BAB III METODE PENELITIAN 2.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU pada bulan Februari 2012 April 2012. 2.2 Alat dan Bahan 2.2.1 Alat-alat Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas, spektrofotometer Uv-Vis (UV-1800, Shimadzu UV Spectrophotometer) dan neraca analitik (Boeco Germany). 2.2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah Asam Klorida (HCl) 37 % (E. Merck), akuades (E. Merck); Clopidogrel baku (BPFI) dan tablet clopidogrel generik: Dexa Medica dan Soho serta tablet clopidogrel dengan nama dagang Plavix (Sanofi Aventis) dan CPG (Kalbe Farma). 2.3 Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara satu sampel dengan yang lain, karena sampel dianggap homogen. 2.4 Pembuatan Pereaksi 2.4.1 Pembuatan Asam Klorida 0,1 N Diambil 8,5 ml HCl 37 % dan dipindahkan pelan-pelan ke dalam beaker glass yang berisi 500 ml akuades. Kemudian, diaduk dengan batang pengaduk
agar cairan bercampur sempurna dan dicukupkan larutan dengan akuades sampai 1 liter (Ditjen POM, 1995). 2.5 Prosedur Penelitian 2.5.1 Pembuatan larutan Induk Baku Clopidogrel BPFI Sejumlah lebih kurang 25 mg clopidogrel BPFI ditimbang seksama, dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan asam klorida 0,1 N lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan asam klorida 0,1 N dan dikocok homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcg/ml, larutan ini disebut larutan induk baku (LIB I). 2.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Dipipet 5 ml dari larutan induk baku II (LIB II) (500 mcg/ml) dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml dan diencerkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda lalu dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 250 mcg/ml (A= 0,421). Kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Hasil dapat dilihat pada halaman 20. 2.5.3 Penentuan Kurva Kalibrasi Diambil LIB II (500 mcg/ml) dengan menggunakan buret sebanyak 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, dan 7 ml dan masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, tambahkan HCl 0,1 N sampai garis tanda dan dikocok sampai homogen. Diperoleh larutan dengan konsentrasi 150; 200; 250; 300; 350 mcg/ml. Kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh dan sebagai blanko digunakan HCl 0,1 N. Hasil dapat dilihat pada halaman 21-22.
2.5.4 Penentuan Kadar Clopidogrel Tablet Ditimbang dan diserbukkan 20 tablet, lalu ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan 75 mg clopidogrel, dimasukkan dalam labu tentukur 25 ml. Kemudian disaring, 5 ml filtrat dibuang. Dipipet 6 ml filtrat, dimasukkan dalam labu tentukur 25 ml dicukupkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda dan dikocok homogen. Kemudian dipipet lagi 3,5 ml dari larutan dan dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml dicukupkan dengan HCl 0,1 N sampai garis tanda dan dikocok homogen. Diukur serapannya pada panjang gelombang 270,5 nm. Dilakukan perlakuan yang sama seperti diatas dengan pengulangan sebanyak 6 kali penimbangan sampel untuk masing-masing sediaan tablet. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 8, halaman 43. 2.5.5 Uji Validasi dengan Parameter Akurasi, Presisi, Batas Deteksi, dan Batas kuantitasi 2.5.5.1 Uji Akurasi dengan Persen Perolehan Kembali (% Recovery) Ditimbang 20 tablet clopidogrel yang mengandung kadar zat berkhasiat 75 mg/tablet kemudian ditentukan pada rentang spesifik 80%, 100%, 120%. Ditimbang serbuk yang mengandung 70% analit dari kadar zat berkhasiat, lalu dilakukan prosedur yang sama seperti diatas pada penetapan kadar sampel. Ditimbang lagi serbuk yang mengandung 70% analit dari kadar zat berkhasiat dan 30% bahan baku, lalu dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Dilakukan 3 kali replikasi untuk masing-masing rentang spesifik tersebut. Contoh perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 9, halaman 44. Menurut Harmita (2004), persen perolehan kembali (% Recovery) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan: % Recovery = A B x 100 % CC A = Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan baku B = Konsentrasi sampel sebelum penambahan baku C = Konsentrasi baku yang ditambahkan Hasil dapat dilihat pada Tabel 4, halaman 23 dan pada Lampiran 10, halaman 46. 2.5.5.2 Uji Presisi Uji presisi (keseksamaan) ditentukan dengan parameter RSD (Relative Standard Deviasi) dengan rumus (WHO, 1992): Keterangan: RRRRRR = SD X x 100 % RSD = Relatif Standard Deviasi SD = Standard Deviasi XX = Kadar Rata-rata Clopidogrel dalam Sampel 2.5.5.3 Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Untuk menentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dapat (Y Yi )2 digunakan rumus: Sy/x = nn 2 LOQ = 10 x Sy/x Slope Keterangan: Sy/x = Simpangan Baku Residual LOD = Batas Deteksi LOQ = Batas Kuantitasi Slope = Derajat Kemiringan LOD = 3 x Sy/x Slope Hasil dapat dilihat pada Lampiran 11, halaman 47.
2.5.5.4 Analisis Data Secara Statistik Untuk menghitung Standar Deviasi (SD) digunakan rumus: (Xi X)2 SSSS = nn 1 Untuk mengetahui apakah data diterima atau ditolak digunakan rumus seperti dibawah ini: t = X X SD/ n Dasar penolakan data, jika t hitung t tabel dan bila t hitung mempunyai nilai negatif, ditolak jika t hitung - t tabel. Untuk mencari kadar sebenarnya dengan taraf kepercayaan 99 persen dengan derajat kebebasan dk = n-1, digunakan rumus: µ = X ± t (1-1/2 α); dk x SD/ n Keterangan: µ = Interval kepercayaan XX = Kadar Rata-rata sampel X = Kadar Sampel t = Harga t tabel sesuai dengan dk = n-1 α = Tingkat Kepercayaan dk = Derajat Kebebasan SD = Standar Deviasi n = Jumlah Pengulangan Hasil dapat dilihat lampiran 4 sampai Lampiran 8 pada halaman 35-43.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Clopidogrel BPFI Sebelum dilakukan penetapan kadar dengan menggunakan metode spektrofotometri terlebih dahulu dilakukan penentuan panjang gelombang maksimum, meskipun panjang gelombang tersebut sudah diketahui dalam literatur. Hal ini dikarenakan panjang gelombang suatu senyawa dapat berbeda bila ditentukan pada kondisi dan alat yang berbeda. Penentuan panjang gelombang ini dilakukan pada konsentrasi yang memberikan serapan dengan kesalahan fotometrik terkecil (± 0,4343). Untuk mendapatkan konsentrasi tersebut dapat dihitung menggunakan nilai absorptivitas molar (ε) ataupun absorptivitas spesifik dari literatur. Namun, karena tidak adanya nilai absorptivitas molar dari clopidogrel maka untuk mendapatkan konsentrasi yang memberikan kesalahan fotometrik terkecil dilakukan orientasi sehingga diperoleh kurva serapan dan data absorbansi seperti terlihat pada Gambar 1 dan Tabel 1 di bawah ini: Gambar 1. Kurva serapan Clopidogrel Baku Pembanding Farmakope Indonesia (Konsentrasi 250 mcg/ml) dalam pelarut HCl 0,1 N
Tabel 1. Data Absorbansi dari Kurva Serapan Maksimum No. Panjang Gelombang Absorbansi 1 277,50 0,365 2 270,50 0,421 Dari Gambar 1, dapat dilihat bahwa kurva serapan clopidogrel BPFI (konsentrasi 250 mcg/ml) dalam pelarut HCl 0,1 N menghasilkan 2 puncak dengan panjang gelombang pertama yaitu 277,5 nm (A= 0,365) dan panjang gelombang yang kedua yaitu 270,5 nm (A= 0,421) (dapat dilihat pada Tabel 1). Menurut Satiadarma (2004), penentuan kadar dilakukan dengan mengukur serapan pada panjang gelombang maksimum (puncak kurva), agar dapat memberikan serapan tertinggi untuk setiap konsentrasi. Bila suatu senyawa mempunyai lebih dari satu puncak absorpsi maksimum, lebih diutamakan panjang gelombang absorpsi maksimum yang absorptivitasnya terbesar dan memberikan kurva kalibrasi linier dalam rentang konsentrasi yang relatif lebar. Dari ke-2 puncak kurva tersebut, yang memberikan absorbansi terbesar yaitu pada panjang gelombang 270,5 nm, sedangkan pada panjang gelombang 277,5 nm memberikan absorbansi yang lebih kecil. Berdasarkan hal tersebut diatas, maka penetapan kadar clopidogrel dilakukan pada panjang gelombang 270,5 nm karena memberikan kesalahan fotometrik yang mendekati 0,4343. Selanjutnya, untuk penetapan kadar clopidogrel dalam sediaan tablet yang beredar dipasaran dilakukan pada panjang gelombang maksimum clopidogrel BPFI yang sudah diperoleh yaitu pada panjang gelombang 270,5 nm. 3.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Penentuan linieritas kurva kalibrasi clopidogrel BPFI dalam pelarut asam klorida 0,1 N dengan konsentrasi 150; 200; 250; 300; 350 mcg/ml pada panjang
gelombang maksimum 270,5 nm dengan menggunakan pelarut HCl 0,1 N sebagai blangko dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 2 berikut ini: Tabel 2. Data Kurva Kalibrasi dari Clopidogrel BPFI No Sampel Konsentrasi Absorbansi 1 1 0,000 0,000 2 2 150,000 0,257 3 3 200,000 0,346 4 4 250,000 0,422 5 5 300,000 0,512 6 6 350,000 0,603 Gambar 2. Kurva Kalibrasi Clopidogrel BPFI dalam pelarut HCl 0,1 N pada panjang gelombang 270,5 nm. Pada Tabel 2, pembuatan kurva kalibrasi clopidogrel BPFI dilakukan pada 5 konsentrasi yang menghasilkan absorbansi pada rentang 0,2-0,6. Kemudian, dilakukan plot terhadap konsentrasi dan absorbansi tersebut. Hasilnya menunjukkan bahwa adanya hubungan yang linier antara konsentrasi dan serapan dengan koefisien korelasi (r) = 0,9996 dan persamaan garis regresi Y = 0,001713 x - 0,000174 (dapat dilihat pada Gambar 2). Kriteria penerimaan untuk korelasi adalah r 0,995 (Moffat, 2004).
3.3 Penentuan Kadar Clopidogrel dalam Sediaan Tablet Hasil penentuan kadar clopidogrel dalam sediaan tablet dapat dilihat pada Tabel 3 dibawah ini: Tabel 3. Kadar Rata-Rata Clopidogrel pada Sediaan Tablet No Nama Sediaan Kadar rata-rata (%) Kadar sebenarnya (%) 1 Clopidogrel Generik Dexa 100,46 100,62 ± 0,262 2 Clopidogrel Generik Soho 100,33 100,33 ± 0,870 3 Plavix 100,37 100,37 ± 0,913 4 CPG 100,20 100,20 ± 0,445 Dari Tabel diatas menunjukkan bahwa kadar clopidogrel dalam sediaan tablet generik dan nama dagang yang diperiksa memenuhi persyaratan seperti yang tertera dalam United State Pharmacopeia (USP) edisi ke-34 tahun 2011 yaitu tidak kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 110,0 % dari jumlah yang tertera pada etiket. 3.4 Uji Validasi Metode Spektrofotometri Ultraviolet Pada penelitian ini dilakukan uji validasi dengan metode penambahan bahan baku (standard addition method) terhadap sampel tablet clopidogrel ( Tabel 4) yang meliputi uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali (% recovery), uji presisi dengan parameter RSD (Relatif Standar Deviasi), batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) (WHO, 1992). Uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali dilakukan dengan membuat konsentrasi analit dengan rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%, masing-masing dengan 3 replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70% analit dan 30% baku pembanding. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 10, halaman 46.
Tabel 4. Data Persen Perolehan Kembali Clopidogrel dengan Metode Penambahan Bahan Baku (Standard Addition Method) Rentang Spesifik (%) 80 Persen Perolehan Kembali (%) 94,13 94,09 94,46 100 95,95 95,92 95,32 120 98,84 98,95 98,81 Rata-rata (% recovery) 96,27 Standar Deviasi (SD) 0,127 Relatif Standar Deviasi(RSD) (%) 0,13 Berdasarkan Tabel diatas, persen perolehan kembali (% recovery) rata-rata 96,27%, standar deviasi (SD) sebesar 0,127. Persen perolehan kembali ini tidak dapat diterima karena tidak memenuhi syarat akurasi dimana rentang rata-rata hasil persen perolehan kembali adalah 98-102% (Harmita, 2004). Hal ini disebabkan karena pada rentang spesifik 80% dan 100% diperoleh persen perolehan kembali yang lebih kecil dari syarat yang diizinkan, sedangkan pada rentang spesifik 120% diperoleh persen perolehan kembali yang memenuhi persyaratan. Oleh sebab itu, metode spektrofotometri ultraviolet yang diterapkan pada penetapan kadar clopidogrel dalam sediaan tablet mempunyai akurasi yang kurang baik. Sedangkan dari hasil uji presisi dengan parameter relatif standar deviasi (RSD) adalah 0,13%. Nilai RSD yang diizinkan adalah 2 % (Harmita, 2004). Maka dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan mempunyai akurasi yang kurang baik dan presisi yang baik (WHO, 1992). Batas deteksi (LOD) yang diperoleh dari penelitian ini adalah 7,094 mcg/ml dan batas kuantitasinya (LOQ) adalah 23,350 mcg/ml.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 4.1 Kesimpulan 1. Metode spektrofotometri ultraviolet dapat diterapkan untuk penetapan kadar clopidogrel dalam sedian tablet, namun tidak memenuhi syarat validasi (akurasi). 2. Semua tablet yang diperiksa memenuhi persyaratan sesuai dengan yang tertera pada United State Pharmacopeia (USP) edisi ke-34 tahun 2011 yaitu tidak kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 110,0 %. 4.2 Saran Disarankan kepada peneliti selanjutnya agar dapat menetukan kadar clopidogrel dalam sediaan tablet dengan metode spektrofotometri sinar tampak ataupun metode volumetri.