KEGIATAN BELAJAR 4 RANCANGAN VALIDASI METODE DAN KALIBRASI ALAT UKUR Capaian Pembelajaran Merancang Validasi Metoda Uji Dalam Analisis Kimia Sub Capaian Pembelajaran 1. melakukan validasi metode analisis dari metode rutin yang terdapat pada laboratorium; 2. merancang validasi metode uji yang baru dikembangkan (non-baku) Pokok-pokok materi 1. Rancangan yang perlu disiapkan dalam melakukan validasi metode(non-baku) 2. Pengolahan data pada parameter dalam melakukan validasi metode. URAIAN MATERI Pada kegiatan belajar 4 ini, Anda akan dihadapkan pada suatu kasus yang pada umumnya terdapat pada laboratorium pengujian dan kalibrasi, yaitu bagaimana melakukan validasi metode analisis terhadap metode yang digunakan secara rutin di laboratorium pengujian. Mengapa validasi metode perlu dilakukan karena Anda harus mengumpulkan parameter unjuk kerja (bukti-bukti) dari metode yang baru dikembangkan. Adapun parameter unjuk kerja yang perlu dikumpulkan adalah linieritas, sensitivitas, nilai batas deteksi dan batas kuantitasi, presisi, akurasi, selektivitas, kekuatan metode, ketahanan metode, dan ketidakpastian. Kesepuluh parameter tersebut perlu dikumpulkan untuk melihat unjuk kerja dari metode analisis apakah sudah sesuia dengan persyaratan yang ditetapkan. Laboratorium pengujian perlu melakukan dokumentasi untuk data-data tersebut. Anda akan dihadapkan pada praktek mengumpulkan bukti kinerja (parameter metode analisis) dari metode analisis yang digunakan berdasarkan data-data yang telah dilakukan. Masih ingatkan hal-hal yang membedakan validasi metode dan verifikasi metode pada kegiatan belajar 3. Bila Anda lupa silahkan buka kembali materi tersebut. A. Rancangan kegiatan pada validasi metode analisis rutin (non-baku) Suatu laboratorium sedang melakukan validasi metode analisis kandungan perak dari sampel yang berasal dari air kran pada buangan industri X dengan menggunakan alat
spektrofotometer nyala serapan atom. Pada Tabel 4.1 berikut ini adalah hasil data yang diperoleh dari setiap deret dari satu seri larutan standar perak beserta respon absorbannya. Tabel. 4.1 Data hasil analisis deret larutan standar perak Konsentrasi (ng/ml) 0 5 10 15 20 25 30 Absorban 0,003 0,127 0,251 0,390 0,498 0,625 0,763 Dari data tersebut, Anda akan mendapatkan parameter metode analisis yaitu linieritas, sensitivitas, LOD, LOQ. Adapun data hasil pengukuran sampelnya disajikan pada Tabel 4.2. Dari data tersebut, Anda aka mendapatkan parameter validasi berupa presisi analisis dari metode yang diujikan. Tabel 4.2 Data hasil pengukuran sampel Pengulangan ke 1 2 3 4 5 6 Absorban 0,308 0,314 0,312 0,347 0,315 0,316 konsentrasi sampel (ppm) 12,00 12,25 12,17 13,58 12,29 12,33 Pada Tabel 4.3 merupakan hasil pengukuran untuk penentuan akurasi metode analisis. Pengolahan data diperoleh dari pengukuran sampel dan sampel yang ditambahkan standar. Pada data ini hanya satu kosentrasi standar yang ditambahkan. Idealnya harus dibuat tiga variasi konsentrasi standar. Kemudian Anda hitung % recoverinya. Tabel 4.3 Data pengukuran sampel serta analit + standar 1 2 3 4 5 6 Pengulangan ke Absorban 0,308 0,314 0,312 0,347 0,315 0,316 analit + std 10 ppm 0,356 0,318 0,324 0,357 0,324 0,320 Pada Tabel 4.4 disajikan data hasil pengukuran sampel Ag dan sampel yang telah diberikan cemaran Hg untuk menentukan parameter selektivitas metode. Tabel 4.4 Data pengukuran selektivitas metode Konsentrasi analit 0,308 0,314 0,312 0,347 0,315 0,316 Analit + cemaran Hg 0,321 0,318 0,320 0,359 0,328 0,329
Pada Tabel 4.5 disajikan data hasil pengulangan pengukuran sampel yang dilakukan oleh 3 orang analis untuk pengujian ketangguhan metode analisis. Variabel yang diujikan tidak hanya oleh analis saja tetapi dapat saja oleh laboratorium yang berbeda yang sama memiliki sertifikat laboratorium terakreditasi misalnya KAN (Komite Akreditasi Nasional). Untuk laboratorium pengujian sertifikat laboratorium yang harus ada selain ISO 9000:2008 yang menjamin dokumen mutu laboratorium juga disarankan memiliki sertifikat ISO 17025 yang merupakan persyaratan yang harus dimiliki oleh suatu laboratorium pengujian. No. Tabel 4.5 Data hasil pengukuran sampel oleh 3 analis yang berbeda Konsentrasi analit Pengulangan 1 2 3 1 0,308 0,306 0,309 0,310 2 0,314 0,316 0,318 0,321 3 0,312 0,314 0,316 0,318 4 0,347 0,348 0,350 0,352 5 0,315 0,317 0,319 0,320 Sekali lagi, Anda ingat kembali bahwa validasi metode analisis adalah proses yang menunjukkan atau membuktikan karakteristik kinerja metode suatu analisis dapat diterima atau tidak sesuai dengan ketentuan yang dipersyaratkan. Lakukanlah pengujian untuk parameter karakteristik kinerja metode yaitu Linearitas, sensitivitas, LOD, LOQ, akurasi, presisi, selektivitas, dan ketangguhan metode B. PENENTUAN PARAMETER DALAM VALIDASI METODE ANALISIS Dari berbagai data pengukuran yang diperlukan untuk memvalidasi metode penentuan Ag dengan spektrofotometer nyala serapan atom dari sampel air kran pada buangan industri X pada bagian A, berikutnya Anda ditugaskan untuk mengumpulkan parameter dari metode analisis tersebut. Lakukan pengujian untuk parameter linearitas, sensitivitas, LOD, LOQ, akurasi, presisi, selektivitas, dan ketangguhan metode. 1. Linearitas dan sensitivitas
Untuk lebih memahami cara melakukan validasi ataupun verifikasi metode analisis Anda dapat mengunjungi link pada meteri berikut ini. Reference of Modul PPG Teknik kimia Referensi dapat Anda pelajari pada tulisan Riyanto dan Harmita. Berikut ini disajikan bagaimana cara mengolah data hasil pengukuran deret larutan standar dan nilai pengukuran absorbansi yang dihasilkan seperti ditunjukkan pada Tabel 4. Tabel 4.6 Data penentuan lineritas dan sensitivitas metode x y (x x ) (x i x ) (y y ) (y y ) (x x )(y i y ) 0 0.023-15 225-0.3594 0.1291 5.3914 5 0.127-10 100-0.2554 0.0652 2.5542 10 0.251-5 25-0.1314 0.0172 0.6571 15 0.39 0 0 0.0075 5.73 E-05 0 20 0.498 5 25 0.11557 0.0133 0.5778 25 0.625 10 100 0.2425 0.0588 2.4257 30 0.763 15 225 0.38057 0.1448 5.7085 Σx =105 Σy = 2.677 0 700 0 0.4287 17.315 x =15 y = 0.3824 Nilai koefisien korelasi (r) dari persamaan garis sebagai berikut. r = {( )( )} [ ( ) ] [ ( ) ]. (4.1) r =,, = 0,9994 pengujian untuk nilai korelasi pada tingkat konfidensi 95% dapat dilakukan dengan membuat asumsi dasar sebagai berikut. H0 : tidak ada korelasi yang signifikan dengan pengujian ; t =, =, t = 64,51
t tabel nya adalah 2,02 ( karena two tailed maka P = 0,05 x 2 maka P = 0,1 dengan db=5) t hitung > t tabel maka H0 ditolak Kesimpulan pengujian dari nilai r terdapat korelasi yang signifikan antara kosentrasi stadar dan nilai absorbasinya. Nilai slope/kemiringan kurva kalibrasi dapat dihitung dengan mengunakan rumus b = {( )( )} =, ( ).. (4.2) = 0,0247 Maka intersep persamaan garis dapat dicari dengan a = y - bx = 0,3824 0,0247 (15) = 0,0119 Maka persamaan garisnya adalah Y = 0,0247x + 0,0119 Anda dapat juga menggunakan software excel dan akan diperoleh persamaan regresi liniernya Y = 0,0247x + 0,0114 kurva persamaan regresi linier ditunjukkan pada Gambar 4.1. Sensitivitas metode analisis dapat terlihat dari kemiringan kurva (b = 0,247). Persamaan regresi linier yang dihasilkan memiliki sensitivitas yang kurang baik, karena persamaan garis nampak kurang tegak, sehingga perubahan konsentrasi yang besar tidak memberikan respon yang cukup besar terhadap perubahan tersebut. Grafik Konsentrasi Ag terhadap Absorbansi Absorban 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0; 0,023 5; 0,127 y = 0,0247x + 0,0114 R² = 0,9988 10; 0,251 15; 0,39 20; 0,498 25; 0,625 30; 0,763 0 5 10 15 20 25 30 35 Konsentrasi Ag Gambar 4.1 Grafik kurva kalibrasi larutan standar perak
Standar deviasi dari intersep dan slope Hitunglah nilai y teoritis, (ŷ) perhitungan standar deviasi slope dan intersep, Anda dapat dilihat pada Tabel 4.7 Tentukan terlebih dahulu standar deviasi residual ( Sy/x) atau standar deviasi dari persamaan regresi linier dengan menggunakan rumus berikut ini Sy/x = ( ŷ) (4.3) =, = 0,009997 Standar deviasi dari slope adalah / Sb = [ ( ) =, = 0,000378 nilai t untuk (n-2) = 5 (db) pada tingkat konfidensi 95% (P=0,05) adalah 2,57 maka nilai b = 0,0247 ±(2,02 x 0,00378) = 0,0247 ± 0, 00076.(4.4) Maka interval nilai kepercayaan slope pada tingkat konfidensi 95% adalah 0,02546-0,02424 Standar deviasi intersep dapat dihitung menggunakan persamaan berikut ini. Sa = s / ( )..(4.5) maka nilai a = 0,0119 ±(2,02 x 0,00681) = 0,0119 ± 0,01375 = 0,009997 = 0,00681
Tabel 4.7 Data perhitungan standar deviasi slope dan intersep x y ŷ (y ŷ) (y ŷ) (x i x ) Σx 0 0.023 5 0.127 10 0.251 15 0.39 20 0.498 25 0.625 30 0.763 Σx =105 Σy = 2.677 x =15 y = 0.3824 0.0114 0.0116 0,000134 225 0 0.1349-0.0079 6,24 x 10-5 100 25 0.2584-0.0074 5,47 x 10-5 25 100 0.3819 0.0081 6,56 x 10-5 0 225 0.5054-0.0074 5,74 x 10-5 25 400 0.6289-0.0039 1,52 x 10-5 100 625 0.7524 0.0106 0,00011 225 900 0,000499 700 2275 2. LOD dan LOQ Penentuan nilai LOD dan LOQ dari metode analisis yang divalidasi dapat dihitung dengan mengguakan metode ketiga melalui persamaan regresi linier seperti yang telah dikerjakan pada penentuan parameter linearitas. Maka nilai LOD dan LOQ dapat ditentukan sebagai berikut: LOD = / =,, = 1.2124 ng/ml LOQ = /, = = 4.0414 ng/ml, Nilai LOD menunjukkan batas terkecil dari konsentrasi analit yang masih dapat ditentukan dengan metode analisis tersebut. Sedangkan LOQ adalah batas terkecil konsentrasi analit yang masih dapat ditentukan dengan akurasi yang bisa diterima. 3. Presisi Metode Analisis Nilai presisi metode analis ditntukan dengan menghitung nilai RSD sebagaimana telah dijelaskan pada kegiatan belajar 1. Sebetulnya terdapat nilai kriteria presisi yang berbeda untuk setiap nilai konsentrasi analit yang diukur. Nilai konsentrasi analit yang diukur semakin kecil maka nilai RSD semakin besar. Silahkan Anda kunjungi link berikut untuk melihat kriteria
tersebut.reference of Modul PPG Teknik kimia\harnita.pdfreference of Modul PPG Teknik kimia\2. Buku Validasi Metode ok.pdf. Data penentuan presisi metode analisis disajikan pada Tabel 4.8 Tabel 4.8 Data pengolahan Presisi metode Pengulangan Absorbansi konsentrasi analit (yi- y ) (yi- y ) 2 1 0,308 12,00-0,436 0,190096 2 0,314 12,25-0,186 0,034596 3 0,312 12,17-0,266 0,070756 4 0,315 12,29-0,146 0,021316 5 0,315 12,29-0,146 0,021316 6 0,316 12,33-0,106 0,011236 Σy = 74,62 0,98612 y = 12,436 s = 0,4440 s = ( ) =, = 0,4440 RSD =,, x100% = 3,57% Nilai RSD yang diperoleh sangat bergantung pada nilai konsentrasi analit, semakin kecil konsentrasi maka nilai RSD semakin besar. Coba Anda perhatikan terompet Horwizt. 4. Akurasi Metode Analisis Pengolahan data akurasi metode analisis disajikan pada Tabel 4.9 adapun konsentrasi standar yang ditambahkan adalah 10 ppm. Untuk mendapatkan perolehan kembali yang baik, perlu dilakukan penambahan zat standar pada sampel dengan minimal 3 variasi konsentrasi misalnya 10, 15 dan 25 ppm. Pada rancangan validasi metode kali ini hanya satu variasi konsetrasi sebagai latihan saja.
Pengulangan Analit Tabel 4.9 Pengolahan data penentuan akurasi metode Absorban Analit+standar selisih % recovery 100 - % recovery 1 0,308 0,356 0,0048 0,48 99,52 2 0,314 0,318 0,0004 0,04 99,56 3 0,312 0,324 0,0012 0,12 99,88 4 0,347 0,357 0,0010 0,10 99,90 5 0,315 0.324 0,0009 0,09 99,91 6 0,316 0,320 0,0004 0,04 99,96 Nilai perolehan kembali dapat dihitung sebagai berikut: % perolehan kembali = ( ) x 100 = (,, ) = 0,48% Perolehan kembali = 100 %- 0,48% = 99,52% x 100 5. Selektivitas Metode Selektivitas metode dilakukan dengan menambahkan zat pengganggu (cemaran) pada sampel yang diukur. Pemilihan zat penggangu biasanya berasal dari satu golongan pengelompokkan kation atau anion. Pada Tabel 4.10 disajikan data pengolahan selektivitas metode.
Tabel 4.10 Pengolahan data selektivitas metode Pengulangan Absorbansi Analit Analit+ cemaran di (di- ԁ ) (di ԁ ) 1 0,308 0,321-0,013-0,0025 6,25 x 10-6 2 0,314 0,318-0,004 0,0065 4,225 x 10-5 3 0,312 0,320-0,008 0,0025 6,25 x 10-6 4 0,347 0,359-0,012-0,0015 2,25 x 10-6 5 0,315 0,328-0,013-0,0025 6,25 x 10-6 6 0,316 0,329-0,013-0,0025 6,25 x 10-6 Σx -0,063 6,95 x 10-5 rerata -0,0105 1,158 x 10-5 Pengujian yang dilakukan adalah tidak ada perbedaan pada analisis yang ditambahkan cemaran dengan analit yang tidak ditambahkan. Secara pengujian statistik dapat ditulis sebagai berikut. H0 : µd = 0 H1: µd 0 s = ( ԁ ) = 0,00372827 t hitung dapat dicari dengan menggunakan persamaan 2.13 pada kegiatan belajar 1 t = ԁ n/s =,, = -6,899 t tabel (P=0,05) adalah 2,57 t hitung < t tabel maka H0 diterima Kesimpulannya tidak ada perbedaan konsentrasi yang signifikan antara konsentrasi sapel yang ditambahkan Hg dan yang tanpa cemaran Hg. Sehingga selektivitas metode dikatakan baik. 6. Uji Ketangguhan metode (ruggedness) Uji ini dilakukan sebagai uji pembanding terhadap metode yang lainnya. Data pengolahan ketangguhan metode dapat Anda lihat pada Tabel 4.11
Tabel 4.11 Data pengolahan penentuan ketangguhan metode No. Ti = Σxi Ti 2 x = Ti/n Σ(xi- x ) 2 1 0,925 0,855625 0,3083 8,67 x 10-6 2 0,955 0,912025 0,3183 1,27 x 10-5 3 0,945 0,898704 0,3160 8 x 10-6 4 1,05 1,1025 0,3500 8 x 10-6 5 0,956 0,913936 0,3187 4,67 x 10-6 4,834 4,68279 1,6113 4,2 x 10-5 Asumsi dasar yang diajukan adalah tidak ada perbedaan rerata yang signifikan dari pengujian yang dilakukan oleh ketiga analis. Asumsi dasar tersebut dapat diformulasi dalam pengujian statistik sebagai berikut: H0 ; σ1 = σ2 = σ3 Pada Tabel 4.12 berikut ini adalah data pengolahan penentuan nilai F hitung yang melibatkan dua sumber keragaman yaitu antar sampel dan di dalam sampel. Tabel 4.12 Perhitungan F tabel Sumber keragaman Jumlah kuadrat(ss) derajat bebas kuadrat rerata (MS) Antar-sampel Σ Ti 2 /n Ti 2 /n (4,68279/3)-(4,834 2 /15) = 0,003093 h-1 = 5-1 = 4 0,003093 4 = 0,00077323 dalam-sampel 4,2 x 10-5 h(n-1) =5(3-1) =10 4,2 x 10 10 = 4,2 x 10-6 jumlah 0,003135 N-1 15-1 14 F hitung =,, = 184,1082
F tabel (4,10) = 4,468 F hitung > F Tabel, H0 ditolak Kesimpulan terdapat perbedaan yang signifikan di antara ketiga analis sehingga ketegaran metode kurang teruji.