KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER ISOLAT-ISOLAT BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH WILAYAH BOGOR DAN SUKABUMI DINA DWI ASTUTI

Transkripsi

1 KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER ISOLAT-ISOLAT BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH WILAYAH BOGOR DAN SUKABUMI DINA DWI ASTUTI DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

2 ABSTRAK DINA DWI ATUTI. Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat Bakteri Metanotrof Asal Sawah Wilayah Bogor dan Sukabumi. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA. Metan (CH 4 ) merupakan salah satu gas rumah kaca utama yang dapat menyerap radiasi inframerah sehingga berkontribusi terhadap pemanasan global. Methanotrof merupakan bakteri yang hidup menggunakan metan sebagai sumber karbon dan energi. Bakteri metanotrof memiliki peran utama dalam mereduksi metan yang lepas ke atmosfer dari lingkungan. Isolat-isolat bakteri metanotrof (BGM 1, BGM 2, BGM 3, BGM 9, dan SKM 14) yang diisolasi dari sawah wilayah Bogor dan Sukabumi diketahui memiliki oksidasi metan yang tinggi. Dalam penelitian ini dilakukan uji fisiologi dengan menggunakan API 20 NE dan analisis sekuen gen 16S rrna dari kelima isolat tersebut. Kelima isolat menunjukkan hasil positif terhadap uji gelatin, enzim β-galactosidase, asimilasi glukosa, asimilasi manitol, asimilasi N-asetil-glukosamin, asimilasi maltosa, dan asimilasi asam malat. Analisis 16S rrna menunjukkan isolat BGM 1 dan BGM 3 memiliki kemiripan 74% dan 70% dengan Methylocystis rosea, BGM 2 dan BGM 9 memiliki kemiripan 83% dan 85% dengan Methylococcus capsulatus, dan SKM 14 memiliki kemiripan 65% dengan Methylobacter sp. Pohon filogenetik menunjukkan isolat BGM 1 dan BGM 3 berada satu kelompok dengan Methylocystis rosea strain SV97T, Methylobacterium extorquens, dan Methylosinus trichosporium, namun memiliki kekerabatan terdekat dengan Methylocystis rosea strain SV97T. Isolat BGM 2, BGM 9, dan SKM 14 berada satu kelompok dengan Methylococcus capsulatus strain texas, Methylomicrobium buryatense, dan Methylobacter sp. namun isolat BGM 2 dan BGM 9 memiliki kekerabatan terdekat dengan Methylococcus capsulatus strain texas. Sedangkan isolat SKM 14 memiliki kekerabatan terdekat dengan Methylobacter sp. ABSTRACT DINA DWI ASTUTI. Physiological Characterization and Molecular Identification of Methanotrophic Bacteria isolated from Ricefields in Bogor and Sukabumi. Under supervision of IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA. Methane (CH 4 ) is one of the main greenhouse gasses that could absorb infra-red radiation so it contribute to global warming. Methanotrophs are bacteria that are able to grow using methane as their only source of carbon and energy. They play a major role in the reduction of the release of methane into the atmosphere from environments. Methanotrophic bacteria isolated from Ricefields in Bogor and Sukabumi (BGM 1, BGM 2, BGM 3, BGM 9, and SKM 14) had a high methane oxidation. Activity physiologycal assay using API 20 NE and molecular identification using 16S rrna gene sequence analysis were conducted in this research. Five isolates showed a positive reaction of physiological assays for gelatine, β-galactosidase enzyme, glucose assimilation, mannitol assimilation, N-asetil-glukosamin assimilation, maltose assimilation, and malic acid assimilation. BGM 1 and BGM 3 16S rrna sequence showed that they had similarity to Methylocystis rosea into 74% and 70% respectively, while BGM 2 and BGM 9 had similarity to Methylococcus capsulatu into 83% and 85% respectively, and SKM 14 had 65% similarity with Methylobacter sp. Phylogenetic tree showed that BGM 1 and BGM 3 isolates were in the same group with Methylocystis rosea strain SV97T, Methylobacterium extorquens, and Methylosinus trichosporium, nevertheless they were very close related to Methylocystis rosea strain SV97T. BGM 2, BGM 9, and SKM 14 isolates were in the same group with Methylococcus capsulatus strain texas, Methylomicrobium buryatense, and Methylobacter sp. nevertheless BGM 2 and BGM 9 isolates were very close related to Methylococcus capsulatus strain texas. While SKM 14 was very close related with Methylobacter sp.

3 KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER ISOLAT-ISOLAT BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH WILAYAH BOGOR DAN SUKABUMI DINA DWI ASTUTI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

4 Judul Skripsi : Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat Bakteri Metanotrof Asal Sawah Wilayah Bogor dan Sukabumi Nama : Dina Dwi Astuti NIM : G Menyetujui : Pembimbing I, Pembimbing II, (Dr. Ir. Iman Rusmana M.Si) (Alina Akhdiya M.Si) NIP NIP Mengetahui : Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Dr. Drh. Hasim, DEA NIP Tanggal Lulus

5 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Penyayang atas segala karunia- Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari hingga Mei 2009 ini ialah Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat Bakteri Metanotrof Asal Sawah Wilayah Bogor dan Sukabumi. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rumana, M.Si. dan Ibu Alina Akhdiya, M.Si. atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. Terima kasih kepada Dr. Utut Widyastuti, M.Si atas saran dan masukan yang diberikan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Di samping itu, penulis sampaikan terima kasih dan syukur kepada Mba Ema, Mba Ary, Mba Rika, dan teman-teman yang melakukan penelitian di laboratorium Mikrobiologi, Nina Sari An-Nisa, Zainati Fakhrina, Qatrunnada, Tiara Kirana Gita, Nur Azifah Cakra Dewi, serta seluruh teman-teman Biologi 42 atas dukungannya dalam pelaksanaan penelitian ini. Serta pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam pengumpulan data karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, kakak, dan Mohammad Irfan atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Juli 2009 Dina Dwi Astuti

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 25 April 1987 dari ayah Widodo dan ibu Sri Endang Kartini. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 14 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Seleksi Pemilihan Mahasiswa Baru. Penulis memilih Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota KPH (Komisi Pengawas Himpunan Mahasiswa Biologi) pada tahun Penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Tingkat Persiapan Bersama pada tahun ajaran 2008/2009, mata kuliah Ilmu Lingkungan pada tahun ajaran 2008/2009. Pada saat mengikuti perkuliahan, penulis melakukan studi lapang di Kawasan wana Wisata Cangkuang Sukabumi, dengan judul makalah Kemungkinan Tumbuhan Liar Menjadi Tanaman Hias. Penulis juga melakukan praktik lapangan di PT. Frisian Flag Indonesia pada bulan Juli hingga Agustus 2008, dengan judul makalah Uji Mikrobiologis Pada Produk Susu Kental Manis Di PT Frisian Flag Indonesia.

7 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... vi DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... vi PENDAHULUAN Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat... 1 Bahan dan Alat... 1 Metode Penelitian... 1 Pemurnian dan Peremajaan Isolat... 1 Pewarnaan Gram dan Uji Fisiologi... 1 Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom... 1 Sekuensing DNA... 2 Analisis Filogenetik... 2 HASIL Karakteristik Koloni Sel Isolat Bakteri Metanotrof... 2 Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom... 3 Sekuensing DNA... 3 Analisis Filogenetik... 4 PEMBAHASAN... 5 SIMPULAN... 6 SARAN... 6 DAFTAR PUSTAKA... 6 LAMPIRAN... 8 vi

8 DAFTAR TABEL Halaman 1 Karakteristik morfologi sel dan pewarnaan Gram isolat-isolat bakteri metanotrof Ciri-ciri fisiologi isolat-isolat bakteri metanotrof Hasil analisis sekuen gen 16S rrna dengan menggunakan program BLAST-N... 4 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Hasil elektroforesis dari amplifikasi gen 16S rrna menunjukkan pita DNA berukuran ~1.3 kb Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rrna dari isolat-isolat bakteri metanotrof yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S rrna dari beberapa spesies bakteri metanotrof lainnya... 4 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Hasil pewarnaan Gram isolat-isolat bakteri metanotrof Hasil sekuen gen 16S rrna dan BLAST-N isolat-isolat bakteri metanotrof Hasil analisis bioinformatika menggunakan program BLAST-N pada situs NCBI... 20

9 Latar Belakang PENDAHULUAN Pengukuran emisi CH 4 di lahan sawah mengindikasikan bahwa metan yang diproduksi pada bagian anaerob sebagian dioksidasi pada lapisan permukaan sedimen sawah (Conrad & Rothfus 1991). Bakteri pengoksidasi metan atau methanotroph adalah organisme aerobik yang dapat tumbuh dan berkembang dengan metan sebagai satu-satunya sumber energi. Oleh karena itu, oksidasi metan dapat terjadi pada lingkungan mikro yang bersifat aerobik pada zona perakaran dan pada bagian yang bersifat toksik pada lapisan permukaan tanah. Proses oksidasi metan tersebut diinisiasi oleh enzim metan monooksigenase yang berperan dalam konversi metan menjadi metanol (Oremland dan Capone 1988). Enzim MMO juga berperan dalam degradasi berbagai senyawa polutan seperti trikloroetilen, isomer-isomer dari dikloroetilen, vinil klorida, dan kloroform (Graham et al. 1992). Oksidasi CH 4 oleh bakteri metanotrof di lahan sawah dapat mencapai 80 % dari CH 4 yang diproduksi oleh bakteri metanogen (Conrad & Rothfus 1991). Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas oksidasi CH 4 selain dipengaruhi oleh faktor lingkungan juga dipengaruhi oleh dominansi jenis bakteri metanotrof dari komunitas mikroba di lahan sawah. Menurut Hanson & Hanson (1996), upaya mereduksi emisi metan akan kali lebih efektif dalam mengurangi kemungkinan pemanasan atmosfer bumi pada abad mendatang daripada mengurangi emisi CO 2. Informasi tentang aspek mikrobiologi komunitas bakteri baik jenis, aktivitas dan dominasi bakteri metanotrof yang berperan penting dalam menurunkan emisi gas rumah kaca CH 4 pada lahan sawah di Indonesia masih sangat jarang. Oleh karena itu kajian ilmiah tentang komunitas bakteri baik jenis/spesies, aktivitas dan dominansi mikroba bakteri metanotrof penting dilakukan, sehingga hasil dan informasinya dapat mendukung dan dimanfaatkan untuk mewujudkan lahan sawah yang ramah lingkungan. Aplikasi bakteri metanotrof sebagai pengoksidasi metan dapat menjadi salah satu solusi untuk mengurangi emisi metan dari sawah. Sebanyak 40 isolat bakteri metanotrof berhasil diisolasi dari sedimen sawah di Bogor dan Sukabumi. Oksidasi metan tertinggi dihasilkan oleh isolat BGM 1, BGM 2, BGM 3, BGM 9, dan SKM 14 (Hapsary 2008). Oleh karena itu perlu dilakukan karakterisasi fisiologi dan analisis molekular terhadap isolat-isolat bakteri metanotrof tersebut untuk identifikasi hingga tingkat spesies. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi secara fisiologi dan mengidentifikasi secara molekular isolatisolat bakteri metanotrof asal sawah wilayah Bogor dan Sukabumi. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan bulan Februari 2009 sampai dengan bulan Mei 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan, yaitu 5 isolat bakteri metanotrof BGM 1, BGM 2, BGM 3, BGM 9, dan SKM 14 asal sawah wilayah Bogor dan Sukabumi. Peralatan yang digunakan, yaitu PCR (Perkin Elmer Biosystem, USA), Laminar Air Flow, autoklaf, sentrifuse, elektroforesis mini-gel (BioRad Mini-Sub Cell GT, CA, USA), UV Transluminator (Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco, USA), dan peralatan lainnya yang biasanya digunakan di laboratorium mikrobiologi. Metode Pemurnian dan peremajaan isolat. Isolat-isolat bakteri metanotrof dimurnikan dan diremajakan pada media agar NMS (Nitrate Mineral Salts) dan diinkubasi pada suhu ruang (27 C) selama 3-14 hari. Pewarnaan Gram dan Uji Fisiologi. Isolat-isolat bakteri metanotrof yang telah dimurnikan dan diremajakan dilakukan pewarnaan Gram. Selanjutnya dilakukan karakterisasi secara fisiologi dan biokimia dengan menggunakan API-Kit (API 20NE). Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom. Isolasi DNA genom menggunakan metode Lazo (Lazo et al 1987). DNA genom hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S- rrna menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Amplifikasi gen 16S-rRNA dilakukan dengan memakai DNA template

10 2 yang diamplifikasi dengan kit Ready To Go PCR Beads (Pharmacia-Biothec) dengan menggunakan universal primer spesifik prokaryot (Marchesi et al. 1998), yaitu 63f (5 -CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3 ) dan 1387r (5 - GGGCGGWGTGTACAAGGC-3 ). Kondisi PCR yang digunakan adalah Pre-PCR pada suhu 94 o C selama 2 menit, denaturasi pada suhu 92 o C selama 30 detik, Annealing primer pada suhu 55 o C selama 30 detik, Elongation atau perpanjangan primer pada suhu 75 o C selama 1 menit, dan Post PCR pada suhu 75 o C selama 5 menit, dengan jumlah siklus sebanyak 30 kali. Pemisahan DNA produk PCR dilakukan pada Elektroforesis mini-gel dengan menggunakan agarose 2 % (b/v) pada tegangan listrik 50 volt selama 45 menit (Sambrook et al. 1989). Visualisasi menggunakan Ethidium Bromida dan dilihat di bawah UV Transluminator. Sekuensing DNA. DNA hasil amplifikasi lalu disekuensing di PT. CHAROEN PHOKPHAND INDONESIA- Jakarta, untuk mengetahui urutan basa DNA-nya. Hasil sekuen kemudian dijajarkan dengan data GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida) dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) untuk mengetahui kemiripan spesies dari isolat yang diuji. Analisis Filogenetik. Konstruksi pohon filogenik dilakukan dengan menggunakan program MEGA 4.0 (Kumar et al. 2004), metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. HASIL Karakteristik Koloni Sel Isolat Bakteri Metanotrof Isolat BGM 1, BGM 3, dan SKM 14 memiliki sel berbentuk batang dengan penataan rantai sedangkan isolat BGM 2dan BGM 9 memiliki sel berbentuk bulat dengan penataan rantai. Kelima bakteri metanotrof merupakan bakteri gram negatif, tidak membentuk spora, dan non-motil (Tabel 1). Hasil uji fisiologi menggunakan API 20 NE menunjukkan bahwa kelima isolat bakteri metanotrof dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit (kecuali BGM 9), tidak dapat mereduksi nitrat menjadi nitrogen (kecuali BGM 9), menghasilkan urease (kecuali BGM 1), menghidrolisis β- glukosidase (kecuali BGM 9), menghidrolisis protease, menghasilkan β- galaktosidase. Kelima bakteri metanotrof juga melakukan asimilasi glukosa, arabinosa (kecuali BGM 3), manosa (kecuali BGM 1), manitol, N-asetil-glukosamin, maltosa, potasium glukonat (kecuali BGM 2), asam malat, dan trisodium sitrat (kecuali BGM 2). Selain itu bakteri metanotrof dapat melakukan fermentasi glukosa pada isolat BGM 3, menghasilkan arginin pada BGM 3 dan BGM 9, melakukan asimilasi asam capric pada isolat BGM 1, BGM 3, dan BGM 9, asimilasi asam adipic pada isolat BGM 9, dan asimilasi asam penilasetik pada BGM 1, BGM 3, dan BGM 9 (Tabel 2). Tabel 1 Karakteristik morfologi sel dan pewarnaan Gram isolat-isolat bakteri metanotrof Isolat Bentuk dan Pewarnaan penataan sel Gram BGM 1 batang, rantai - BGM 2 bulat, rantai - BGM 3 batang, rantai - BGM 9 bulat, rantai - SKM 14 batang, rantai -