Lampiran 1. Bagan prosedur isolasi DNA

Transkripsi

1 Lampiran 1. Bagan prosedur isolasi DNA gr daun segar digerus dgn nitrogen cair,sambil digerus masukkan 0.1 gr PVPP sampai menjadi tepung. Lalu masukkan dalam tube 2 ml yng telah berisi 1 ml CTAB 2% dan 10 ul B-merkapto, bolak balik tube sampai homogen Vortex sampel sampai homogen, panaskan dalam waterbath suhu 65 selama 60 menit (setiap 10 menit angkat lalu dibolak-balik). Setelah dingin masukkan KIAA 1ml per sampel, lalu sentrifuse rpm selama 15 menit. Pindahkan bagian atas ke tube 2ml yang baru lalu tambahkan KIAA lagi 1 ml per sampel. Ambil bagian atas (supernatant) lalu pindahkan ke tube ukuran 1.5 ml. Masukkan isopropanol dingin + sodium asetat, dibolak balik, lalu diamkan di dalam kulkas -20 C diinkubasi selama 1 malam. Dikeluarkan dari kulkas lalu disentrifuse rpm 20 menit, akan keliatan pellet pada bagian dasar tube, bagian atas (supernatant) dibuang lalu dan dikering-anginkan. Setelah itu dimasukkan buffer TE 100 ul, dispin manual hingga homogen. Setelah homogen ditambahkan Sodium asetat + etanol (100%) dingin, diinkubasi di dalam kulkas selama 3 jam pada -20 C Dikeluarkan dari kulkas lalu disentrifuse rpm 15 menit, akan keliatan pellet pada bagian dasar tube, bagian atas (supernatant) dibuang lalu. Lalu dibasuh dengan etanol 70% sebanyak 200 ul lalu etanol dibuang. Tube berisi pellet dikering-anginkan sampai tidak terdapat gelembung cairan. Setelah kering ditambahkan buffer TE sebanyak 100 ul, disimpan pada -20 ºC menjadi STOK DNA

2 Lampiran 2. Siklus PCR Tahap Suhu Waktu Jumlah Siklus Denaturasi awal 94ºC 2 menit 1 siklus Denaturasi 94ºC 1 menit 45 siklus Anealing 36ºC 1 menit 45 siklus Ekstension 72ºC 2 menit 45 siklus Ekstension akhir 72ºC 10 menit 1 siklus Kondisi akhir PCR 4ºC tak terbatas Setting PCR PCR (Thermal Cycler) Applied Biosystems

3 Lampiran 3. Data distance DIS 30 TS1 TS2 TS3 TS4 TS5 Sim1 Sim2 Sim3 DS1 DS2 DS3 DS4 DS5 Srg1 Srg2 Srg3 Srg4 Srg5 Lkt1 Lkt2 Lkt3 Lkt4 Lkt5 Lkt6 Lkt7 Lkt8 Lkt9 Lkt10 Lkt11 TS TS TS TS Sim Sim Sim DS DS DS DS DS Srg Srg Srg Srg Srg Lkt Lkt Lkt Lkt Lkt Lkt Lkt Lkt Lkt Lkt Lkt Lkt Dissimilarity calculated from data file: manggis_30_10primer_kode.var (type:'single') User selection Units: 30/30 and Variables: 80/80 Dissimilarity index: Presence / Absence - Dice Missing data options: No missing data 1000 bootstraps Keterangan TS1 : Tapsel1 DS3 : Deli Serdang3 Lkt3 : Langkat3 Maximum distance : 0.48 TS2 : Tapsel2 DS4 : Deli Serdang4 Lkt4 : Langkat4 Minumum distance : 0.06 TS3 : Tapsel3 DS5 : Deli Serdang5 Lkt5 : Langkat5 TS4 : Tapsel4 Srg1 : Sergei1 Lkt6 : Langkat6 TS5 : Tapsel5 Srg2 : Sergei2 Lkt7 : Langkat7 Sim1 : Simalungun1 Srg3 : Sergei3 Lkt8 : Langkat8 Sim2 : Simalungun2 Srg4 : Sergei4 Lkt9 : Langkat9 Sim3 : Simalungun3 Srg5 : Sergei5 Lkt10 : Langkat10 DS1 : Deli Serdang1 Lkt1 : Langkat1 Lkt11 : Langkat11 DS2 : Deli Serdang2 Lkt2 : Langkat2 Lkt12 : Langkat12

4 Lampiran 4. Hasil uji kuantitas dan konsentrasi DNA manggis populasi Sumatera Utara dengan spektrofotometer/nanophotometer DNA Sampel 1 : TS1 DNA Sampel 2 : TS2 DNA Sampel 3 : TS3 DNA Sampel 4 : TS4 DNA Sampel 5 : TS5 DNA Sampel 6 : Sim1 DNA Sampel 7 : Sim2 DNA Sampel 8 : Sim3

5 DNA Sampel 9 : DS1 DNA Sampel 10 : DS2 DNA Sampel 11 : DS3 DNA Sampel 12 : DS4 DNA Sampel 13 : DS5 DNA Sampel 14 : Srg1 DNA Sampel 15 : Srg2 DNA Sampel 16 : Srg3

6 DNA Sampel 17 : Srg4 DNA Sampel 18 : Srg5 DNA Sampel 19 : Lkt1 DNA Sampel 20 : Lkt2 DNA Sampel 21 : Lkt3 DNA Sampel 22 : Lkt4 DNA Sampel 23 : Lkt5 DNA Sampel 24 : Lkt6

7 DNA sampel 25 : Lkt7 DNA Sampel 26 : Lkt8 DNA Sampel 27 : Lkt9 DNA Sampel 28 : Lkt10 DNA Sampel 29 : Lkt11 DNA Sampel 30 : Lkt12

8 Lampiran 5. Gambar kegiatan elektroforesis Pembuatan agarose Elektroforesis Ethibium bromide (Etbr) UV Tec (Gel Doc)

9 Lampiran 6. Gambar kegiatan di laboratorium Isolasi DNA dengan Nitrogen cair Lysis dinding sel dengan nitrogen cair Proses pemanasan Pada Waterbath Vortex dan Centrifuge Preparasi PCR Alat PCR berisi tube PCR

10 Lampiran 7. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok a. CTAB 5 % Larutan dibuat dengan melarutkan : - NaCl : 2.0 g - CTAB : 5.0 G - Aquades : 100 ml b. Tris HCl 1 M ph 8.0 (100 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Tris : g - HCl p.a. : 4.2 ml - Aquades : 80 ml - Larutan dibuat dengan mencampurkan bahan kimia di dalam gelas beaker yang diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik di atas hot plate - Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml - Larutan disterilisasi dengan autoclave c. Tris HCl 1 M ph 7.4 (50 m) Bahan yang digunakan adalah : - Tris : g - Aquades ditambahkan hingga volume larutan mendekati 50 ml - Pengaturan Ph dilakukan dengan menambahkan NaOH 2.5 M hingga Ph Volume ditepatkan hingga 50 ml - Larutan disterilisasi dengan autoclave d. EDTA O.5 M ph 8.0 (100 ml) Bahan yang digunakan adalah : - NaEDTA : g - NaOH : 2.0 g - Aquades : 80 ml - Larutan dibuat dengan mencampur bahan kimia dalam gelas beaker dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik - Pengaturan ph dilakukan dengan menambahkan HCl hingga ph Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml - Larutan disterilisasi dengan autoclave e. NaCl 5 M ph 7.7 (l00 ml) Bahan yang digunakan adalah : - NaCl : g - Aquades ditambahkan hingga larutan mendekati 100 ml dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik hingga larut - Pengaturan PH dilakukan dengan menambahkan NaOH hingga ph Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml - Larutan disterililasasi dengan autoclave

11 f. Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml) Bahan yang digunakan adalah : - CTAB 2 % : 40 ml CTAB 5 % - NaCl 1,26 M : 25.1 ml NaCl 5 M - EDTA 20 mm : 4 ml EDTA 0.5 M ph Tris HCl ph mm : 10 ml Tris HCl 1 M ph Aquades steril : 20.8 ml g. Buffer TAE 50 X (100 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Tris : 24.2 ml ph, Asam Asetat Glasial : 5.7 ml - EDTA 0.5 M PH 8.0 : 10 ml - Aquades ditambahkan hingga olume larutan 100 ml h. Buffer TAE 1X (500 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Buffer TAE 50 X : 10 ml - Aquades : 490 ml i. Buffer TE (50 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Tris HCl 1 M PH 8.0 : 0.5 ml - EDTA 0.5 M PH 8.0 : 0.1 ml - Aquades : ml - Dimasukkan ke dalam gelas beaker dan diaduk hingga merata j. Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Kloroform : 48 ml - Isoamilalkohol : 2 ml - Dicampur merata k. Etanol 70 % (100 ml) - Etanol : 70 ml - Aquades : 30 ml

12 Lampiran 8.Peta Lokasi Penelitian Sumatera Utara

13 Lampiran 9. Gambar aksesi manggis TS1 AKSESI 1 TS1 Asal Desa : Napa (Tapsel) Kecamatan : Batang Toru Ketinggian Tempat : 70 mdpl Usia ± 60 tahun Letak : N 0.3º , E 0.99º Lilit Batang : 140 cm

14 Lampiran 10. Gambar aksesi manggis TS2 AKSESI 2 TS2 Asal Desa : Sipenggeng (Tapsel) Kecamatan : Batang Toru Ketinggian tempat : 76 mdpl Usia Tanaman : ± 40 tahun Letak : S 0.1º , E 101º Tinggi Tanaman ± 20 m Lilit Batang : 134 cm

15 Lampiran 11. Gambar aksesi manggis TS3 AKSESI 3 TS3 Asal Desa : Huraba 1 (Tapsel) Kecamatan : Marancar Ketinggian Tempat : 320 mdpl Usia tanaman : ± 40 tahun Letak : S 0.1º , E 101º Tinggi Tanaman :± 10 m Lilit Batang : 110 cm

16 Lampiran 12. Gambar aksesi manggis TS4 AKSESI 4 TS4 Asal Desa : Pangarongan (Tapsel) Kecamatan : Marancar Ketinggian Tempat : 360 mdpl Usia tanaman : ± 40 tahun Letak : S 0.1º , E 101º Tinggi Tanaman :± 15 m Lilit Batang : 112 cm

17 Lampiran 13. Gambar aksesi manggis TS5 AKSESI 5 TS5 Aksesi : Simasom (Tapsel) Kecamatan : Angkola Timur Ketinggian Tempat : 602 mdpl Usia tanaman : ± 50 tahun Letak : N 0.1º , E 099º Tinggi Tanaman :± 15 m Lilit Batang : 140 cm

18 Lampiran 14. Gambar aksesi manggis Sim1 AKSESI 6 Sim1 Aksesi : Sirama 1 Kabupaten : Simalungun Usia ± 100 tahun Tinggi Tanaman : ± 25 m Lilit Batang : 160 cm Letak : N 0.3º , E 099º

19 Lampiran 15. Gambar aksesi manggis Sim2 AKSESI 7 Sim2 Aksesi : Sirama 2 Kabupaten : Simalungun Usia ± 20 tahun Tinggi Tanaman : ± 10 m Lilit Batang : 63 cm Letak : N 0.3º , E 099º

20 Lampiran 16. Gambar aksesi manggis Sim3 AKSESI 8 Sim3 Asal Desa : Petani Timur Kabupaten : Simalungun Usia ± 35 tahun Tinggi Tanaman : ± 15 m Lilit Batang : 140 cm Letak : N 0.3º , E 099º

21 Lampiran 17. Gambar aksesi manggis DS1 AKSESI 9 DS1 Asal Desa : Pancur Batu Kabupaten : Deli Serdang Usia ± 20 tahun Tinggi Tanaman : ± 8 m Lilit Batang : 50 cm

22 Lampiran 18. Gambar aksesi manggis DS2 AKSESI 10 DS2 Asal Desa : Tiang Layar Kabupaten : Deli Serdang Usia ± 40 tahun Tinggi Tanaman : ± 20 m ili

23 Lampiran 19. Gambar aksesi manggis DS3 AKSESI 11 DS3 Asal Desa : Rambung Baru Kabupaten : Deli Serdang Usia ± 40 tahun Tinggi Tanaman : ± 15 m Lilit Batang : 78 cm

24 Lampiran 20. Gambar aksesi manggis DS4 AKSESI 12 DS4 Asal Desa : Bingkawan Kabupaten : Deli Serdang Usia ±40 tahun Tinggi Tanaman : ± 18 m Lilit Batang : 84 cm

25 Lampiran 21. Gambar aksesi manggis DS5 AKSESI 13 DS5 Asal Desa : Sembahe Kabupaten : Deli Serdang Usia ± 40 tahun Tinggi Tanaman : ± 15 m Lilit Batang : 75 cm

26 Lampiran 22. Gambar aksesi manggis Srg1 AKSESI 14 Srg1 Asal Desa : Celawan 1 Kabupaten : Serdang Bedagai (Sergei) Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 18 m Lilit Batang : 95 cm

27 Lampiran 23. Gambar aksesi manggis Srg2 AKSESI 15 Srg2 Asal Desa : Celawan 2 Kabupaten : Serdang Bedagai (Sergei) Usia ± 20 tahun Tinggi Tanaman : ± 10 m ili

28 Lampiran 24. Gambar aksesi manggis Srg3 AKSESI 16 Srg3 Asal Desa : Besar Terjun Kabupaten : Serdang Bedagai (Sergei) Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 10 m Lilit Batang : 45 cm

29 Lampiran 25. Gambar aksesi manggis Srg4 AKSESI 17 Srg4 Asal Desa : Meteran Kabupaten : Serdang Bedagai (Sergei) Usia ± 50 tahun Tinggi Tanaman : ± 15 m Lilit Batang : 75 cm

30 Lampiran 26. Gambar aksesi manggis Srg5 AKSESI 18 Srg5 Asal Desa : Firdaus Kabupaten : Serdang Bedagai (Sergei) Usia ± 100 tahun Tinggi Tanaman : ± 10 m Lilit Batang : 96 cm

31 Lampiran 27. Gambar aksesi manggis Lkt1 AKSESI 19 Lkt1 Asal Desa : Stabat Lama Kabupaten : Serdang Bedagai (Sergei) Usia ± 15 tahun Tinggi Tanaman : ± 15 m

32 Lampiran 28. Gambar aksesi manggis Lkt2 AKSESI 20 Lkt2 Asal Desa : Stabat Banyumas Kabupaten : Langkat Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 10 m Lilit Batang : 55 cm

33 Lampiran 29. Gambar aksesi manggis Lkt3 AKSESI 21 Lkt3 Asal Desa : Pertumbukan Kabupaten : Langkat Usia ± 40 tahun Tinggi Tanaman : ± 18 m

34 Lampiran 30. Gambar aksesi manggis Lkt4 AKSESI 22 Lkt4 Asal Desa : Stabat Baru Kabupaten : Langkat Usia ± 40 tahun Tinggi Tanaman : ± 15 m Lilit Batang : 135 cm

35 Lampiran 31. Gambar aksesi manggis Lkt5 AKSESI 23 Lkt5 Asal Desa : Stabat Barat -1 Kabupaten : Langkat Usia ± 15 tahun Tinggi Tanaman : ± 10 m Lilit Batang : 28 cm

36 Lampiran 32. Gambar aksesi manggis Lkt6 AKSESI 24 Lkt6 Asal Desa : Stabat Barat-2 Kabupaten : Langkat Usia ± 20 tahun Tinggi Tanaman : ± 8 m Lilit Batang : 30 cm

37 Lampiran 33. Gambar aksesi manggis Lkt7 AKSESI 25 Lkt7 Asal Desa : Stabat Kota Kabupaten : Langkat Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 14 m Lilit Batang : 65 cm

38 Lampiran 34. Gambar aksesi manggis Lkt8 AKSESI 26 Lkt8 Asal Desa : Hulu Berayun Kabupaten : Langkat Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 12 m Lilit Batang : 45 cm

39 Lampiran 35. Gambar aksesi manggis Lkt9 AKSESI 27 Lkt9 Asal Desa : Namo Cengkeh Kabupaten : Langkat Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 14 m Lilit Batang : 30 cm

40 Lampiran 36. Gambar aksesi manggis Lkt10 AKSESI 28 Lkt10 Asal Desa : Tanjung Keliling Kabupaten : Langkat Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 16 m Lilit Batang : 25 cm

41 Lampiran 37. Gambar aksesi manggis Lkt11 AKSESI 29 Lkt11 Asal Desa : Namo Datok Kabupaten : Langkat Usia ± 25 tahun Tinggi Tanaman : ± 15 m Lilit Batang : 64 cm

42 Lampiran 38. Gambar aksesi manggis Lkt12 AKSESI 30 Lkt12 Asal Desa : Sukatani Kabupaten : Langkat Usia ± 15 tahun Tinggi Tanaman : ± 10 m Lilit Batang : 48 cm

43