunan seperti rumah-rumah tradisional di Jawa dimana semua bagian tiang-tiangnya, rangka atap, hingga ke dinding-dinding berukir menggunakan kayu Jati. Industri kayu saat ini mengolah kayu Jati menjadi venir (veneer) untuk melapisi wajah kayu lapis yang mahal, serta dijadikan keping-keping parket (parquet) penutup lantai. Selain itu juga Jati diekspor ke mancanegara dalam bentuk exterior. Ranting-ranting Jati yang tak lagi dapat dimanfaatkan untuk meubel, dapat dimanfaatkan sebagai kayu bakar kelas satu. Kayu Jati mampu menghasilkan panas yang tinggi, sehingga dulu banyak digunakan sebagai bahan bakar lokomotif uap. Jati dikenal luas sebagai jenis tanaman yang terdapat pada tapak beriklim tropik. Jati juga sering dijumpai sebagai tanaman pokok pada sistem agroforestry. Jati merupakan kayu serbaguna yang digunakan sebagai konstruksi ringan dan berat, bahan bangunan rumah, kayu pertukangan, ukiran dan lain-lain

19 7 (Departemen Kehutanan, 2002). Sebagian besar kebutuhan kayu Jati dunia dipasok oleh Indonesia dan Myanmar Ciri-ciri morfologi Jati merupakan pohon besar dengan batang yang bulat lurus dengan tinggi total mencapai 40 m. Jati memiliki tinggi batang bebas cabang (clear pole) yang dapat mencapai m. Pada hutan-hutan alam yang tidak terkelola ada pula pohon Jati yang berbatang bengkok-bengkok. Sementara varian Jati blimbing memiliki batang yang berlekuk atau beralur dalam, dan Jati pring (bambu) nampak seolah berbuku-buku seperti bambu. Kulit batang coklat kuning keabuabuan, terpecah-pecah dangkal dalam alur memanjang batang. Jati memiliki daun yang besar, berbentuk bulat telur terbalik dan berhadapan dengan tangkai yang sangat pendek. Daun pada anakan pohon berukuran besar sekitar cm cm, sedangkan pada pohon tua menyusut menjadi sekitar cm, berbulu halus dan mempunyai rambut kelenjar di permukaan bawahnya. Daun yang muda berwarna kemerahan dan mengeluarkan getah berwarna merah darah apabila diremas (Gambar 2). Ranting yang muda berpenampang segi empat dan berbonggol di buku-bukunya. Jati memiliki tipe bunga majemuk yang terletak dalam malai besar berukuran 40 cm 40 cm atau lebih besar dan berisi ratusan kuntum bunga yang tersusun dalam anak payung menggarpu dan terletak di ujung ranting yang jauh di puncak tajuk pohon. Tajuk mahkota berjumlah 6 7 buah dan berwarna keputihputihan dengan ukuran 8 mm serta merupakan tipe bunga berumah satu. Ukuran bunga kecil dengan diameter 6 8 mm, berwarna keputih-putihan dan berkelamin ganda yang terdiri dari benang sari dan putik yang terangkai dalam tandan besar. Jumlah kuncup bunga sekitar per tandan, bunga mekar dalam waktu 2 4 minggu (Departemen Kehutanan, 2002). Buah berbentuk bulat agak gepeng berukuran 0,5 2,5 cm dan memiliki rambut kasar dengan inti yang tebal. Biasanya berbiji 2 4, tetapi umumnya hanya satu yang tumbuh. Buah tersungkup oleh perbesaran kelopak bunga yang menggelembung menyerupai balon kecil.

20 8 Gambar 2 Daun, Bunga dan Buah Tectona grandis Linn. f (Wikipedia Indonesia, 2006) Kayu teras Jati berwarna coklat muda, coklat kelabu hingga coklat merah tua. Kayu gubal di bagian luar berwarna putih dan kelabu kekuningan. Pola-pola lingkaran tahun pada kayu teras nampak jelas, sehingga menghasilkan gambaran yang indah. 2.2 Prinsip-prinip genetika Asam Deoksiribonukleat (ADN) Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan ADN, adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Menurut Finkeldey (2005) ADN adalah makromolekul untuk menyimpan informasi genetik. Sedangkan menurut Suryo (1986) ADN merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk hidup dalam keseluruhannya dari suatu generasi ke generasi berikutnya. ADN dapat dijumpai dalam inti sel dan beberapa pada organel lainnya. Pada tumbuhan tingkat tinggi ADN dijumpai hanya sebatas pada inti sel, mitokondria dan kloroplasma (Gambar 3). Biasanya ada perbedaan cara penurunan antara informasi genetik yang disimpan dalam inti sel dengan

21 9 informasi genetik yang disimpan dalam plastid (mitokondria dan kloroplasma). Informasi genetik pada inti sel diturunkan melalui satu induk jantan dan satu induk betina atau penurunan secara biparental. Sedangkan material genetik yang dianalisis dari plastida biasanya hanya berasal dari sifat satu tetuanya kalau tidak dari jantan atau dari betinanya saja atau disebut dengan penurunan secara uniparental. Pada kebanyakan angiospermae, ADN mitokondria biasanya diturunkan hanya melalui induk betina atau penurunan maternal. ADN kloroplasma pada konifer biasanya diturunkan malalui serbuk sari atau secara parental. ADN secara ekslusif terletak dalam kromosom. Kromosom adalah bahan dasar berupa benang-benang halus (kromonema) dan kromosom merupakan pembawa keturunan. Secara kimiawi kromosom terdiri dari ADN, ARN, protein histon dan protein non-histon, bahan-bahan tersebut disebut kromatin karena mempunyai daya serap pada zat pewarna tertentu. Jumlah suatu ADN dapat diukur dengan jumlah pewarna fuelgen. ADN terletak pada seluruh inti sel, sedangkan ARN terletak pada inti sel dan sitoplasma. Gambar 3 ADN dapat ditemukan pada inti sel, kloroplasma dan mitokondria (Anonim, 2006) ADN merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa nitrogen. Sebuah unit monomer ADN yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehingga ADN tergolong sebagai polinukleotida.

22 10 Rangka utama untai ADN terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselangseling. Gula pada ADN adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2- deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. ADN terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai ADN satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks ganda ADN disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada ADN adalah Adenin (dilambangkan A), Sitosin (C, dari cytosine), Guanin (G), dan Timin (T). Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan sitosin. 2.3 Keragaman genetik Jati Menurut Soerjanegara dan Djamhuri (1979) menyebutkan bahwa didalam satu pohon akan terdapat beberapa keragaman yaitu keragaman geografis (antar provenan), keragaman lokal (antar tempat tumbuh) dan keragaman dalam pohon serta keragaman antar pohon. Keragaman tersebut disebabkan oleh dua faktor yaitu faktor lingkungan dan faktor genetik. Keragaman lingkungan biasanya disebabkan oleh keadaan tempat tumbuh, sifat tanah, atau jarak tanam. Keragaman yang dipengaruhi oleh perbedaan genetik merupakan yang tidak dapat diterangkan dengan perbedaan tempat tumbuh, misalnya perbedaan bentuk batang, tebal batang, tebal cabang dan berat jenis kayu dari pohon-pohon dalam suatu tegakan yang diturunkan tetua kepada anaknya (keragaman genetik). Keragaman suatu jenis perlu diketahui untuk dilakukan pemuliaan pohon. Keragaman genetik disebabkan oleh perubahan pada struktur genetik dari suatu populasi. Menurut Finkeldey (2005), perubahan struktur genetik suatu populasi disebabkan oleh mutasi, aliran gen dan migrasi, penghanyutan genetik, seleksi dan juga sistem perkawinan.

23 11 Jati menunjukkan karakter yang bervariasi dalam populasi maupun antar populasi. Berdasarkan penampakan luarnya terdapat beberapa perbedaan morfologi bentuk pohon, batang, dan sifat kayu. Di Jawa terdapat beberapa jenis Jati menurut sifat kayunya yaitu Jati lengo atau Jati malam memiliki kayu yang keras, berat, terasa halus bila diraba dan seperti mengandung minyak, berwarna gelap, banyak bercak dan bergaris. Jati sungu berwarna hitam, padat, dan keras, sedangkan Jati werut memiliki kayu yang keras dan serat yang berombak. Jati doreng berkayu sangat keras dengan warna loreng-loreng hitam menyala, sangat indah, sedangkan pada Jati kembang dan Jati kapur kayunya berwarna keputihputihan karena mengandung banyak kapur, kurang kuat dan kurang awet. Menurut batangnya, Jati dibedakan menjadi Jati ri (knobel), Jati pring, Jati gembol, dan Jati kijong. Jati gembol ini memiliki tumor pada batangnya di bagian bawah karena terinfeksi bakteri tanah. Berdasarkan penampakan bentuk batangnya Jati dibedakan menjadi Jati belimbing, Jati knobel, Jati boleng, dan Jati mulus (Mahfudz et al. 2004). Selain di Jawa, Jati juga memiliki penyebaran di Muna. Jati Muna terkenal memiliki keunggulan tersendiri dibanding Jati di daerah lain. Balai Penelitian Kehutanan Sulawesi di Makasar menyebutkan bahwa kayu Jati Muna memiliki empat keunggulan, yang meliputi kekuatan, kerapatan, kekerasan, serta fisik kimia (Aminuddin, 2006). 2.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD merupakan salah satu jenis penanda molekular yang banyak dipakai dalam penelitian dan diagnostik biologi molekular. Sebagai salah satu penanda genetik, RAPD dikenal sebagai penanda yang relatif murah dan tidak memerlukan keterampilan teknis yang tinggi. Penanda ini bersifat dominan, dalam arti, ia dapat membedakan kelas genotipe resesif dari kelas-kelas genotipe yang lain. RAPD memerlukan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dan elektroforesis gel dalam penerapannya. Kelemahan RAPD yang sangat dikenal adalah mudah memberikan hasil yang berbeda-beda apabila diulang, sehingga dianggap kurang reliable, khususnya bagi keperluan diagnostik, seperti sidik jari ADN.

24 12 Metode RAPD dapat mengamplifikasi ADN genomik pada daerah intron maupun ekson. Amplifikasi ADN genom dengan menggunakan primer tunggal acak umumnya menghasilkan beragam produk amplifikasi, sesuai dengan daerah genom yang dapat dikenali oleh primer. Masalah yang dihadapi dalam menganalisis larik-larik RAPD adalah ketika mengintepretasi larik. Larik yang berukuran molekul sama pada gel dapat berupa produk amplifikasi yang berbeda karena visualisasi dengan cara elektroforesis hanya mengetahui ADN secara kuantitas, tidak secara kualitas. RAPD memerlukan pasangan primer dan setiap pasangan primer akan menghasilkan sejumlah pita (band) yang akan tampak pada hasil elektroforesis gel. Pasangan primer yang dipilih (bisa sudah diketahui atau dipilih beberapa secara acak) diberikan pada sampel-sampel ADN (disebut ADN cetakan) yang sudah dipersiapkan. Pada saat proses PCR, primer akan menempel pada urutanurutan basa yang komplemen pada ADN cetakan. Diakhir proses PCR akan terdapat sejumlah besar fragmen-fragmen pendek ADN hasil amplifikasi. Apabila terdapat delesi untuk suatu lokasi cetakan, maka akan terjadi polimorfisme. Dengan elektroforesis gel, akan terlihat pita yang terputus-putus apabila terdapat polimorfisme (oleh karena itu bersifat dominan). Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut ''fase diam'' dan ''fase bergerak'' (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung preparat elektroforesis gel. Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut ''well'') pada sisi elektroda negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan ukuran objek. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek berukuran lebih besar akan lebih lambat berpindah. Pertama kali teknik RAPD dilakukan oleh Williams et al. (1990) dalam Septimayani (2002). Williams et al. berhasil mengamplifikasi ADN dan bersifat polimorfik dengan menggunakan primer acak serta bantuan enzim Taq ADN

25 13 polymerase. RAPD banyak digunakan karena mempunyai beberapa keuntungan. Menurut Williams et al. (1990) dalam Septimayani (2002), metode RAPD lebih sederhana, cepat, ADN yang diperlukan sedikit dan tidak perlu terlalu murni, tidak menggunakan satu primer. Secara umum analisis RAPD terdiri dari empat tahap, yaitu (1) tahap ekstraksi ADN, (2) tahap pengujian kualitas dan kuantitas ekstraksi ADN, (3) tahap amplifikasi ADN (RAPD), dan (4) tahap pengujian kualitas dan kuantitas hasil amplifikasi. Menurut Sambrook (1989), daun yang masih muda dengan berat 0,2-0,3 g cukup untuk menghasilkan ADN yang sesuai dengan kebutuhan selama analisis, sementara itu menurut Kaidah (1999) dari jaringan tanaman dewasa dan daun kering masih bisa didapatkan ekstrak ADN-nya. Menurut Kimball (1992), sel berkembang dengan cara menggandakan diri dan memperbesar volume sel. Oleh karena itu semakin muda suatu jaringan daun akan memberikan peluang yang lebih besar dalam menghasilkan ADN dalam jumlah yang lebih besar daripada daun yang sudah lebih tua umurnya. Proses amplifikasi ADN (RAPD), pada intinya adalah proses perbanyakan ADN secara enzimatis. Pada tahap ini terdapat tiga proses, yaitu (1) proses denaturasi ADN pada suhu 95 0 C, (2) proses penempelan ADN (annealing) dan (3) proses ekstensi (Gambar 4). Paling penting dari proses PCR (adalah kesterilannya, karena PCR ini sangatlah rentan jika adanya kontaminasi. Walaupun terdapat kontaminasi yang sangat kecil, baik pada ADN maupun bahan-bahan PCR, maka hasilnya akan berbeda dari yang seharusnya (false result) (Binder, 1997). Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

26 14 Gambar 4 Tahapan-tahapan pada proses PCR (Polymerase Chain Reaction) (Wikipedia, 2006) 1. Tahap denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, C) ikatan hidrogen ADN terputus (denaturasi) dan ADN menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas ADN terpisah. Pemisahan ini menyebabkan ADN tidak stabil dan siap menjadi template ("cetakan") bagi primer. Durasi tahap ini berlangsung antara 1 2 menit. 2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian cetakan ADN yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1 2 menit. 3. Tahap pemanjangan atau elongasi atau ektensi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis ADN-polimerase (P pada Gambar 4) yang dipakai. Dengan Taq-polymerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Tahap 4 pada Gambar 4 menunjukkan perkembangan yang terjadi pada siklus-siklus selanjutnya. Akibat

27 15 denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi tempat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas ADN yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah ADN yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial. Menurut Bernard (1998) PCR merupakan suatu teknik untuk memperbanyak potongan ADN spesifik. Ada 4 komponen utama yang dibutuhkan untuk melakukan proses PCR yaitu, 1). ADN target, 2). Primer, 3). ADN polymerase dan 4). 4 dntp. Prinsip proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek (30-60 detik) dengan tiga perubahan suhu yang berubah secara cepat. Tahap terakhir dari RAPD adalah pengujian kuantitas ADN hasil amplifikasi. Pada tahap ini terjadi pemisahan pita-pita ADN berdasarkan perbedaan berat molekulnya. Pita ADN yang mempunyai berat molekul lebih ringan jalan lebih cepat. Keragaman antara populasi dapat dilihat dengan melihat perbedaan pola pita (polymorphic) ADN antar populasi.

28 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Tempat pengambilan contoh daun populasi Jati Rakyat (Tectona grandis Linn. f.) dilakukan di 3 populasi yaitu Jawa Barat-Banten (Populasi 1), Jawa Timur (Populasi 2) dan Jawa Tengah (Populasi 3) (Tabel 1). Analisis ADN dilaksanakan di Ruang Analisis Genetika, Laboratorium Silvikultur, Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor yang dimulai dari Februari sampai Juli Alat dan Bahan Bahan tanaman Bahan yang digunakan untuk penelitian adalah daun Jati dari hutan rakyat (Tectona grandis Linn. f) (Gambar 5). Sedangkan bahan-bahan yang digunakan untuk proses ekstraksi ADN dari daun dan proses amplifikasi ADN dengan teknik RAPD disajikan pada Tabel 2. Gambar 5 Daun Jati (Tectona grandis Linn. f)

29 17 Tabel 1 Lokasi pengambilan daun Jati (Tectona grandis Linn. f) dari hutan rakyat di 3 populasi di Pulau Jawa No. Populasi Kabupaten Jumlah sampel 1 Jawa Barat-Banten (Pop 1) 2 Jawa Timur (Pop 2) 3 Jawa Tengah (Pop 3) Total - Bogor - Rangkasbitung - Ngawi - Bojonegoro - Kebonharjo - Cepu - Kendal - Randublatung sampel Tabel 2 Bahan-bahan Ekstraksi ADN dan RAPD Bahan Ekstraksi ADN Tris-HCl 1M, NaCl 5 M, EDTA 0,5 M, CTAB 10%, Merkapetanol, PVP 1%, Aquades dan Fenol. RAPD H 2 0, Gotaq green Master mix, Primer, ADN Alat-alat penelitian Alat-alat yang digunakan untuk penelitian ini terbagi dalam empat kegiatan yaitu kegiatan ekstraksi ADN, RAPD, analisis data dan alat-alat yang digunakan secara umum selama penelitian. Gambar dan alat-alat yang digunakan selama kegiatan penelitian dapat dilihat pada Tabel 3 dan Gambar 6. Tabel 3 Alat-alat Ekstraksi ADN, RAPD, analisis data dan umum No Kegiatan Alat yang digunakan 1 Ekstraksi Pestel, mortar, vortex, ph meter, freezer, desikator, water bath, dan tube 2ml. 2 RAPD Microtube 0,2 ml dan mesin PCR 3 Analisis Data Komputer, softwere POPGEN32 dan NTSYS versi Umum Pipet, pipet mikro, tips, sentrifugasi, koleksi tabung, cetakan gel, bak elektroforesis, microwave, power supply, gelas piala, gelas ukur, timbangan analitik, pengaduk magnet, ultraviolet transiluminator, dan kamera digital, dan sarung tangan.

30 18 (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) Gambar 6 Foto alat-alat penelitian, a). Mesin PCR, b). Unit elektroforesis, c). Mesin Water bath fisherbrand, d). Sentrifugasi, e). Mikropipet, f). Microwave, g). Neraca, ph meter, h). Freezer

31 Metode Penelitian Metode analisis ADN dengan RAPD dibagi menjadi tiga tahapan yaitu ekstraksi, RAPD dan analisis data. Secara umum prosedur penelitian dengan metode RAPD dapat dilihat pada Gambar 7. Ekstraksi DNA Ya Tidak PCR Ya Tidak RAPD Analisis data Gambar 7 Bagan Prosedur Penelitian

32 Ekstraksi ADN Ekstraksi ADN pada daun Jati rakyat (Tectona grandis Linn. f) secara umum dilakukan dengan prosedur yang sama dengan kegiatan ekstraksi untuk jenis-jenis pohon kehutanan yang lain. Bahan yang akan dianalisis berupa contoh daun Jati rakyat dengan ukuran 2 x 2 cm digerus dengan menggunakan nitrogen cair di dalam pestel yang bersih sampai membentuk serbuk. Hasil gerusan dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml dan untuk mempercepat proses penghancuran sel secara kimia ditambahkan mikro liter larutan buffer ekstrak dan 100 mikro liter PVP 2%, kemudian campuran tersebut divortex agar menjadi homogen. Selain itu untuk mempercepat proses penghancuran sel secara thermal dilakukan proses inkubasi di dalam waterbath selama 45 menit 1 jam pada suhu 65 o C, campuran tersebut setiap 15 menit dibolak-balikan agar semua bahan di dalam tube terjadi proses penghancuran sel baik yang terdapat pada bagian atas dan bawah tube. Setelah 45 menit 1 jam diinkubasi, tube diangkat dan didinginkan selama 15 menit. Untuk memisahkan antara cairan bahan kimia dengan cairan yang mengandung ADN (supernatant) ditambahkan Chloroform IAA 500 mikro liter dan Fenol 10 mikro liter, kemudian dikocok dan tube disentrifugasi pada kecepatan rpm selama 2 menit. Cairan yang mengandung ADN (supernatant) dipindahkan ke dalam tube baru, kegiatan atau proses di atas dilakukan dua kali. Untuk mendapatkan pellet ADN, ke dalam tube yang berisikan supernatant ditambahkan isopropanol dingin 500 mikro liter dan NaCl 300 mikro liter dan disimpan di dalam freezer selama 45 menit-1 jam. Fase padat (pellet) dicuci dengan etanol 100% sebanyak 300 mikro liter yang ditambahkan ke dalam tube untuk memurnikan ADN dari sisa-sisa bahan kimia, proses tersebut dilakukan 2 kali, kemudian dikeringkan dalam desikator ± 15 menit. Larutan TE sebanyak 20 mikro liter ditambahkan untuk mendapatkan pellet ADN yang pekat. Pengujian kualitas ADN dilakukan setelah pellet ADN larut secara homogen. Untuk menguji kualitas ADN hasil ekstraksi dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 1% (b/v). Gel agarose merupakan campuran antara larutan TAE 1X dengan agarose.

33 21 Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 volt selama kurang lebih 30 menit yang pada prinsipnya dilakukan dengan memigrasikan ADN dalam gel agarose pada tegangan tertentu dari arus (-) atau katoda ke arus (+) atau anoda. Secara visual, hasil elektroforesis dapat menggambarkan tingkat keutuhan genom dan tingkat kontaminasi RNA dalam pellet ADN terisolasi. Apabila kondisi hasil elektroforesis smear menunjukkan bahwa ADN yang diisolasi tidak utuh (terbentuk potongan-potongan pendek) atau ADN yang diperoleh terkontaminasi oleh RNA. Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan Ethidium Bromide, selanjutnya pita ADN hasil isolasi dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator. Hasil isolasi meliputi tebal tipis ADN dan ada tidaknya fragmen ADN ataupun RNA. Komposisi bahan untuk ekstraksi yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Komposisi bahan untuk ekstraksi ADN No Nama Bahan 1 Sampel reaksi X Sampel reaksi 1 Tris-HCl 1 M 100 mikro liter X x 100 mikro liter 2 NaCl 5 M 280 mikro liter X x 280 mikro liter 3 EDTA 0.5 M 40 mikro liter X x 40 mikro liter 4 CTAB 10% 200 mikro liter X x 200 mikro liter 5 Merkapetanol 5 mikro liter X x 5 mikro liter 6 PVP 1% 100 mikro liter X x 100 mikro liter 7 Aquades 280 mikro liter X x 280 mikro liter Seleksi Primer Primer adalah rantai pendek ADN yang dihasilkan secara buatan biasanya terdiri antara nukleotida. (Finkeldey 2005). Primer berfungsi sebagai titik pemula terjadinya reaksi. Sepasang primer yang sekuennya telah ditentukan untuk dapat menemukan sekuen target pada ADN digunakan dalam PCR. Segmen ADN diantara kedua titik pertemuan primer akan diamplifikasi dalam reaksi PCR. Primer berfungsi sebagai titik awal sintesis oleh enzim yang disebut DNA polymerase yang diperoleh dari bakteri Thermus aquaticus. Enzim ini juga biasa disebut Taq DNA polymerase. Enzim ini sesuai untuk proses amplifikasi karena

34 22 dapat bertahan pada suhu tinggi hingga 95 o C meskipun suhu optimum bagi aktivitas enzim adalah 72 o C. Setelah terjadi annealing selanjutnya dilakukan perbanyakan fragmen ADN melalui proses ekstensi pada suhu 72 o C. Dalam teknik RAPD, umumnya primer yang digunakan berupa oligonukleotida yang memiliki panjang sebesar 10-mer yang dipilih secara acak dan minimum memiliki lima basa G dan C. Primer yang mempunyai panjang kurang dari 9-mer dapat digunakan, tetapi akan menghasilkan produk amplifikasi yang lebih sedikit dan diperlukan metode pewarnaan yang lebih sensitif untuk mendeteksinya. Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang menghasilkan penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan produk amplifikasi (primer positif) dan dari primer positif tidak semuanya menghasilkan fragmen ADN polimorfik. Pada kegiatan ini dilakukan survei terhadap 35 primer, yaitu primer dari golongan OPO dan OPY yang diproduksi oleh Operon Technology. Primer dari golongan OPO yaitu dengan memiliki kode primer O.1, O.2, O.4, O.5, O.6, O.7, O.8, O.9, O.10, O.11, O.12, O.13, O.14, O.15, O.16, O.18, O.19 dan O.20. Sedangkan primer dari golongan OPY memiliki kode primer Y.1, Y.2, Y.3, Y.4, Y.5, Y.6, Y.8, Y.9, Y.11, Y.12, Y.13, Y.14, Y.15, Y.16, Y.17, Y.18 dan Y.20. Urutan basa nukleotida primer OPO dan OPY dapat dilihat pada Tabel 5.

35 23 Tabel 5 Urutan basa nukleotida 35 primer (Operon Technology) No. Primer Urutan Basa No. Primer Urutan Basa 1 OPO-01 5' GGCACGTAAG '3 1 OPY-01 5' GGTGGCATCT '3 2 OPO-02 5' ACGTAGCGTG '3 2 OPY-02 5' CATCGCCGCA '3 3 OPO-04 5' AAGTCCGCTC '3 3 OPY-03 5' ACAGCCTGCT '3 4 OPO-05 5' CCCAGTCACT '3 4 OPY-04 5' GGCTGCAATG '3 5 OPO-06 5' CCACGGGAAG '3 5 OPY-05 5' AGCCGTGGAA '3 6 OPO-07 5' CAGCACTGAC '3 6 OPY-06 5' AAGGCTCACC '3 7 OPO-08 CCTCCAGTGT '3 7 OPY-08 5' AGGCAGAGCA '3 8 OPO-09 5' TCCCACGCAA '3 8 OPY-09 5' GTGACCGAGT '3 9 OPO-10 5 TCAGAGCGCC '3 9 OPY-11 5' AGACGATGGG '3 10 OPO-11 5' GACAGGAGGT '3 10 OPY-12 5' AAGCCTGCGA '3 11 OPO-12 5' CAGTGCTGTG '3 11 OPY-13 5' CACAGCGACA '3 12 OPO-13 5' GTCAGAGTCC '3 12 OPY-14 5' GGTCGATCTG '3 13 OPO-14 5' AGCATGGCTC '3 13 OPY-15 5' AGTCGCCCTT '3 14 OPO-15 5 TGGCGTCCTT 3 14 OPY-16 5' GGGCCAATGT '3 15 OPO-16 5' TCGGCGGTTC '3 15 OPY-17 5' GACGTGGTGA '3 16 OPO-18 5' CTCGCTATCC '3 16 OPY-18 5' GTGGAGTCAG '3 17 OPO-19 5' GGTGCACGTT '3 17 OPY-20 5' AGCCGTGGAA '3 18 OPO-20 5' ACACACGCTG ' PCR (Polymerase Chain Reaction) Proses PCR membutuhkan 4 komponen utama yaitu H 2 O, Gotaq green master mix, primer dan cetakan ADN (Tabel 6). Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam tube 0,2 ml. ADN hasil proses ekstraksi sebelum dilakukan proses amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran dengan menggunakan aquabidest. Besarnya perbandingan antara ADN dengan aquabidest tergantung dari tebal dan tipisnya ADN genomik hasil ekstraksi. Tabel 6 Komposisi bahan untuk reaksi PCR No Nama Bahan 1 Sampel reaksi X Sampel reaksi 1 H 2 O 2 mikro liter X x 2 mikro liter 2 Gotaq green master mix 7,5 mikro liter X x 7,5 mikro liter 3 Primer 1,5 mikro liter X x 1,5 mikro liter 4 Cetakan ADN 2 mikro liter X x 2 mikro liter

36 24 Dalam proses PCR untuk mengetahui kosentrasi ADN hasil ekstraksi dapat ditetapkan dengan melakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose. Hasil dari proses PCR sangat ditentukan oleh primer yang digunakan. Proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek (30 60 detik) dengan tiga perubahan suhu yang berubah secara cepat (Tabel 7). Tabel 7 Tahapan-tahapan dalam proses PCR untuk teknik RAPD Tahapan Suhu Waktu Jumlah Siklus Pre-denaturation 95 0 C 2 menit 1 Denaturation Annealing 95 0 C 37 0 C 1 menit 2 menit 45 Extension 72 0 C 2 menit Final Extension 72 0 C 5 menit 1 Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer hasil dari seleksi. Hasil proses PCR kemudian dianalisis dengan melakukan elektroforesis menggunakan 2,0 % gel agarose dalam larutan buffer 1 x TE dan distaining didalam larutan Ethidium Bromide. Produk PCR dari individu pohon yang berbeda akan menghasilkan panjang sekuen yang berbeda pula. Perbedaan ini akan dapat dideteksi dengan elektroforesis dengan gel agarose. 3.4 Analisis Data Hasil PCR yang telah dielektroforesis difoto dan dianalisis dengan melakukan scoring pola pita yang muncul. Pola pita yang muncul (positif) diberi nilai 1 dan pola pita yang tidak muncul (negatif) diberi nilai 0. Hasil perhitungan kemudian dianalisis untuk mengetahui frekuensi dan keragaman antar popinsi dan antar populasi dengan menggunakan software POPGENE 32. Pendugaan hubungan kekerabatan dilakukan berdasarkan jumlah pita polimorfik yang dimiliki bersama (Nei dan Lei 1979 dalam Yunanto 2006), sedangkan pengelompokan kerabat berdasarkan metode UPGMA (Unweighted Pair Group with Arithmatic Average) (Nei 1973 dalam Yunanto 2006) dengan software NTSYS Ver 2.0 (Rohlf 1998). Proses scoring dapat dilihat pada Gambar 8.

37 25 Lokus Individu L-1 L-2 L-3 L-4 Lokus Individu L L L L Gambar 8 Cara penilaian pita dengan sistem scoring (1 = ada pita, 0 = tidak ada pita) (Yunanto, 2006) Selain menggunakan software, nilai variabilitas genetik yang dianalisis dapat dihitung secara manual. Rumus untuk perhitungan variabilitas genetik yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut (Finkeldey, 2005): 1. Persentase Lokus Polimorfik (PLP) = ((N(LP)/((N(LP) +(N(LM))) x 100% Keterangan : N(LP) : jumlah lokus polimorfik N(LM) : jumlah lokus monomorfik 2. Jumlah alel yang diamati (na) = jumlah semua lokus/jumlah lokus yang diamati 2. Jumlah alel yang efektif (ne) = 1 / (jumlah frekuensi alel (p)) 2 3. Heterozigitas harapan (H e ) = 1- (jumlah frekuensi alel (p)) 2 4. Diferensiasi genetik (G ST ) = (H T - H S )/H T Keterangan : H T : keragaman populasi total H S : keragaman populasi tunggal