EFEKTIVITAS FIKSASI N 2 DAN OKSIDASI METAN KULTUR CAMPURAN BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH VINA CHATRINA

Transkripsi

1 EFEKTIVITAS FIKSASI N 2 DAN OKSIDASI METAN KULTUR CAMPURAN BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH VINA CHATRINA DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010

2 ABSTRAK VINA CHATRINA. Efektivitas Fiksasi N 2 dan Oksidasi Metan Kultur Campuran Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA. Sebagian besar emisi CH 4 di lahan sawah yang tergenang diproduksi oleh bakteri metanogen dan sebanyak 80 % dari CH 4 tersebut dioksidasi oleh bakteri metanotrof. Selain kemampuan mengoksidasi metan, metanotrof juga memiliki kemampuan memfiksasi nitrogen. Empat isolat metanotrof dengan kemampuan fiksasi nitrogen (BGM 1, BGM 3, BGM 5, dan BGM 9) masing-masing dikombinasikan dengan isolat metanotrof yang memiliki aktivitas oksidasi metan tinggi (SKM 14) untuk mendapatkan formulasi metanotrof yang tinggi aktivitas fiksasi nitrogen dan oksidasi metan-nya. Kemampuan fiksasi nitrogen diukur dari kadar amonium yang diakumulasikan dalam medium pertumbuhannya dan aktivitas reduksi asetilen (ARA). Akumulasi amonium tertinggi dicapai oleh kultur BGM 1 untuk kultur tunggal (1,86 µm amonium), dan kultur BGM 3/BGM 9 untuk kultur kombinasi (4,905 µm amonium). Aktivitas nitrogenase tertinggi ditunjukkan oleh kombinasi BGM 1/SKM 14 (11,27 µmol/ml kultur/hari), sedangkan aktivitas oksidasi metan tertinggi dicapai oleh kultur campuran BGM 5/BGM 9 (18,20 ppm/ml kultur/hari). Kata kunci: Metan, bakteri metanotrof, ARA, fiksasi nitrogen, oksidasi metan ABSTRACT VINA CHATRINA. N 2 Fixation and Methane Oxidation Effectiveness of Mixed Cultures of Methanotrophic Bacteria from Ricefields. Under supervision of IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA. CH 4 emissions in a rice field and wetlands is mostly produced by methanogenic bacteria and 80% of the CH 4 is oxidized by methanotrophs. Besides of their ability to oxidize methane, methanotrophs also have ability to fix nitrogen. Four selected isolates of methanotrophs which had high nitrogen fixation activity i.e.(bgm 1, BGM 3, BGM 5, and BGM 9 isolates were combined with SKM 14 isolate which had high methane oxidation activity to obtain ideal formulations of the methanotrophs that have high activity of nitrogen fixation and methane oxidation activities. Nitrogen fixation activity was determined by measuring accumulated ammonium in medium and acetylene reduction assay (ARA). The highest concentraion of ammonium on single culture of methanotrophic bacterium was performed BGM 1 isolate (1,86 µm ammonium), and mixed culture of BGM3 and BGM9 isolates had the highest ammonium accumulation (4,905 µm ammonium). The highest nitrogenase activity was performed by mixed culture of BGM1 and SKM14 isolates, it was 11,27 µmol/ml cultures/hour. Whereas the higest methane oxidation was performed by mixed culture of BGM5 and BGM9 isolates, it was 18,20 ppm /ml cultures /day. Keyword: Methane, methanotrophic bacteria, ARA, nitrogen fixation, methane oxidation

3 EFEKTIVITAS FIKSASI N 2 DAN OKSIDASI METAN KULTUR CAMPURAN BAKTERI METANOTROF ASAL SAWAH VINA CHATRINA Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010

4 Judul Nama NIM : Efektivitas Fiksasi N 2 dan Oksidasi Metan Kultur Campuran Bakteri Metanotrof Asal Sawah : Vina Chatrina : G Menyetujui: Pembimbing I, Pembimbing II, (Dr. Ir. Iman Rusmana M.Si) NIP (Alina Akhdiya M.Si) NIP Mengetahui: Kepala Departemen Biologi Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena M.Si NIP Tanggal Lulus:

5 PRAKATA Alhamdulillahirobbil alamin, puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah memberi rahmat dan kemudahan dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah ini berjudul Efektivitas Fiksasi N 2 dan Oksidasi Metan Bakteri Metanotrof Asal Sawah. Karya ilmiah ini memuat kajian tentang reduksi emisi gas rumah kaca (khususnya gas metan) dari lahan sawah. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari sampai Juli 2010 di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. dan Ibu Alina Akhdiya, M.Si. selaku pembimbing atas saran dan bimbingannya dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terimakasih juga kepada Bu Ratna, Bu Rina Kartika, Sheila, Dana, Resti, Magda, Rio, keluarga besar laboratorium mikrobiologi FMIPA IPB, pihak Laboratorium Pengujian BB Pascapanen, pihak Laboratrium GRK Balai Penelitian Lingkungan Pertanian dan teman-taman Biologi 43 atas segala bantuan yang telah diberikan. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada orangtua dan kakakku Rani atas doa, dukungan, dan segala cintanya. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat. Bogor, Oktober 2010 Vina Chatrina

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 15 Desember 1988 dari pasangan Bambang Sudjati dan Linda Syarifah. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Pendidikan dasar diselesaikan penulis di SD Waskito 4 pada tahun 2000, dilanjutkan dengan pendidikan menengah pertama di SLTP Negeri 1 Pamulang dan lulus pada tahun Tahun 2006 penulis menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMA Negeri 29 Jakarta dan pada tahun yang sama diterima sebagai mahasiswa Tingkat Persiapan Bersama Institut Pertanian Bogor (TPB IPB) melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Tahun 2007, penulis diterima sebagai mahasiswa di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai anggota divisi Pengembangan Sumber Daya Mahasiswa (PSDM) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) pada tahun Selain itu, penulis juga aktif mengikuti beberapa kegiatan kepanitian seperti Cosmic 2009 dan Pesta Sains Nasional tahun 2009 dan Penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar Tingkat Persiapan Bersama IPB pada tahun , dan Botani Umum pada tahun Penulis melakukan Praktik Kerja Lapang di Balai Teknologi Lingkungan Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Serpong dari bulan Juli sampai Agustus 2009 dengan judul Uji Hayati Menggunakan Makrofita: Tata Kerja Laboratorium Pengujian dan Pemantapan Prosedur Standar di Balai Teknologi Lingkungan Puspitek, Serpong.

7 v DAFTAR ISI DAFTAR TABEL... vi DAFTAR GAMBAR... vi DAFTAR LAMPIRAN... vi PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan... 1 Waktu dan Tempat... 1 BAHAN DAN METODE... 1 Bahan... 1 Metode... 2 Peremajaan Isolat Aktivitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Tunggal Bakteri Metanotrof Aktivitas Fiksasi N2 Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof Oksidasi Metan Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof HASIL DAN PEMBAHASAN... 3 Hasil... 3 Aktivitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Tunggal Bakteri Metanotrof Aktivitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof... 4 Oksidasi Metan Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof... 4 Pembahasan... 4 SIMPULAN... 5 SARAN... 6 DAFTAR PUSTAKA... 6 LAMPIRAN... 7

8 vi DAFTAR TABEL Tabel 1 Kerapatan sel (OD 620 ) dan akumulasi amonium kultur campuran bakteri metanotrof pada akhir masa inkubasi... 4 Tabel 2 Laju aktivitas enzim nitrogenase pada kultur campuran bakteri metanotrof yang berumur 15 hari... 4 DAFTAR GAMBAR Gambar 1 Pertumbuhan kultur tunggal bakteri metanotrof pada media NMS selama inkubasi... 3 Gambar 2 Hasil reaksi supernatan kultur BGM 9 dengan reagen Cleseri (a) dan BGM 5 hari ke-6 (b) pada analisa kadar amonium Gambar 3 Konsentrasi amonium yang terakumulasi dalam kultur tunggal bakteri metanotrof selama inkubasi... 4 Gambar 4 Laju aktivitas oksidasi metan pada kultur campuran bakteri metanotrof... 4 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Aktifitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Tunggal Bakteri Metanotrof... 8 Lampiran 2. Aktifitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof... 9 Lampiran 3. Laju Aktivitas Oksidasi Metan pada Formulasi Isolat Bakteri Metanotrof... 11

9 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Metan (CH 4 ) merupakan salah satu gas yang berkontribusi terhadap pemanasan global. Intergovernmental Panel of Climate Change (IPCC) 2007, menyatakan bahwa kontribusi metan terhadap pemanasan global menempati urutan kedua. Kontribusi metan terhadap pemanasan global lebih besar dibandingkan dengan CO 2, karena CH 4 lebih efektif menyerap radiasi pada panjang gelombang nm (irradiasi sinar infra merah) dibandingkan dengan CO 2 (Lelieveld et al. 1993; Hanson & Hanson 1996). Sehingga laju peningkatan konsentrasi CH 4 di atmosfer dua kali lipat dibandingkan dengan CO 2. Salah satu sumber utama emisi metan adalah lahan sawah dengan peningkatan konsentrasi gas metan di atmosfer sebesar 60 Tg CH 4 /tahun (IPCC 1996). Mossier et al. (1991), melaporkan bahwa ada beberapa gas yang dapat menimbulkan pemanasan global seperti CH 4 dan N 2 O yang dihasilkan dari lahan sawah. Oleh karena itu, salah satu upaya untuk menurunkan emisi CH 4 dapat dilakukan dengan menurunkan emisi CH 4 dari lahan sawah. Dinamika emisi metan dapat dikendalikan oleh metanogen yaitu mikroba yang memproduksi metan dan metanotrof sebagai bakteri yang menggunakannya sebagai sumber karbon dan energi (Inubushi et al. 2002). Oksidasi CH 4 oleh bakteri metanotrof di lahan sawah dapat mencapai 80% dari CH 4 yang diproduksi oleh bakteri metanogen (Conrad & Rothfus 1991). Bakteri metanogen menggunakan karbon dioksida (CO 2 ), metil (seperti CH 3 OH), dan asetat (CH 3 COO - ) sebagai sumber karbonnya dan kemudian mengubahnya menjadi metan melalui proses yang disebut metanogenesis. Proses oksidasi metan dilakukan oleh bakteri metanotrof pada kondisi aerobik. Menurut Hanson & Hanson (1996), bakteri metanotrof dikelompokkan menjadi tiga yaitu metanotrof tipe I, tipe II, dan tipe X. Pengelompokkan ini berdasarkan atas perbedaan membran internal, lintasan asimilasi formaldehid, dan siklus asam sitratnya. Bakteri metanotrof tipe II dan tipe X memiliki kemampuan untuk memfiksasi N 2. Fiksasi nitrogen merupakan proses perubahan nitrogen dari bentuk N anorganik (dari udara bebas) menjadi amonium sehingga dapat dimanfaatkan sebagai sumber nitrogen oleh tanaman. Informasi tentang karakter bakteri metanotrof asal Indonesia masih sangat sedikit, sehingga penelitian tentang karakter bakteri metanotrof di lahan pertanian sangat diperlukan. Penelitian ini akan menggali hubungan antara aktivitas enzim nitrogenase dan oksidasi metan bakteri metanotrof asal sawah yang diharapkan dapat dimanfaatkan untuk menurunkan emisi metan dari lahan sawah, sekaligus sebagai pupuk hayati untuk mendukung program sistem pertanian ramah lingkungan. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk menentukan efektivitas fiksasi nitrogen (N 2 ) dan oksidasi metan kultur campuran bakteri metanotrof asal sawah. Waktu dan Tempat Penelitian dilakukan pada bulan Februari hingga Juli 2010 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Pengukuran gas metan dilakukan di Laboratorium Gas Rumah Kaca Balai Penelitian Lingkungan Pertanian, Pati, Jawa Tengah. Pengukuran ARA (Acetylene Reduction Assay) dilakukan di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Bogor, Jawa Barat. BAHAN DAN METODE Bahan Bakteri metanotrof yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat BGM 1, BGM 3, BGM 5, BGM 9, dan SKM 14 (Hapsari 2008). Media yang digunakan adalah Nitrate Mineral Salts (NMS) dengan komposisi sebagaimana yang dipaparkan oleh Hanson & Hanson pada tahun 1996 (MgSO 4.7H 2 O 1.0 g/l, CaCl 2.6H 2 O 0.2 g/l, KNO g/l, KH 2 PO g/l, Na 2 HPO g/l, Na 2 EDTA 0.5 g/l, FeSO 4.7H 2 O 0.2 g/l, H 3 BO g/l, CoCl 2.6H 2 O 0.02 g/l, ZnSO 4.7H 2 O 0.01 g/l, MnCl 2.4H 2 O 3.0 mg/l, Na 2 MoO 4.2H 2 O 3.0 mg/l, NiCl 2.6H 2 O 2.0 mg/l, CaCl 2.2H 2 O 1.0 mg/l), dan NMS tanpa nitrat. Selain bahanbahan tersebut, dalam penelitian ini juga digunakan Bacto agar 20 g/l, metanol 1 %, gas metan dan asetilen, larutan NH 4 Cl 100 ppm, larutan fenol alkohol (C 6 H 5 OH) 10%, larutan Natrium Dihidro Nitroprusid 0,5%, dan larutan oksidan yang terdiri atas Natrium Sitrat 20% dan Natrium Hipoklorit 5,25%.

10 2 Metode Peremajaan Isolat. Isolat BGM 1, BGM 3, BGM 5, BGM 9, dan SKM 14 diremajakan pada medium agar Nitrate Mineral Salts (NMS) + 1% metanol dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5-7 hari (Hanson 1998). Koloni-koloni yang tumbuh terpisah kemudian digores kembali sampai didapatkan kultur yang murni. Isolat murni yang didapat disimpan pada medium agar miring NMS yang diberi 1 % metanol, sebagai biakan stok. Isolat BGM 1 dan BGM 3 merupakan bakteri metanotrof tipe II. Isolat BGM 1 digolongkan ke dalam spesies Methylocystis rosea, isolat BGM 3 digolongkan ke dalam spesies Methylocystis parvus. Isolat BGM 9 merupakan bakteri metanotrof tipe X, dan digolongkan ke dalam spesies Methylococcus capsulatus. Sedangkan isolat SKM 14 merupakan bakteri metanotrof tipe I yang termasuk ke dalam spesies Methylobacter sp (Astuti 2009) Aktivitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Tunggal Bakteri Metanotrof. Sebanyak 1-2 lup isolat bakteri metanotrof yang terdiri dari isolat BGM 1, BGM 3, BGM 5, BGM 9 dan SKM 14, masing-masing diinokulasikan ke dalam 11 ml medium NMS cair bebas nitrogen + 1% metanol dalam tabung 17 ml bersumbat karet, lalu diinkubasi selama 15 hari di atas shaker pada suhu ruang. Pertumbuhan sel bakteri diamati pada 0, 3, 6, 9, 12, dan 15 hari inkubasi dengan mengukur Optical Density (OD) nya menggunakan spektrofotometer (vis Genesys 20 Prancis λ nm) pada panjang gelombang 620 nm dengan blanko medium NMS cair. Aktivitas fiksasi N 2, dalam masingmasing kultur selama masa inkubasi (hari ke- 0, 3, 6, 9, 12, dan 15) diukur berdasarkan kadar amonium yang diakumulasikan kultur bakteri metanotrof. Sebanyak 5 ml sampel kultur disentrifuse pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian, 3 ml supernatan tersebut ditambah dengan 0,12 ml fenol alkohol 10% selanjutnya divortex hingga homogen. Campuran tersebut ditambah dengan 0.12 ml larutan Na- Dihidronitroprusit 0,5%, dan divortex kembali hingga homogen. Setelah homogen, campuran tersebut ditambah dengan 0,3 ml campuran Na-sitrat : NA-hipoklorit (1:4). Lalu didiamkan selama satu jam sampai warnanya berubah menjadi biru (Cleseri et al. 1989). Campuran reaksi tersebut diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 640 nm. Amonium terakumulasi dihitung dengan menggunakan rumusan persamaan berikut ini : [amonium ] = BM NH 4 Cl Keterangan : a & b = konstanta pada persamaan linier kurva standar NH 4 Cl y = OD amonium sampel F.P = faktor pengenceran BM NH 4 Cl = bobot molekul NH 4 Cl (53,5) Aktivitas Fiksasi N2 Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof. Masing-masing isolat BGM 1, BGM 3, BGM 5, dan BGM 9 dikombinasikan dengan isolat SKM 14, sedangkan isolat BGM 1, BGM 3, dan BGM 5 masing-masing dikombinasikan dengan BGM 9. Sebanyak 1 ml kultur BGM 1 diformulasikan dengan 1 ml kultur SKM 14 ke dalam tabung dengan tutup butyl rubber septum yang berisi 9 ml media cair NMS steril tanpa mengandung unsur N, lalu diinkubasi selama 15 hari di atas shaker pada suhu ruang. Kerapatan selnya diukur menggunakan spektrofotometer vis Genesys 20 Prancis λ nm pada OD 620 dengan blanko medium NMS cair, pada akhir masa inkubasi. Begitu pula dengan campuran isolat BGM 3 dengan SKM 14, BGM 5 dengan SKM 14, BGM 9 dengan SKM 14, BGM 1 dengan BGM 9, BGM 3 dengan BGM 9, dan BGM 5 dengan BGM 9. Kemampuan fiksasi nitrogen pada kultur campuran bakteri metanotrof diukur berdasarkan akumulasi amonium dalam kultur dan nilai ARA (Acetylene Reduction Assay). Pengukuran akumulasi amonium pada kultur campuran bakteri metanotrof, dilakukan dengan cara yang sama seperti pada pengukuran kadar amonium yang diakumulasi pada isolat tunggal. Pengukuran amonium terakumlasi pada kultur campuran bakteri metanotrof ini dilakukan pada akhir masa inkubasi. Uji ARA (Barber et al. 1976) dilakukan pada kultur yang ditumbuhkan dalam medium cair yang berumur 15 hari. Uji ini didasarkan atas reduksi C 2 H 2 menjadi C 2 H 4 yang dikatalis oleh enzim nitrogenase. Sebanyak 1-2 lup isolat kultur campuran bakteri metanotrof diinokulasi ke 5 ml media NMS cair bebas nitrogen + 1% metanol dalam

11 3 tabung 15 ml yang ditutup sumbat karet. Setelah diinkubasi, udara dikeluarkan lalu diganti dengan menginjeksikan gas asetilen dengan volume yang sama. Setelah diinkubasi selama satu jam, aktivitas reduksi asetilena diukur menggunakan alat Kromatografi Gas. Oksidasi Metan Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof. Aktivitas oksidasi CH 4 diukur dengan cara mengukur konsentrasi gas metan tersisa pada bagian headspace menggunakan teknik kromatografi gas seperti yang dipaparkan oleh Kumaraswamy et al. (2001). Sebanyak 1,1 ml kultur cair bakteri metanotrof diinokulasikan ke 9,9 ml medium NMS dalam tabung 17 ml yang ditutup sumbat karet. Komposisi gas di headspace tabung dibuat menjadi 50% metan dan 50% udara. Sebagai kontrol, digunakan tabung berisi 11 ml media NMS dengan komposisi headspace yang sama. Inkubasi dilakukan selama 15 hari di atas shaker pada suhu ruang (27-30 C) dan dalam kondisi gelap. Pengukuran konsentrasi metan tersisa dilakukan pada akhir masa inkubasi. HASIL DAN PEMBAHASAN Kerapatan Sel (OD 620 ) E Waktu inkubasi (hari ke-) BGM 1 BGM 3 BGM 5 BGM 9 SKM 14 Gambar 1 Pertumbuhan kultur tunggal bakteri metanotrof pada media NMS selama inkubasi Uji amonium terhadap kultur tunggal bakteri metanotrof dengan metode Cleseri et al. (1989), menunjukkan perubahan warna campuran reaksi menjadi biru setelah ditambah reagen. Perubahan warna ini menunjukkan keberadaan amonium dalam kultur bakteri metanotrof yang diuji (Gambar 2). Hasil Aktivitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Tunggal Bakteri Metanotrof. Kultur tunggal bakteri metanotrof ditumbuhkan pada media NMS cair tanpa nitrogen, dan diinkubasi selama 15 hari pada suhu C. Hasil pengukuran kerapatan sel (OD 620 ) selama inkubasi kultur tunggal bakteri metanotrof menunjukkan profil pertumbuhan yang berbeda (Gambar 1). Pertumbuhan sel isolat BGM 1 mengalami kenaikan hingga hari ke-9 masa inkubasi, serta pada hari ke-15 dengan nilai OD 620 masing-masing sebesar 0,031 dan 0,038. Isolat BGM 3 dan BGM 5 juga menunjukan profil pertumbuhan yang mirip dengan isolat BGM 1. Berbeda dengan ketiga isolat sebelumnya, pertumbuhan kultur tunggal isolat BGM 9 terlihat terus meningkat sampai akhir inkubasi. Kerapatan sel tertinggi dari kultur tunggal bakteri metanotrof dicapai oleh isolat BGM 3 dengan nilai OD 620 sebesar 0,044. (a) (b) Gambar 2 Hasil reaksi supernatan kultur BGM 9 dengan reagen Cleseri (a) dan BGM 5 hari ke-6 (b) pada analisa kadar amonium. Akumulasi amonium tertinggi pada kultur BGM 1 dan BGM 3 terjadi pada hari ke-9, dengan nilai 1,96 µm dan 1,595 µm. Sedangkan pada isolat BGM 5 dan BGM 9, konsentrasi amonium terakumulasi yang tertinggi terjadi pada hari ke-15, yaitu sebesar 0,305 µm dan 1,84 µm. Diantara keempat isolat tersebut, konsentrasi amonium terakumulasi tertinggi dicapai oleh isolat BGM 1 (Gambar 3).

12 4 yaitu sebesar 11,27 µmol/jam/ml kultur, sedangkan aktivtas nitrogenase terendah dimiliki oleh kultur campuran BGM 5 dengan SKM 14, yaitu sebesar 0,98 µmol/jam/ml kultur. Gambar 3 Konsentrasi amonium yang terakumulasi dalam kultur tunggal bakteri metanotrof selama inkubasi Aktivitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof Kemampuan fiksasi nitrogen pada kultur campuran bakteri metanotrof diukur berdasarkan akumulasi amonium dalam kultur dan nilai ARA (Acetylene Reduction Assay). Tabel 1 menunjukkan kultur campuran BGM 3 dengan BGM 9 menunjukkan kerapatan sel tertinggi (OD 620 0,055) dan konsentrasi amonium tertinggi (4,905 µm) pada akhir inkubasi. Sedangkan kerapatan sel bakteri terendah ditunjukkan oleh kultur campuran BGM 9 dengan SKM 14 dengan nilai OD 620 0,041, dan akumulasi amonium terendah dihasilkan oleh kultur campuran BGM 1 dengan BGM 9, yaitu sebesar 1,775 µm (Tabel 1). Tabel 1 Kerapatan sel (OD 620 ) dan akumulasi amonium kultur campuran bakteri metanotrof pada akhir masa inkubasi No. Isolat Kerapat an sel OD 620 Amonium terakumulasi (µm) 1 BGM 1 + SKM 14 0,052 4,170 2 BGM 3 + SKM 14 0,054 4,535 3 BGM 5 + SKM 14 0,052 4,165 4 BGM 9 + SKM 14 0,041 2,755 5 BGM 1 + BGM 9 0,044 1,775 6 BGM 3 + BGM 9 0,055 4,905 7 BGM 5 + BGM 9 0,047 2,755 Aktivitas fiksasi nitrogen juga dapat diukur berdasarkan nilai aktivitas enzim nitrogenase menggunakan uji ARA. Tabel 2. merupakan tabel hasil uji ARA terhadap kultur campuran bakteri metanotrof. Aktivitas nitrogenase tertinggi terdapat pada kultur campuran BGM 1 dengan SKM 14 Tabel 2 Laju aktivitas enzim nitrogenase pada kultur campuran bakteri metanotrof yang berumur 15 hari No. Isolat Laju Aktivitas Nitrogenase (µmol/jam/ml kultur) 1 BGM 1 + SKM 14 11,27 2 BGM 3 + SKM 14 2, 28 3 BGM 5 + SKM 14 0,98 4 BGM 9 + SKM 14 1,84 5 BGM 1 + BGM 9 1,35 6 BGM 3 + BGM 9 3,02 7 BGM 5 + BGM 9 1,72 Oksidasi Metan Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof Hasil uji aktivitas oksidasi metan menggunakan kromatografi gas menunjukkan bahwa seluruh isolat yang digunakan mampu mengoksidasi metan. Aktivitas oksidasi metan tertinggi terdapat pada kultur campuran BGM 5 dan BGM 9, yaitu sebesar 18,20 ppm/ml kultur/hari dan aktivitas oksidasi metan terendah dimiliki oleh kultur campuran BGM 1 dan SKM 14, yaitu sebesar 5,37 ppm/ml kultur/hari (Gambar 4). Laju Aktivitas oksidasi Metan (ppm/ml kultur/hari) 25,000 20,000 15,000 10,000 5, ,37 BGM 1 + SKM 14 6,20 BGM 3 + SKM 14 9,70 BGM 5 + SKM 14 6,74 BGM 9 + SKM 14 Isolat 15,63 BGM 1 + BGM 9 Gambar 4 Laju aktivitas oksidasi metan pada kultur campuran bakteri metanotrof Pembahasan Profil pertumbuhan kultur tunggal bakteri metanotrof (Gambar 1) menunjukkan bahwa rata-rata kultur bakteri ini tumbuh dengan baik setelah 9-15 hari inkubasi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Begonja dan Hrsák (1998) yang menyatakan bahwa metanotrof merupakan bakteri yang tumbuh lambat. 8,01 18,20 BGM 3 + BGM 5 + BGM 9 BGM 9

13 5 Metanotrof merupakan kelompok bakteri yang mampu pengoksidasi metan. Sebagian metanotrof juga mampu melakukan fiksasi nitrogen dari udara. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, SKM 14 merupakan isolat yang memiliki aktivitas oksidasi metan tertinggi diantara isolat bakteri metanotrof yang yang diuji. Sedangkan isolat BGM 1, BGM 3, BGM 5 dan BGM 9 menunjukkan kemampuan akumulasi amonium dalam medium pertumbuhan lebih tinggi dibandingkan dengan isolat-isolat lainnya (Hapsari 2008). Kemampuan fiksasi nitrogen bakteri dapat diukur diantaranya dengan pengukuran amonium yang terakumulasi dalam medium pertumbuhannya atau dengan pengukuran aktivitas reduksi asetilen (ARA). Nilai ARA menunjukkan aktivitas enzim nitrogenase dalam mengkatalisis reaksi perubahan ikatan ganda pada substrat analog (asetilen) menjadi ikatan tunggal (pada etilen). Akurasi analisa reduksi asetilen untuk mengukur kemampuan fiksasi nitrogen lebih tinggi dibandingkan dengan dengan amonium terakumulasi. Hal ini disebabkan karena amonium dalam medium atau kultur dapat digunakan sebagai sumber nitrogen untuk pertumbuhan bakteri. Kadar amonium terendah pada kultur tunggal terdapat pada kultur tunggal BGM 5, sedangkan kadar amonium tertinggi dicapai oleh kultur BGM 1 (Gambar 3). Akumulasi amonium tertinggi pada kultur campuran, dicapai oleh kombinasi BGM 3 dengan BGM 9, sedangkan akumulasi amonium terendah ditunjukkan oleh kultur campuran BGM 1 dengan BGM 9. Perbedaan kadar amonium yang diakumulasi diantaranya dapat dipengaruhi oleh penggunaan amonium untuk pertumbuhan bakteri serta aktivitas enzim nitrogenase yang dimiliki masing-masing isolat. Aktivitas nitrogenase akan terhambat apabila terdapat oksigen. Bakteri metanotrof tipe II umumnya hanya mampu memfiksasi nitrogen pada kondisi mikroaerofil (Murrel and Dalton 1983). Proses fiksasi nitrogen pada bakteri metanotrof dikatalisis oleh kompleks enzim nitrogenase. Enzim ini sangat peka terhadap keberadaan oksigen yang tinggi. Konsentrasi oksigen yang tinggi akan menghambat ekspresi gen nifd dan nifh yang menyandikan enzim nitrogenase (Auman et al. 2001). Oleh karena itu oksigen dibutuhkan dalam jumlah sedikit untuk kecepatan fiksasi nitrogen maksimum (James & Olivares 1997). Hasil uji ARA menunjukkan aktivitas nitrogenase tertinggi terdapat pada kultur campuran BGM1 dan SKM 14, sedangkan aktivitas nitrogenase terendah dimiliki oleh kultur campuran BGM 5 dengan SKM 14. Oksidasi metan merupakan langkah awal dari metabolisme bakteri metanotrof untuk menghasilkan energi. Proses metabolisme ini melibatkan beberapa enzim penting. Metan monooksidase (MMO) merupakan enzim yang berperan dalam oksidasi metan. Enzim ini mengkonversi metan menjadi metanol. Metanotrof mempunyai dua tipe MMO yaitu soluble MMO (smmo) dan particulate MMO (pmmo). Enzim pmmo mengkatalisis proses oksidasi metan menjadi metanol, sedangkan smmo lebih efektif dalam mengkatalisis beberapa proses transformasi. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa BGM 9 dan SKM 14 merupakan 2 isolat yang memiliki aktivitas oksidasi metan lebih tinggi dibandingkan dengan isolat lainnya (Hapsari 2008), sedangkan isolat BGM 9 merupakan isolat dengan kemampuan fiksasi nitrogen paling tinggi (Maisaroh 2010). Akan tetapi dari hasil penelitian ini, kombinasi isolat BGM 9 dan SKM 14 menghasilkan aktivitas oksidasi metan dan fiksasi nitrogen yang rendah. Hal ini diduga karena media yang digunakan dalam penelitian ini tidak mengandung sumber nitrogen sedangkan SKM 14 tidak mampu memfiksasi N 2 dari udara. Nitrogen merupakan komponen utama protein dan asam nukleat, dan nitrogen merupakan makromolekul untuk pembangun sel. Pasokan nitrogen pada kultur kombinasi ini hanya diperoleh dari hasil fiksasi nitrogen isolat BGM 9. Keterbatasan sumber N ini diduga menyebabkan SKM 14 tidak dapat memenuhi kebutuhan nitrogen untuk metabolisme, pertumbuhan dan sintesis protein termasuk enzim MMO yang dibutuhkan untuk proses oksidasi metan. Berdasarkan hasil penelitian ini, belum dapat diambil kesimpulan secara menyeluruh mengenai kultur campuran bakteri metanotrof yang terbaik, yang dapat mengoksidasi metan serta dapat memfiksasi nitrogen. SIMPULAN Isolat BGM 1, BGM 3, BGM 5, dan BGM 9 merupakan bakteri metanotrof yang mampu melakukan fiksasi nitrogen. Kemampuan akumulasi amonium tertinggi pada kultur tunggal bakteri metanotrof dicapai

14 6 oleh isolat BGM 1 pada hari ke 9 yaitu sebesar 1,96 µm. Sedangkan akumulasi amonium tertinggi pada kultur campuran bakteri metanotrof dicapai oleh campuran BGM 3 dengan BGM 9, sebesar 4,905 µm. Aktivitas reduksi asetilen (ARA) enzim nitrogenase pada kultur campuran tertinggi dicapai oleh kultur campuran BGM 1 dengan SKM 14 yaitu sebesar 11,27 µmol/jam/ml kultur. Aktivitas oksidasi metan oleh kultur campuran BGM 5 dengan BGM 9 memiliki nilai tertinggi yaitu 18,20 ppm/ml kultur/hari. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai karakteristik molekular dari gen yang menyandikan enzim nitrogenase dan metan monooksidase (MMO). DAFTAR PUSTAKA Astuti DD Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekular Isolat-Isolat Bakteri Metanotrof Asal Sawah Wilayah Bogor dan Sukabumi [skripsi]. Bogor: Fakultas MIPA, Insitut Pertanian Bogor Auman Aj, Speake CC, Lidstrom ME NifH sequence and nitrogen fixation in type I and type II Methanotrophs. Appl Environ Microbiol 67: Barber LE, Tjepkema JD, Russel SA, and Evans HJ Acetylene reduction (Nitrogen Fixation) associated with corn inoculated with Spirillum. Appl Environ Microbiol 32 (1) : Begonja A, Hrsák D Growth characteristics and metabolic activities of the methanotrophic-heterotrophic groundwater community. J Appl Microbiol 85: Bender M, Conrad R Kinetics of methane oxidation in toxic soils. Chemosphere 26: Cleseri LS, Greenberg AE and Trussel RR Standard Method For The Examination of Water and Waste Water. Port City Press. Baltimore Conrad R, Rothfus F Methane Oxidation in the Soil Surface Layer of a Flooded Rice Field and the Effect of Ammonium. Biol Fertil Soil 12: Hanson RS Ecology of methylotrophic bacteria. In : Burlage RS, Atlas R, Stahl, Geesey G, Deyler G, editor. Techniques in Microbial Ecology. Oxford: Oxford University Press. Page Hanson R, Hanson TE Metanotrophic bacteria. J Microbiol Rev 60: Hapsari W Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Metanotrof Asal Sawah di Bogor dan Sukabumi [skripsi]. Bogor: Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor [IPCC] Intergovernmental Panel on Climate Change Greenhouse Gas Inventory Reference Manual (Revised). Cambridge: Cambridge University Press The Physical Science Basis. Cambridge: Cambridge University Press. Inubushi K, H. Sugii, I. Watanabe, and R. Wassmann Evaluation of methane oxidation in rice plant-soil system. Nutrient Cycling in Agroecosystems 64: James E, Olivares FL Infection and colonization of sugarcane and other graminaceous plants by endophytic diazotrophs. Plant science 17: Kumaraswamy S, Ramakrishnan B, Sethunathan N Methane production and oxidation in annoxic rice soil as influenced by inorganic redox species. J Environ Quality 30 : Lelieveld J, Crutzen PJ, Bruhl C Climate Effects of Atmospheric Methane. Chemosphere 26: Maisaroh Aktivitas Enzim Nitrogenase dan Oksidasi Metan Bakteri Metanotrof Asal Sawah [tesis]. Bogor: Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor Mosier A, D. Schimel, D. Valentine, K. Bronson, and W. Parton Methane and nitrous oxide fluxes in native, fertilized and cultivated grassland. Nature 350: Murrell JC, Dalton, H Nitrogen fixation in obligate methanotrophs. J of Gen Microbiol 129:

15 LAMPIRAN 7

16 8 Lampiran 1. Aktifitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Tunggal Bakteri Metanotrof Lampiran 1.1 Hasil pengukuran Optical Density (OD) isolat tunggal bakteri metanotrof pada media NMS pada suhu C, pada hari ke- 0, 3, 6, 9, 12, dan 15 Isolat Kontrol 0,006 Hari ke BGM 1 a 0,014 0,019 0,019 0,031 0,029 0,039 BGM 1 b 0,020 0,017 0,019 0,032 0,029 0,038 BGM 3 a 0,013 0,013 0,014 0,025 0,027 0,048 BGM 3 b 0,011 0,012 0,022 0,027 0,027 0,040 BGM 5 a 0,008 0,020 0,018 0,031 0,009 0,034 BGM 5 b 0,007 0,014 0,019 0,007 0,022 0,025 BGM 9 a 0,011 0,011 0,015 0,024 0,029 0,042 BGM 9 b 0,010 0,014 0,016 0,020 0,029 0,033 SKM 14 a 0,010 0,012 0,013 0,013 0,033 0,029 SKM 14 b 0,009 0,009 0,009 0,014 0,031 0,036 Standar Deviasi Standar Error 0, , , , , , , , , ,00449 Lampiran 1.2 Hasil pengukuran kadar amonium (µm) pada kultur bakteri tunggal metanotrof pada media NMS pada suhu C, pada hari ke 0, 3, 6, 9, 12, dan 15. Standar Standar Akumulasi Amonium (µm) Isolat Deviasi Error BGM 1 a 0 0 1,23 1,96 0,61 1,23 BGM 1 b 0 0 1,96 1, BGM 3 a 0 0 0,61 1,96 0 1,96 BGM 3 b , BGM 5 a BGM 5 b ,61 BGM 9 a ,61 0 3,68 BGM 9 b ,96 0,61 0 0,839 0,343 0,666 0,272 0,125 0,051 0,796 0,325

17 9 Lampiran 2. Aktifitas Fiksasi N 2 Pada Kultur Campuran Bakteri Metanotrof Lampiran 2.1 Hasil pengukuran kerapatan sel (OD) dan kadar amonium pada kultur campuran isolat bakteri metanotrof dengan masa inkubasi 15 hari Isolat OD 620 Rata-rata (OD 620 ) Standar Deviasi Standar Error Kadar amonium (µm) Rata-rata Kadar amonium (µm) BGM 1 + SKM 14 a 0,055 0,052 4,17 4, BGM 1 + SKM 14 b 0,049 4,17 BGM 3 + SKM 14 a 0,055 0,054 4,90 4,535 0,516 0,365 BGM 3 + SKM 14 b 0,053 4,17 BGM 5 + SKM 14 a 0,052 0,052 4,90 4,165 1,039 0,735 BGM 5 + SKM 14 b 0,052 3,43 BGM 9 + SKM 14 a 0,04 0,041 3,43 2,755 0,955 0,675 BGM 9 + SKM 14 b 0,042 2,08 BGM 1 + BGM 9 a 0,047 0,044 1,47 1,775 0,431 0,305 BGM 1 + BGM 9 b 0,041 2,08 BGM 3 + BGM 9 a 0,058 0,0545 6,38 4,905 2,09 1,47 BGM 3 + BGM 9 b 0,051 3,43 BGM 5 + BGM 9 a 0,047 0,0465 2,08 2,755 0,955 0,675 BGM 5 + BGM 9 b 0,046 3,43

18 10 Lampiran 2.2 Hasil pengukuran aktivitas nitrogenase pada kultur campuran isolat bakteri metanotrof yang berumur 15 hari Isolat Konsentrasi Aktivitas Laju Aktivitas Nitrogenase Rata-rata Laju Aktivitas Standar Deviasi Standar Error Nitrogenase (ppm) µmol/jam/ml kultur Nitrogenase (µmol/jam/ml kultur) BGM 1 + SKM 14 a 248,31 17,74 0, ,00647 BGM 1 + SKM 14 b 67,12 4,79 11,27 BGM 3 + SKM 14 a 42,84 3,06 BGM 3 + SKM 14 b 20,97 1,50 BGM 5 + SKM 14 a 18,31 1,31 BGM 5 + SKM 14 b 9,26 0,66 BGM 9 + SKM 14 a 22,07 1,58 BGM 9 + SKM 14 b 29,43 2,10 BGM 1 + BGM 9 a 13,39 0,96 BGM 1 + BGM 9 b 24,44 1,75 BGM 3 + BGM 9 a 51,89 3,71 BGM 3 + BGM 9 b 32,67 2,33 BGM 5 + BGM 9 a 13,86 0,99 BGM 5 + BGM 9 b 34,3 2,45 2,28 0,98 1,84 1,35 3,02 1,72 0, , , , , , , , , , , , Contoh Perhitungan : Pada kultur campuran BGM 1+SKM14 a 1 ppm = BM C 2 H 4 = 28 Volume larutan = 5 ml Masa inkubasi = 1 jam Aktivitas nitrogenase BGM1+SKM14 a = 248,31 ppm = = 2,4831 mmol Laju aktivitas nitrogenase = Laju aktivitas nitrogenase = = 17,74 µmol/ml kultur/jam

19 11 Lampiran 3. Laju Aktivitas Oksidasi Metan pada Formulasi Isolat Bakteri Metanotrof Isolat Peak Area Konsentrasi CH 4 (ppm) Kontrol ,2 Laju Oksidasi CH 4 (ppm/ml kultur/hari) Rata-rata Laju Oksidasi CH 4 (ppm/ml kultur/hari) Standar Deviasi Standar Error BGM 1 + SKM 14 a ,9 3,94 5,37 0, ,00647 BGM 1 + SKM 14 b ,4 6,79 BGM 3 + SKM 14 a ,3 8,29 6,20 0, , BGM 3 + SKM 14 b ,2 4,11 BGM 5 + SKM 14 a ,2 10,76 9,70 0, , BGM 5 + SKM 14 b ,9 8,63 BGM 9 + SKM 14 a ,9 6,59 6,74 0, , BGM 9 + SKM 14 b ,88 BGM 1 + BGM 9 a ,9 8,92 15,63 0, , BGM 1 + BGM 9 b ,33 BGM 3 + BGM 9 a ,4 4,54 8,01 0, , BGM 3 + BGM 9 b ,5 11,48 BGM 5 + BGM 9 a ,8 22,74 18,20 0, , BGM 5 + BGM 9 b ,7 13,65 Contoh Perhitungan : Pada kultur campuran BGM 1 + SKM 14 a Volume headspace tabung = 6 ml Volume larutan = 11 ml Masa inkubasi = 15 hari Kontrol = 5164,2 ppm [CH 4 ]BGM 1 + SKM 14 a = 5055,9 ppm Laju Oksidasi Metan = Laju Oksidasi Metan = = 3,94 ppm/ml kultur/hari