LAMPIRAN 9
10 Lampiran 1 Komposisi Media, Pereaksi, dan Bufer yang Digunakan Tabel 4 Komposisi media CMC (Carboxy Methyl Cellulosa) Bahan Jumlah CMC 1 g MgSO 4.7H 2 O 0.02 g KNO 3 0.075 g K 2 HPO 4 0.05 g FeSO 4.7H 2 O 0.02 g CaCl 2 0.004 g Ekstrak khamir 0.2 g Serbuk agar 1.5 g Glukosa 0.1 g Akuades ditera sampai 100 ml Tabel 5 Komposisi media MRS (deman, Rogosa and Sharpe) Bahan Protease pepton Ekstrak daging Ekstrak khamir Dekstrosa Polisorbat 80 Amonium sitrat Sodium asetat Magnesium sulfat Mangan sulfat Dipotassium fosfat Akuades Jumlah 1 g 1 g 0.5 g 2 g 0.1 g 0.2 g 0.5 g 0.01 g 0.005 g 0.2 g ditera sampai 100 ml Tabel 6 Komposisi media PDA (Potato Dextrose Agar) Bahan Jumlah PDA 3.9 g Asam tartrat 0.15 g Akuades ditera sampai 100 ml Tabel 7 Komposisi pereaksi DNS (Dinitrosalicylic Acid) Bahan Jumlah NaOH 2.5 g KNa tartrat 45.5 g Na 2 SO 3 0.125 g Akuades ditera sampai 250 ml Tabel 8 Komposisi pereaksi Bradford Bahan Jumlah CBB G-250 0.01 g Etanol 95% 5 ml Asam fosfat 10 ml Akuades ditera sampai 100 ml
11 Tabel 9 Komposisi larutan buffer ph 3.5, 5, dan 8 untuk 50 ml bufer ph 3.5 5 8 Komposisi 35.9 ml asam sitrat 0.2 M + 14.1ml Na 2 HPO 4. 2H 2 O 0.2 M 24.3 ml asam sitrat 0.2 M + 25.7 ml Na 2 HPO 4. 2H 2 O 0.2 M 0.72 g Tris 0.2 M + 50 ml H 2 O + HCl 0.1 M
12 Lampiran 2 Pengukuran Aktivitas Enzim Harian Selulase pada Substrat Ubi Kayu 1% Pengukuran aktivitas enzim harian dilakukan berdasarkan pembentukan gula pereduksi selama waktu inkubasi (Miller 1959) ). Berikut adalah tahapan dalam pengukuran aktivitas enzim harian. Sampel Kontrol Blanko 0.5 ml EEK 0.5 ml substrat ubi kayu 0.5 ml substrat ubi kayu 1 ml DNS 0.5 ml substrat ubi kayu 1 ml DNS Homogenisasi 0.5 ml EEK 0.5 ml akuades Inkubasi 1 jam suhu optimum Homogenisasi Homogenisasi 1 ml DNS Inkubasi pada 100 o C 15 menit Inkubasi pada 100 15 menit o C Homogenisasi Pengukuran absorbansi pada λ 540 nm Pengukuran absorbansi pada λ 540 nm Inkubasi pada 100 15 menit o C Pengukuran absorbansi pada λ 540 nm Keterangan : EEK Suhu Optimum : Enzim Ekstrak Kasar : C4-4 C = 70 C C5-1 C = 90 C C5-3 C = 80 C C11-1 = 70 C Nilai absorbansi blanko digunakan untuk mengurangi nilai absorbansi sampel dan kontrol menjadi nilai absorban sampel dan kontrol terkoreksi. Absorbansi terkoreksi dimasukkan ke dalam kurva standar glukosa sebagai nilai Y untuk memperoleh nilai X (konsentrasi gula pereduksi). Berikut adalah kurva standar glukosa: Ansorbansi (λ= 540 nm) 1.5 1 0.5 0-0.5 Kurva standar glukosa y = 2.064x - 0.078 R² = 0.993 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Konsentrasi (mg/ml)
13 Lampiran 3 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Bradford (1976) Komposisi reagen Bradford CBB6-250...0.05 g Etanol 95%...25 ml H 3 PO 3...50 ml Akuades...500 ml Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara mengambil 0.4 ml sampel dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 4 ml larutan Bradford dan divortex. Selanjutnya larutan dibiarkan selama 15 menit dan diukur menggunakan spektrofotometer pada λ = 595 nm. Nilai absorbansi yang dihasilkan kemudian dimasukkan ke dalam persamaan linier dari kurva standar protein. Penentuan Kurva Standar Protein Larutan stok BSA diambil 0 ml, 0.08 ml, 0.16 ml, 0.32 ml, 0.4 ml masing-masing ditempatkan pada tabung reaksi. Masing-masing larutan tersebut ditambahkan akuades hingga volumenya menjadi 0.4 ml. Pada setiap tabung reaksi kemudian ditambahkan 4 ml larutan Bradford dan dikocok. Selanjutnya larutan dibiarkan selama 15 menit dan diukur menggunakan spektrofotometer pada λ 595 nm. Berikut merupakan kurva standar protein: Absorbansi (λ= 575 nm) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Kurva Standar Protein y = 2.988x + 0.291 R² = 0.988 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Konsentrasi BSA (mg/ml)
14 Lampiran 4 Metode Analisa Cairan Fermentasi 1. Pengukuran derajat keasaman (ph) sampel Sebanyak 100 ml cairan fermentasi dimasukkan ke dalam gelas piala. Derajat keasaman sampel cairan diukur menggunakan ph meter yang sudah dikalibrasi. 2. Penentuan total asam dengan metode titrasi (AOAC 1995) Sampel sebanyak 50 ml cairan fermentasi ditera dengan aquades sampai 250 ml. Sampel yang telah dicampur kemudian dihomogenisasi. Sebanyak 100 ml cairan diambil dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. Kemudian diberi indikator phenolphtalein dan dititrasi dengan NaOH 0.1 N yang sudah distandarisasi. Total asam pada sampel diketahui dengan melihat volume NaOH yang terpakai. Nilai total asam yang diperoleh dinyatakan dalam satuan ml NaOH 0.1 N/100 ml. 3. Pengukuran Kadar Total Gula dengan Metode Fenol-H2SO4 (Dubois et al. 1956) Penentuan Kadar Total Gula Penentuan kadar total gula dilakukan dengan cara mengambil 1 ml sampel hidrolisis ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 0.5 ml fenol 5 % kemudian dikocok, dan ditambahkan 2.5 ml H 2 SO 4 pekat. Selanjutnya larutan dibiarkan selama 10 menit, dikocok dan diukur dengan spektrofotometer pada λ 490 nm. Nilai absorbansi yang dihasilkan kemudian dimasukkan kedalam persamaan linear dari kurva standar total gula. Penentuan Kurva Standar Total Gula Larutan stok glukosa diambil 0 ml, 0.1 ml, 0.2 ml, 0.4 ml, 0.5 ml, 0.6 ml, 0.6 ml, 0.7 ml, 0.8 ml, masing-masing ditempatkan dalam tabung reaksi. Masing-masing larutan tersebut ditambahkan akuades hingga volumenya menjadi 1 ml. Pada setiap tabung reaksi kemudian ditambahkan 0.5 ml fenol 5% dan 2.5 ml H 2 SO 4 pekat. Selanjutnya larutan didiamkan hingga dingin. Setelah dingin, larutan diukur dengan spektrofotometer pada λ = 490 nm. Berikut merupakan kurva standar glukosa: Kurva Standar Glukosa Absorbansi (λ=490 nm) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0-0.1 y = 1.048x - 0.03 R² = 0.990 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Konsentrasi (mg/ml)
15 4. Penentuan jumlah mikroorganisme menggunakan metode cawan tuang (FDA 2001) Sebanyak 100 µl sampel diambil dan dilakukan pengenceran pada tingkat yang dikehendaki. Diambil dua tingkat pengenceran dari masing-masing sampel. Sebanyak 100 µl sampel dimasukkan ke dalam cawan yang telah berisi media pertumbuhan. Analisa bakteri selulolitik menggunakan media CMC, bakteri asam laktat menggunakan media MRS, dan khamir menggunakan media PDA. Selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang selama 24-48 jam dan dilakukan penghitungan jumlah koloni. Koloni yang dapat dihitung adalah kisaran 25-250 koloni per ml. Jumlah koloni/ml (N) = +(0.1 x n2)) x d Keterangan: N = Jumlah koloni per ml sampel Σ C = Jumlah koloni dari seluruh cawan n 1 n 2 d = Jumlah cawan pada pengenceran pertama = Jumlah cawan pada pengenceran kedua = Pengenceran pertama yang terdapat koloni untuk dihitung
16 Lampiran 5 Metode Analisa Mutu Tepung Kasava Terfermentasi 1. Analisa kadar air (AOAC 1995) Cawan alumunium yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya diisi sebanyak 2 g sampel lalu ditimbang (W1) kemudian dimasukkan ke dalam oven suhu 105 0 C selama 1-2 jam. Cawan alumunium dan sampel yang telah dikeringkan dimasukkan ke dalam desikator kemudian ditimbang. Pemanasan diulang sampai dicapai bobot konstan (W2). Sisa contoh dihitung sebagai total padatan dan air yang hilang sebagai kadar air. Г 2. Analisa kadar asam sianida (HCN) dengan metode kolorimetrik (APHA 1998) Sebanyak 10 g sampel tepung dimaserasi dengan akuades 100 ml selama 24 jam. Setelah itu disaring menggunakan kertas saring Whatman no 41. Hasil saringan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1300 rpm selama 6 menit. Sebanyak 25 ml cairan yang telah jernih diambil untuk dilakukan pegujian. Sampel ditambahkan dengan 2 ml bufer sianida dan 0.5 ml Chloramine T, kemudian dihomogenisasi. Selanjutnya ditambahkan piridin dan asam barbiturik sebanyak 1 ml. Sampel dihomogenisasi dan didiamkan selama beberapa menit sehingga terbentuk warna ungu yang menandakan adanya kandungan asam sianida dalam sampel. Setelah itu dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang λ 578 nm. Nilai yang diperoleh dimasukkan ke dalam persamaan linier dari kurva standar. Berikut adalah kurva standar asam sianida: Absorban 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Kurva standar uji kuantitatif HCN y = 5.692x - 0.008 R² = 0.995 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Konsentrasi (ppm) 3. Analisa derajat putih Analisa derajat putih tepung menggunakan alat Whiteness meter yang sudah dikalibrasi. Sebelum pengukuran, filter gelas dari wadah sampel dibersihkan dengan lap dan kuas pembersih. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam cawan. Cawan berisi sampel tersebut diletakkan di dalam wadah sampel. Suhu sampel diseimbangkan dengan meletakkan wadah sampel di atas tempat pengukuran. Saat alat menyala, LED akan menampilkan nilai derajat putih dan nomor urut pengukuran. Nilai derajat putih sampel diukur dengan membandingkan nilai derajat putih yang terbaca pada alat dengan nilai derajat putih barium sulfat sebagai standar yaitu sebesar 110.8.
17 Lampiran 6 Uji Homogenitas Data dengan Program SPSS 1. Data analisa kadar total asam (ml NaOH 0.1N/100 ml) Sumber JK db RJK p (Sig) Rata-rata 20463,360 1 20463,360 Perlakuan 1172,800 11 106,618 0,000 Galat 105,680 12 8,807 Total 21741,840 24 Nilai p value (sig) untuk pengaruh berbagai perlakuan terhadap kadar total asam cairan fermentasi adalah 0.000, p < 0.05 menyatakan bahwa perlakuan berpengaruh nyata terhadap kadar total asam. Nilai ini menyatakan bahwa data yang diperoleh tidak homogen. Uji lanjut Duncan kadar total asam Perlakuan Rata-rata Kode B.1 14.00 A F.1 21.10 B E.1 25.70 B C A.1 26.20 B C F.2 27.80 B C D.2 28.90 C D C.2 30.20 C D C.1 31.30 C D E.2 31.40 C D D.1 35.60 D E B.2 36.00 D E A.2 42.20 E Keterangan : Kode yang sama menunjukkan rata-rata tidak berbeda nyata Kode yang tidak sama menunjukkan rata-rata berbeda nyata 2. Data analisa kadar total gula (mg/ml) Sumber JK db RJK p (Sig) Rata-rata 594,863 1 594,863 Perlakuan 1191,559 11 108,324 0,000 Galat 17,244 12 1,437 Total 1803,667 24 Nilai p value (sig) untuk pengaruh berbagai perlakuan terhadap kadar total gula cairan fermentasi adalah 0.000, p < 0.05 menyatakan bahwa perlakuan berpengaruh nyata terhadap kadar total gula. Nilai ini menyatakan bahwa data yang diperoleh tidak homogen. Uji lanjut Duncan kadar total gula Perlakuan Rata-rata Kode C.1 1.50 A F.1 2.20 A D.2 2.02 A E.1 2.16 A B.1 2.35 A C.2 2.83 A E.2 2.86 A B.2 3.09 A
18 D.1 3.32 A B F.2 3.54 A B A.2 6.04 B A.1 28.05 C Keterangan : Kode yang sama menunjukkan rata-rata tidak berbeda nyata Kode yang tidak sama menunjukkan rata-rata berbeda nyata 3. Data analisa derajat putih tepung (%) Sumber JK db RJK p (Sig) Rata-rata 5,636 1 5,636 Perlakuan 0,588 11 0,05349 0,000 Galat 0,0001569 12 0,00001307 Total 6,224 24 Nilai p value (sig) untuk pengaruh berbagai perlakuan terhadap derajat putih tepung adalah sebesar 0.990, p > 0.05 berarti perlakuan yang berbeda tidak berpengaruh nyata terhadap nilai derajat putih. Hal ini menyatakan bahwa data yang diperoleh bersifat homogen. 4. Data analisa kadar asam sianida (HCN) (ppm) Sumber JK db RJK p (Sig) Rata-rata 178851,588 1 178851,588 Perlakuan 6,344 11 0,577 0,990 Galat 30,530 12 2,544 Total 178888,461 24 Nilai p value (sig) untuk pengaruh berbagai perlakuan terhadap kadar HCN adalah 0.000, p < 0.05 menyatakan bahwa perlakuan berpengaruh nyata terhadap kadar HCN. Nilai ini menyatakan bahwa data yang diperoleh tidak homogen. Uji lanjut Duncan kadar asam sianida (HCN) Perlakuan Rata-rata Kode E.1 0.20 A C.2 0.27 B B.2 0.37 C A.1 0.38 D D.1 0.40 E E.2 0.47 F F.2 0.53 G C.1 0.56 H D.2 0.57 H F.1 0.68 I A.2 0.68 I J B.1 0.69 J Keterangan : Kode yang sama menunjukkan rata-rata tidak berbeda nyata Kode yang tidak sama menunjukkan rata-rata berbeda nyata
19 5. Data analisa rendemen tepung (%) Sumber JK db RJK p (Sig) Rata-rata 4101867,094 1 4101867,094 Perlakuan 5024,371 11 456,761 0,671 Galat 14347,425 12 597,809 Total 4121238,890 24 Nilai p value (sig) untuk pengaruh berbagai perlakuan terhadap rendemen tepung adalah sebesar 0.671, p > 0.05 berarti perlakuan yang berbeda tidak berpengaruh nyata terhadap nilai rendemen tepung. Hal ini menyatakan bahwa data yang diperoleh bersifat homogen.